Regulacja transkrypcji genów eukariotycznych

Transkrypt

1 Regulacja transkrypcji genów eukariotycznych

2 Klasyczne wyobrażenie genu fragment DNA, który koduje mrna

3 Definicja genu - klasyczna GEN- podstawowa jednostka dziedziczenia Region DNA, który określa charakterystyczną dziedziczoną cechę organizmu; zwykle koduje pojedyncze białko lub RNA. Zawiera całą funkcjonalną podjednostkę wraz z sekwencją kodującą, niekodującymi sekwencjami regulatorowymi DNA oraz z intronami. Molecular Biology of the Cell Forth Edition

4 Współczesne definicje odnoszą się do produktu, jakim jest funkcjonalny transkrypt i nie biorą pod uwagę białka Jak zawsze w biologii, istnieją wyjątki. Trans-splicing: Istnieją geny w kawałkach. Transkrypt pochodzący z jednego fragmentu jest łączony z transkryptem z innego fragmentu, aby mógł powstać funkcjonalny RNA. Geny nakładające się: Niektóre geny nakładają się. Oznacza to, że pojedynczy fragment DNA może być częścią dwóch lub nawet trzech genów. Redagowanie RNA: Niekiedy pierwotny transkrypt ulega intensywnemu redagowaniu zanim stanie się transkryptem funkcjonalnym. W najbardziej skrajnych przypadkach dochodzi do wstawiania lub usuwania nukleotydów. Oznacza to, że zawartość informacyjna genu jest niepełna dla zapewnienia jego funkcjonalności i musi być uzupełniona z udziałem innych genów

5 Geny eukariotyczne Proces ekspresji genu składa się z wielu etapów Na każdym z etapów możliwe działanie regulacyjne Procesy transkrypcji i translacji są rozdzielone w przestrzeni i czasie Informacja kierująca syntezą białka może być modyfikowana po transkrypcji (alternatywne składanie, redagowanie) złożoność proteomu przekracza złożoność genomu

6 Etapy ekspresji/poziomy regulacji struktura chromatyny transkrypcja obróbka i kontrola jakości RNA transport RNA degradacja RNA translacja modyfikacje post-translacyjne degradacja białka

7 Transkrypcja Kluczowym etapem regulacyjnym większości genów jest transkrypcja Regulacja z reguły na poziomie inicjacji transkrypcji Czynniki cis sekwencje regulatorowe w obrębie promotorów i enhancerów (wzmacniaczy) Czynniki trans białka wiążące się z sekwencjami regulatorowymi (elementami cis)

8 Czynniki cis Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc.

9 Czynniki trans Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc.

10 Rozmieszczenie sekwencji regulatorowych Ekson - odcinek genu, który koduje sekwencje aminokwasów w białku Intron - niekodujący odcinek genu, rozdziela eksony UAS ang. upstream activating sequence

11 Podstawowe elementy cis Promotor rdzeniowy (podstawowy) wiąże ogólne czynniki transkrypcyjne Elementy bliskiego promotora (proksymalnego) wiążą czynniki wspólne dla wielu różnych promotorów, które zapewniają podstawowy poziom transkrypcji element CAAT czynniki NF-1 i NF-Y element GC czynnik Sp1 oktamer czynnik Oct1

12 3 (+1) główne polimerazy RNA Eukaryota polimeraza produkty wrażliwość na α-amanitynę Polimeraza I Polimeraza II Polimeraza III geny rrna (18S; 28S; 5,8S) hn/mrna, większość snrna (U1, U2, U4, U5), mirna małe RNA: trna, snorna, 5S rrna, U6 snrna nie wrażliwa bardzo wrażliwa umiarkowanie wrażliwa Polimeraza mitochondrialna

13 Skład podjednostkowy 3 głównych polimeraz RNA Eukaryota Polimeraza RNA E.coli Eukariotyczne polimerazy RNA Podjednostki typu β i β Podjednostki typu α Podjednostki wspólne Podjednostki specyficzne dla danej polimerazy CTD- C końcowa domena Pol II, o krytycznym znaczeniu dla transkrypcji

14 Polimeraza II Polimeraza II RNA rozplata nici DNA, syntetyzuje RNA i łączy ponownie obie nici DNA. Samodzielnie nie jest w stanie rozpoznać promotora genu i zainicjować transkrypcji. Do tego celu niezbędna jest obecność OGÓLNYCH CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc. U prokariontów geny są najczęściej ciągłe, tj. kolinearne z ich mrna. U wyższych eukariontów geny są nieciągłe, tj. niekolinearne z ich mrna. Części genu ulegające ekspresji noszą nazwę eksonów, zaś sekwencje przedzielające eksony intronów.

15 Inicjacja transkrypcji Ogólne czynniki transkrypcyjne (podstawowe) wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w rdzeniowej części promotora GTF ang. general transcription factor TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH

16

17

18 Promotor podstawowy BRE - TFIIB recognition element INR initiator motif DPE downstream promoter element

19 Pierwszy etap inicjacji transkrypcji przyłączenie ogólnego czynnika transkrypcyjnego TFIID TATA binding protein (TBP) w kompleksie z DNA w rejonie TATA-box TBP- składnik ogólnego czynnika transkrypcyjnego TFIID Molecular Biology of the Cell Forth Edition

20 Sekwencyjny model składania Kompleksu Preinicjacyjnego (PIC preinitiation complex) Aktywność transkrypcyjna na poziomie podstawowym, jeszcze nie regulatorowym TBP polimeraza II helicase TAFs TATA } TFIID IIA IIF Pol IIa IIH Inr IIB IIE CTD protein kinase IIE IIF IIB IIA Pol IIa TATA Inr IIH Kompleks preinicjacyjny ATP - hydroliza IIB IIA TATA IIE IIF Pol IIa Inr IIH Kompleks inicjacyjny, DNA na I nukl. stopiony TFII A, B, D, E, H, F Ogólne Czynniki Transkrypcyjne (GTF) Czynniki TAF składowe TFIID (ang. TBP Associated Factors) TATA TATA box sekwencja TATAAA rozpoznawana przez białko TBP Inr sekwencja inicjatorowa rozpoznawana przez białka TAF Polimeryzacja pierwszych kilku nukleozydotrifosforanów i fosforylacja CTD prowadzą do uwolnienia promotora.

21 Transkrypcja

22 Regulacja inicjacji transkrypcji - czynniki transkrypcyjne i koaktywatory Podstawowe wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora Specyficzne (tkankowo, w odpowiedzi na sygnały regulacyjne, w rozwoju), wiązanie w dystalnej części promotora i w enhancerach

23 Specyficzne elementy cis promotorów i enhancerów Moduł - sekwencja regulatorowa Moduły odpowiedzi na sygnał np. moduł CRE odpowiedź na camp (czynnik transkrypcyjny CREB) Moduły specyficzne dla komórek i tkanek np. moduł mioblastowy rozpoznawany przez czynnik MyoD; moduł limfoblastoidalny czynnik NF-κB Moduły rozwojowe np. moduły Bicoid i Antennapedia D. melanogaster

24 Modularna organizacja elementów cis W sekwencjach regulatorowych występują różne kombinacje elementów cis wiążących różne czynniki trans, co daje bardzo wiele możliwości regulacji przy udziale stosunkowo niewielkiej liczby regulatorów kombinatoryka Promotor ludzkiego genu insuliny

25 Modularna organizacja elementów cis Yuh et al. (1998) Science 279, Endo16 regulatory system of the sea urchin.

26 Alternatywny start transkrypcji Wiele genów wyższych eukariontów posiada wiele alternatywnych miejsc startu transkrypcji (promotorów), specyficznych tkankowo Dzięki temu z jednego genu powstają różne transkrypty i białka w różnych komórkach i tkankach kora mięśnie móżdżek siatkówka kom. Schwanna pozostałe tkanki Gen dystrofiny człowieka

27 Sekwencje wzmacniające i wyciszające Enhancery i Silencery Enhancery stsymulują transkrypcję, silencery hamują transkrypcję. Jedne i drugie działają niezależnie od orientacji, tj. odwrócenie ich sekwencji nie wpływa na efekt. Jedne i drugie działają niezależnie od miejsca położenia w genomie. Mogą działać na odległość w stosunku do promotora Enhancery wykrywa się nieomal wszędzie Jedne i drugie stanowią miejsce wiązania dla specyficznych czynników transkrypcyjnych.

28 Specyficzne czynniki transkrypcyjne

29 Struktura domenowa aktywatorów transkrypcji domena wiążąca DNA domena odpowiedzialna za dimeryzację domena aktywująca domena regulatorowa Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc.

30 Domeny obecne w czynnikach transkrypcyjnych Palce cynkowe Helisa-skręt-helisa (H-T-H) np. homeodomena, domena HMG, domena PAU Suwak leucynowy Helisa-pętla-helisa (H-L-H) i wiele innych

31 Domeny wiążące DNA Palec cynkowy Homeodomena zawiera domenę HTH (helisa-skręt-helisa) atlasgeneticsoncology.org/deep/images/tffig2.jpg Czynnik transkrypcyjny SP1

32 Dimeryzacja czynników transkrypcyjnych Suwak leucynowy Np. protoonkogeny rodziny c-fos i c-jun Rodzina CREB (camp response element binding protein)

33 Represory Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc.

34 Regulacja inicjacji transkrypcji Czynniki transkrypcyjne i koaktywatory Podstawowe wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora Specyficzne (tkankowo, w odpowiedzi na sygnały regulacyjne, w rozwoju), wiązanie w dystalnej części promotora i w enhancerach Koaktywatory uczestniczą w aktywacji transkrypcji, ale nie wiążą się z DNA. Działają przez oddziaływania z białkami kompleksu transkrypcyjnego Kompleks mediatora jest ogólnym koaktywatorem polimerazy II

35 Mediator kompleks białkowy Kornberg R D PNAS 2007;104: by National Academy of Sciences

36 Polimeraza II RNA wraz z Mediatorem niezbędny do regulowanej transkrypcji absolutnie wymagany do transkrypcji większości genów eukariotycznych oddziałuje bezpośrednio z aktywatorami transkrypcji i polimerazą II RNA ważny zarówno dla pozytywnej jak i negatywnej regulacji transkrypcji Kornberg R D PNAS 2007;104: by National Academy of Sciences

37 Elongacja transkrypcji genów eukariotycznych jest ściśle związana z obróbką RNA Molecular Biology of the Cell Forth Edition

38 Domena CTD polimerazy II RNA Nature 430, (8 July 2004) Domena CTD zawiera powtarzającą się sekwencję aminokwasową (YSPTSPS)

39 Domena CTD polimerazy II RNA koordynuje wydarzenia transkrypcyjne Hiperfosforylacja domeny CTD determinuje nowy zestaw regulatorów przyłączających się do pol II RNA i zaznacza kolejne etapy transkrypcji. RNA Biology, 2012, Volume 9, Issue 9, Pages

40 Terminacja i poliadenylacja CPSF- kompleks białkowy, czynnik specyficzności cięcia i poliadenylacji

41 Terminacja i poliadenylacja

42 Poliadenylacja Kontroluje (zwiększa) stabilność mrna Dotyczy większości mrna, wyjątkiem są mrna kodujące histony u zwierząt Pełni funkcję w procesie translacji

43 Chromatyna - ważny element regulacji transkrypcji genów eukariotycznych

44 Transkrypcja genów eukariotycznych zachodzi w chromatynie Kornberg R D PNAS 2007;104: by National Academy of Sciences

45 KOLEJNE STOPNIE KONDENSACJI CHROMATYNY l

46 Dwa podstawowe stany chromatyny Heterochromatyna konstytutywna jest obecna stale w komórce, DNA wchodzący w jej skład nie zawiera genów, dzięki czemu zachowuje zwartą strukturę (obszary centromerów i telomerów) fakultatywna ta forma chromatyny pojawia się w jądrze okresowo i tylko w niektórych komórkach, prawdopodobnie zawiera geny nieaktywne w czasie niektórych faz cyklu komórkowego, Euchromatyna to luźno upakowana forma chromatyny, zawierająca geny aktywne transkrypcyjnie

47 Domeny funkcjonalne i izolatory Izolatory oddzielają domeny funkcjonalne w chromatynie Białka wiążące się z izolatorami uniemożliwiają interferencję regulatorów z sąsiedniej domeny (innych genów) Izolator Izolator

48 Obszary kontrolujące loci LCR (locus control regions) utrzymują domeny funkcjonalne otwarte, czyli aktywne transkrypcyjnie

49 Chromatyna preparaty mikroskopowe

50 Struktura chromatyny DNA + związane białka 1. Histony (małe, zasadowe białka) 2. Niehistonowe białka regulatorowe We wszystkich stanach chromatyny białka są związane z DNA, a różnice strukturalne wynikają z różnego stopnia upakowania chromatyny

51 PODSTAWOWE BIAŁKA BUDUJĄCE CHROMATYNĘ TO HISTONY najbardziej konserwowane ewolucyjnie białka u Eucariota Histony H3 i H4 : bogate w argininy, najbardziej konserwowane ewolucyjnie sekwencje białkowe Histony H2A i H2B : wzbogacone w lizyny, sekwencje konserwowane ewolucyjnie Histon H1 : bardzo bogaty w lizyny, sekwencja białkowa słabiej konserwowana ewolucyjnie, związany z nukleosomem poza jego rdzeniem

52 Struktura Krystaliczna Nukleosomu Luger K, Mader AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ. Nature 1997 Sep18;389(6648):251-60

53 Nukleosom zbudowany jest z rdzenia białkowego, z około 147 bp DNA owiniętego wokół rdzenia oraz z 50 bp DNA łącznikowego Rdzeń składa się z dwóch kopii każdego z histonów H2A, H2B, H3 i H4 Poza rdzeniem nukleosomu dołączony jest histon H1 DNA histon H1 histon H2A histon H2B histon H3 histon H4

54 Regulacja dostępności chromatyny Struktura chromatyny utrudnia zachodzenie transkrypcji Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc.

55 Modyfikacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu transkrypcji 1. Metylacja DNA

56 Metylacja DNA: przyłączenie grupy metylowej do cytozyny O SAM-CH SAM NH H DNMT Cytozyna O NH CH 5-Metylocytozyna

57 Metylacja DNA (u ssaków metylacji podlegają głównie sekwencje CpG, do 10% cytozyn jest metylowanych u ssaków ) powoduje zamknięcie danego obszaru chromatyny może być podtrzymywana podczas podziałów komórkowych może powstawać de novo metylacja DNA a struktura chromatyny podtrzymywanie wzoru metylacji DNA

58 Epigenetyczna regulacja genów to zjawisko polegające na wprowadzaniu zmian we wzorze ekspresji genów i ich dziedziczeniu, bez zmian w sekwencji DNA Metylacja DNA odgrywa ważną rolę w regulacji ekspresji genów oraz w dziedziczeniu epigenetycznym Metylacja DNA ważna w inaktywacji chromosomu X u samic ssaków. Metylacja DNA utrzymuje się podczas mitozy, u zwierząt w procesie mejozy większość grup metylowych jest usuwana Metylacja DNA decyduje o prawidłowym utrzymaniu rodzicielskiego piętna genomowego (ang. genetic imprinting), znacznik ten jest niezbędny do utrzymania mono-allelicznej ekspresji piętnowanego genu (np. gen Igf2 koduje czynnik wzrostowy, wyłącznie allel od ojca jest aktywny). Proces ten jest niezbędny do właściwego rozwoju.

59 Przykład epimutacji (zmiana we wzorze metylacji DNA) Cubas et al 1999, Nature 401: Gen kontrolujący symetrię kwiatu góra-dół : u mutanta jest nieaktywny powód silna i dziedziczona metylacja

60 Modyfikacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu transkrypcji 2. Kowalencyjne modyfikacje histonów rdzeniowych

61 Nukleosom Nature Reviews Molecular Cell Biology 4, (October 2003) Timeline: Chromatin history: our view from the bridge Donald E. Olins 1 & Ada L. Olins Zasadowe N- i C-końce histonowe wystają na zewnątrz nukleosomu, ponad DNA owinięty na oktamerze białkowym. Są miejscem wielu potranslacyjnych modyfikacji

62 Enzymy modyfikujące histony rdzeniowe mogą być aktywatorami bądź represorami transkrypcji S/T kinazy fosfatazy P S/T fosforylacja K Acetylotransferazy histonowe (HAT) Deacetylazy histonowe (HDAC) Ac K acetylacja K/R metylazy Me K/R metylacja demetylazy

63 Po-translacyjne modyfikacje histonów wg. B.Turner, Cell 2002

64 Ponad 100 miejsc modyfikowanych Możliwość mono-, di-, trimetylacji podnosi poziom skomplikowania systemu Nierównomierne rozmieszczenie na obszarze chromatyny Zależne od stanu komórki TEORIA KODU HISTONOWEGO

65 Mechanizm działania modyfikacji potranslacyjnych białek histonowych

66 Acetylacja histonów rdzeniowych rozluźnia strukturę chromatyny Zmiana dostępności chromatyny dla czynników transkrypcyjnych i polimeraz

67 Modyfikowane histony rekrutują specyficzne białka rozpoznające określone modyfikacje Tony Kozaurides, Cell 128 (2007)

68 Typowy wzór modyfikacji histonowych na aktywnym transkrypcyjnie genie Saunders et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, (August 2006) doi: /nrm1981

69 Modyfikacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu transkrypcji 3. Remodeling (przebudowa) struktury chromatyny

70 Regulacja struktury nukleosomowej chromatyny przesuwanie nukleosomów - zwalnianie dostępu do miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych

71 Kompleksy remodelujące chromatynę - są zbudowane zazwyczaj z kilkunastu podjednostek - aktywność zależna od ATP - w wyniku ich działania zmienia się sposób oddziaływania pomiędzy histonami, a DNA Kompleksy remodelujące zaangażowane są zarówno w aktywację jak i represję transkrypcji (koaktywatory i korepresory transkrypcji)

72 Przebudowa (remodeling) chromatyny przesunięcie oktameru histonowego zmiana konformacji nukleosom ATP-zależna przebudowa chromatyny (remodeling) histony rdzeniowe usunięcie oktameru histonowego wymiana histonów w oktamerze Mohrmann & Verrijzer, Biochimica et Biophysica Acta 1681 (2005) 59-73

73 Konserwowane funkcje biologiczne kompleksów SWI/SNF: Regulacja inicjacji oraz elongacji transkrypcji Udział w rekombinacji homologicznej, naprawie DNA Regulacja cyklu komórkowego Regulacja procesów rozwojowych Udział w szlakach sygnalizacyjnych uruchamianych przez hormony

74 Współzależność różnych typów modyfikacji chromatyny Metylacja DNA i potranslacyjne modyfikacje histonów rdzeniowych współzależą od siebie i mogą się wzajemnie indukować. Kompleksy remodelujące chromatynę zazwyczaj zawierają białka rozpoznające modyfikacje histonów oraz metylację DNA. Nieprawidłowe funkcjonowanie systemu modyfikacji chromatyny jest charakterystyczne dla większości nowotworów

75 Podstawowe modyfikacje zmieniające strukturę chromatyny ważną dla procesu transkrypcji Metylacja DNA (zamykanie obszarów chromatyny) Kowalencyjne modyfikacje histonów, np. acetylacja lub metylacja (kod histonowy) ATP-zależna przebudowa (remodeling) chromatyny- zmiana konformacji nukleosomów lub ich pozycji względem DNA