AUTOREFERAT. 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej.

Transkrypt

1 Załącznik nr 2 do wniosku o przeprowadzenie postępowania habilitacyjnego AUTOREFERAT 1. Imię i Nazwisko: Michał Mikula 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej. Doktor nauk medycznych w dziedzinie biologia medyczna Centrum Onkologii - Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie X 2006 Poszukiwanie białkowych partnerów molekularnych i określanie miejsc fosforylacji białka K z użyciem spektrometrii masowej Magister (biotechnologia) Uniwersytet Warszawski Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/ artystycznych obecnie - Zakład Genetyki Centrum Onkologii - Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie Adiunkt; kierownik Pracowni Badań Wielkoskalowych Pracownia Gastroenterologii Molekularnej Kliniki Gastroenterologii Centrum Onkologii - Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie młodszy asystent Pracownia Biologii Molekularnej Kliniki Gastroenterologii i Hepatologii CMKP stypendysta Polskiej Fundacji Gastroenterologii 4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.). a) tytuł osiągnięcia naukowego Regulacja procesu transkrypcji genów; nowa rola białka hnrnpk. b) (autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa) 1. Mikula M, Gaj P, Dzwonek K, Rubel T, Karczmarski J, Paziewska A, Dzwonek A, Bragoszewski P, Dadlez M, Ostrowski J. Comprehensive analysis of the palindromic motif TCTCGCGAGA: a regulatory element of the HNRNPK promoter. DNA Res Aug;17(4): (IF= 4,754/MNiSW=27) 2. Mikula M, Hanusek K, Paziewska A, Dzwonek A, Rubel T, Bomsztyk K, Ostrowski J. Halogenated imidazole derivatives block RNA polymerase II elongation along mitogen inducible genes. BMC Mol. Biol 2010;11:4. (IF= 3,18/MNiSW=32) 1

2 3. Mikula M, Bomsztyk K. Direct recruitment of ERK cascade components to inducible genes is regulated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnrnp) K. J. Biol. Chem Mar;286(11): (IF= 4,773/MNiSW=35) 4. Mikula M, Bomsztyk K, Goryca K, Chojnowski K, Ostrowski J. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnrnp) K genome wide binding survey reveals its role in regulating 3' end RNA processing and transcription termination at early growth response 1 (EGR1) gene through XRN2 exonuclease. J. Biol. Chem Aug 23;288(34): (IF= 4,651/MNiSW=35) c) Omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Powstające w jądrach komórek eukariotycznych pierwotne transkrypty (pre-mrna), przepisywane przez polimerazę 2 RNA (RNAP2), związane są z dużymi, wielobiałkowymi kompleksami rybonukleoprotein jądrowych, zwanymi hnrnp (ang. heterogeneous nuclear ribonucleoproteins). Białka te zaangażowane są w wiele procesów biologicznych, związanych z procesowaniem DNA, takich jak: transkrypcja, rekombinacja i kontrolowanie długości telomerów oraz metabolizmem RNA, do których można zaliczyć: obróbkę pre-mrna, translokację dojrzałego mrna z jądra do cytoplazmy oraz translację. Opisano 24 polipeptydy, wchodzące w skład rodziny białek hnrnp. Do tej rodziny należy również białko K (hnrnpk), będące od wielu lat przedmiotem moich zainteresowań naukowych, jak i podmiotem niniejszego omówienia, składającego się na dzieło naukowe. Liczne badania nad białkiem K, w tym własne, wskazują że może ono pełnić rolę rusztowania molekularnego, do którego dokują inne białka w procesach z udziałem kwasów nukleinowych. Mnogość interakcji białka K pokazuje, że jest ono zaangażowane w procesy kontrolujące ekspresję genów na poziomie remodelowania chromatyny, transkrypcji, wycinania intronów, translacji i regulacji stabilności RNA. W zależności od warunków białko K może być aktywatorem bądź represorem procesów związanych z ekspresją genów. Badania nad białkiem K prowadzone są w zespole prof. Ostrowskiego, którego jestem członkiem, od ponad 20 lat we współpracy z prof. Bomsztykiem z Uniwersytetu Waszyngotna w Seattle. Od około 10 lat białko to jest również podmiotem jednych z moich podstawowych zainteresowań naukowych, a badania nad interaktomem białkowym i modyfikacjami potranslacyjnymi białka K były tematem mojej rozprawy doktorskiej. Przedstawione w niniejszym omówieniu prace, składające się na osiągnięcie naukowe, opisują wyniki badań procesów transkrypcji genów, ze szczególnym uwzględnieniem roli białka hnrnpk. Ponieważ prace te są tematycznie powiązane z kolejnymi etapami transkrypcji, zostały przedstawione w kontekście kolejnych faz tego procesu. Komórki eukariotyczne regulują swój rozwój, różnicowanie i homeostazę poprzez zmianę ekspresji genów. Ścisła kontrola ekspresji poszczególnych genów determinuje nie tylko fenotyp i specjalizację danego typu komórki, ale także jej odpowiedź na sygnały środowiska. Przepisanie informacji genetycznej w jądrze komórkowych z DNA na RNA następuje z udziałem kompleksu transkrypcyjnego, zawierającego jeden z trzech podtypów enzymu polimerazy RNA: RNAP1, 2 i 3. RNAP2 odpowiada za ekspresję genów kodujących białka, mirna oraz niektórych snrna. Proces transkrypcji można podzielić na trzy etapy: inicjację, elongację i terminację. Chociaż ten podział jest umowny, można jednak wskazać na zakres koniecznych zdarzeń molekularnych zachodzących w obrębie transkrybowanego genu, pozwalających określić ramy poszczególnych etapów. Inicjacja transkrypcji obejmuje związanie RNAP2 do promotora genu przy udziale podstawowych czynników transkrypcyjnych i utworzenie tzw. kompleksu preinicjacyjnego PIC (ang. pre-initiation complex). W następstwie dochodzi do rozplecenia 2

3 dwuniciowego DNA w rejonie promotora genu i przemieszczenia kompleksu RNAP2 poza jego obszar. Na etap elongacji składa się przerywana, cykliczna synteza krótkich fragmentów mrna, powiązana z procesem pauzowania RNAP2 poniżej sekwencji promotora, po czym następuje właściwe wydłużanie transkryptu, połączone z jego jednoczasowym procesowaniem (składanie przez wycinanie intronów). Terminacja obejmuje przecięcie transkryptu mrna, dodanie sekwencji poli(a) oraz odłączenie kompleksu RNAP2 z matrycy DNA. Inicjacja. Każdy gen składa się z części kodującej DNA, przepisywanej na łańcuch RNA, oraz otaczających regulatorowych sekwencji DNA, wpływających na jego aktywność. Inicjacja transkrypcji zależy od dostępności regionów regulatorowych genu, wiążących w centralnej części promotora kompleks RNAP2, czynniki transkrypcyjne (czynniki trans), oraz białka remodelujące chromatynę, enzymy modyfikujące histony czy kinazy białkowe. Ważną rolę w tym procesie odgrywają krótkie motywy sekwencyjne (czynniki cis) DNA, do których specyficznie wiązane są poszczególne białka powiązane z procesem transkrypcji. W ramach projektu MNiSW "Analiza konstytutywnej i indukowalnej transkrypcji genu hnrnpk", którego kierownikiem był prof. Ostrowski, analizowałem promotory genu hnrnpk ze szczególnym uwzględnieniem promotora pierwszego, zawierającego palindromowy element regulatorowy o sekwencji TCTCGCGAGA. Motyw ten znajduje się w promotorach genów pozbawionych motywu TATA i jest potencjalnym elementem cis-regulatorowym w około 5% ludzkich genów kodującym m.in. czynniki transkrypcyjne, modulatory struktury chromatyny oraz białka rybosomalne. W pracy podsumowującej badania wykonane w ramach tego projektu i opublikowanej w DNA Research zastosowano szeroki zakres technik molekularnych do scharakteryzowania rejonu niosącego motyw TCTCGCGAGA, takich jak system reporterowy, metoda EMSA (ang. electromobility shift assay) oraz immunoprecypitacja chromatyny (ChIP). W celu identyfikacji czynników transkrypcyjnych i białek chromatyny potencjalnie wiążących opisywany cis-element, białka z frakcji jądrowej linii komórkowej HeLa wiązano do sond DNA i identyfikowano z użyciem spektrometrii mas (MS). Analiza proteomiczna zidentyfikowała 297 białek, oznaczonych po co najmniej 2 peptydach, w kompleksach wiązanych in vitro do badanego motywu, jednakże nie wskazano jednoznacznie białka bezpośrednio rozpoznającego motyw TCTCGCGAGA. Przy użyciu systemu reporterowego określono właściwy promotor genu hnrnpk oraz potwierdzono kluczową rolę motywu TCTCGCGAGA w regulacji jego ekspresji poprzez wykazanie, że pojedyncza mutacja w jego obrębie powoduje obniżenie ekspresji genu reporterowego na poziomie 80%, a potrójna mutacja znosi ją niemalże całkowicie. Metodą EMSA badano oddziaływanie prawidłowych oraz zmutowanych jedno i dwuniciowych sond DNA o długości 16 i 30 nukleotydów z ekstraktem białek frakcji jądrowej i wykazano, że konformacja jednoniciowa motywu TCTCGCGAGA może stanowić funkcjonalny element regulatorowy promotora hnrnpk. W tej konformacji element ten może tworzyć palindromową strukturę "spinki do włosów" i formować platformę do preferencyjnego wiązania wybranych białek jądrowych. Oznaczenia z użyciem metody ChIP wiązania RNAP2 oraz poziomu wybranych modyfikacji potranslacyjnych histonów związanych z aktywacją, takich jak acetylacja lizyny 9/18 histonu H3 (H3K9/18Ac) i trimetylacja lizyny 4 histonu H3 (H3K4m3) oraz represją transkrypcji, reprezentowaną przez H3K27m3 wykazały, że obszar chromatyny promotora hnrnpk oraz innych genów zawierających motyw TCTCGCGAGA wykazuje cechy promotorów genów metabolizmu podstawowego, takich jak dehydrogenaza aldehydu 3- fosfoglicerynowego (GAPDH) czy tubulina B6 (TUBB6). Analiza bioinformatyczna danych udostępnionych przez konsorcjum ENCODE dla tzw. otwartej chromatyny, mierzonej jej podatnością na cięcie DNAzą wykazała, że motyw TCTCGCGAGA może definiować granice otwartej chromatyny przez wpływ na rozmieszczenie nukleosomów sąsiadujących z promotorem. 3

4 Elongacja. Proces transkrypcji jest silnie zależny od stopnia ufosforylowania domeny CTD RNAP2. Domena ta zbudowana jest u ssaków z 52 heptapeptydowych (YSPTSPS) powtórzeń i stanowi substrat dla licznych kinaz, w tym kinaz cyklinozależnych (CDK). CDK selektywnie fosforylują reszty serynowe w pozycji Ser2, Ser5 oraz Ser7. Wzór fosforylacji domeny CTD, w tym na Thr4 oraz Tyr1, zmienia się dynamicznie w procesie transkrypcji, regulując każdy z jego kolejnych etapów. W obowiązującym modelu transkrypcji, podczas inicjacji transkrypcji polimeraza RNAP2 jest dokowana do promotora z nieufosforylowaną domeną CTD, następnie jest poddawana fosforylacji na Ser5 heptapetydu przez kompleks CDK7/TFIIH. Proces ten pozwala na opuszczenie promotora przez kompleks RNAP2 i przejście do wczesnej fazy elongacji, powiązanej z procesem pauzowania RNAP2 poniżej sekwencji promotora. Zjawisko pauzowania kompleksu RNAP2 dotyczy 30% genów eukariotycznych. Przejście do produktywnej fazy elongacji mrna wiąże się z fosforylacją represorowych białek DSIF (ang. 5,6-Dichloro-1-β-d-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) sensitivity-inducing factor) i NELF (ang. negative elongation factor) oraz Ser2 domeny CTD przez kompleks p-tefb (ang. Positive transcription elongation factor b), składający się z kinazy CDK9 oraz cykliny T. Poziom fosforylacji Ser2 heptapeptydu narasta stopniowo w miarę przesuwania się kompleksu elongacyjnego RNAP2 wzdłuż genu, osiągając najwyższą intensywność w pobliżu miejsca terminacji. Modyfikacja ta reguluje również wiązanie czynników odpowiedzialnych za poliadenylację, łącząc w ten sposób początek procesu transkrypcji z późniejszym etapem tworzenia dojrzałego 3 końca mrna. Wzór ufosforylowania domeny CTD wzdłuż przepisywanego genu wydaje się zatem koordynować kolejne kroki transkrypcji przez wiązanie odpowiednich czynników białkowych. W ramach projektu MNiSW "Inhibitory kinaz białkowych jako potencjalne leki przeciwnowotworowe i przeciwwirusowe" podjęto próbę zidentyfikowania mechanizmów, jakie decydują o antyproliferacyjnych i proapoptotycznych właściwościach inhibitorów kinazy CK2 TBBz i DMAT. Wyniki tych prac opisano w czasopiśmie BMC Molecular Biology. Stosując technologię pomiaru ekspresji genów z użyciem mikromacierzy ekspresyjnych wykazano, że związki drobnocząsteczkowe TBBz i DMAT hamują indukowaną mitogenami ekspresję genów wczesnych. Analiza techniką ChIP wskazała, że oba związki blokują elongację RNAP2 wzdłuż genu wczesnego EGR-1, powodując nagromadzenie kompleksu RNAP2 w pobliżu miejsca startu transkrypcji. W teście fosforylacji in vitro z użyciem immunoprecypitowanego kompleksu p-tefb i heptapeptydu YSPTSPS jako substratu wykazałem, że oba inhibitory hamują autofosforylację i aktywność kinazy CDK9. Tym samym dowiodłem, że badane inhibitory kinazy CK2 oddziałują również z kinazą CDK9, a hamowanie elongacji RNAP2 przez TBBz i DMAT może odpowiadać za ich antyproliferacyjne i proapoptotyczne właściwości. W odpowiedzi na działanie czynników zewnętrznych, takich jak stres czy sygnały proliferacyjne, komórki przeprogramowują transkrypcję w jądrze komórkowym, włączając lub wyłączając odpowiednie geny. Tego typu procesy kontrolowane są przez kaskady sygnałowe, w skład których wchodzą kinazy białkowe, enzymy katalizujące dołączanie reszty fosforanowej do łańcucha polipeptydowego. Kinazy białkowe znajdujące się na końcu łańcucha sygnałowego kinazy terminalne wyzwalają właściwą odpowiedź komórkową przez bezpośrednią fosforylację czynników transkrypcyjnych, białek regulatorowych lub innych białek, które wraz z DNA tworzą chromatynę. Od ponad dwóch dekad wiadomo, że kinazy mogą lokalizować się w jądrze komórkowym, ale dopiero niedawno wykazano, iż enzymy te mogą być wiązane w obrębie sekwencji rejonów regulatorowych i kodujących genów. Nadal jednak nie było wiadomym ile komponentów tworzących daną kaskadę sygnałową może być rekrutowanych do tych rejonów ani nie podjęto prób opisania mechanizmów tej interakcji wzdłuż transkrybowanych genów. Zrealizowany przeze mnie projekt "Co-recruitment of signaling kinases with K protein to loci driving colon cancer cell proliferation" w ramach 2-letniego stażu podoktorskiego w laboratorium prof. Bomsztyka w Uniwersytecie Waszyngtona, Seattle, USA zakładał badanie zmian wiązania białka K oraz towarzyszących mu kinaz do DNA w komórkach linii raka jelita grubego (HCT116) w skali lokalnej, dotyczącej pojedynczych genów 4

5 oraz w skali genomu. Kluczowe w mojej pracy było zastosowanie opracowanej przez zespół prof. Bomsztyka metody Matrix-ChIP, która umożliwia badanie kinetyki wiązania wielu białek jednocześnie do wybranych rejonów DNA. Wyniki badań dotyczące pierwszej części projektu, a więc badania roli białka K w wiązaniu kinaz do loci genów wczesnych podsumowano w pracy opublikowanej w Journal of Biological Chemistry w 2011 roku. Wykonane przez mnie badania wskazały, że białko hnrnpk i kinazy białkowe, wchodzące w skład szlaku sygnałowego kinaz aktywowanych mitogenami (MAPK) są rekrutowane do loci genów wczesnych, takich jak EGR-1 w odpowiedzi na sygnały proliferacyjne. W swej pracy, po raz pierwszy wykazałem, że niemal wszystkie komponenty szlaku MAPK białka GRB2, SOS, RAF-B, MEK1/2 oraz ERK1/2 wiązane są wzdłuż genu EGR- 1, a kinetyka ich wiązania odpowiada profilowi wiązania RNAP2 oraz białka K. Białko K jest substratem dla wielu kinaz, między innymi jest fosforylowane przez kinazę należącą do rodziny MAPK ERK1/2. Białko K dzięki swej modułowej budowie umożliwia interakcje białek w obrębie swojej struktury, również kinaz, jest więc swego rodzaju katalizatorem strukturalnym, ułatwiającym wzajemne interakcje kinaz i ich substratów. Stosując metodę sirna wykazałem, że czasowe obniżenie poziomu białka K zmienia globalny (w całkowitych lizatach komórkowych) oraz lokalny (w obrębie genu EGR-1) poziom ufosforylowania kinaz ERK oraz MEK. Kinetyka aktywacji kinaz MEK i ERK w lizatach komórkowych w porównaniu z ich aktywacją w obrębie EGR-1, była mniej dynamiczna i trwała dłużej. Obniżenie ilości białka K hamowało wiązanie kinazy MEK oraz fosforylację ERK w obrębie genu EGR-1. Wynik ten dowodzi, że aktywacja ERK przez MEK wzdłuż genu EGR-1 jest zależna od białka K i zachodzi in situ. Wyciszenie białka K nie zmieniało natomiast wiązania kompleksu RNAP2 wzdłuż genu, ale obniżyło poziom transkryptu EGR-1 co sugeruje, że pomimo braku zmian w tempie elongacji, białko K odpowiada za stabilność transkryptu EGR-1, regulując jego poziom potranskrypcyjnie. Wcześniejsze badania wykazały, że białko K wiąże transkrypty wielu genów in vivo, dlatego zaadoptowałem platformę Matrix ChIP i dostosowałem ją w opisywanej pracy do potrzeb immunoprecypitacji RNA. Udoskonalona przeze mnie odmiana platformy Matrix nazwana, Matrix-RIP (od RNA ImmunoPrecipitation) posłużyła do badania wiązania transkryptów genów wczesnych przez białko K. Podsumowując, uzyskałem dowody na to, że niemal wszystkie komponenty szlaku MAPK mogą być rekrutowane wzdłuż indukowalnego genu w powiązaniu z transkrybującym kompleksem RNAP2. Białko K, które towarzyszy temu kompleksowi, odgrywa ważną rolę w wiązaniu kinazy MEK1/2 oraz aktywacji ERK1/2 wzdłuż genu EGR- 1. Uzyskane wyniki dowodzą, że białko K może pełnić ważną rolę w procesie regulowania transkrypcji wybranych genów wczesnych w odpowiedzi na zewnątrzkomórkowe sygnały proliferacyjne. Terminacja transkrypcji RNAP2, poprzez ścisłe powiązanie z procesem tworzenia dojrzałego 3 końca mrna, jest kluczowym determinantem losu nowopowstałego transkryptu. Proces ten decyduje o uwolnieniu kompleksu RNAP2 z matrycy DNA, co ma istotne znaczenie nie tylko dla zapobieżenia transkrypcji genów sąsiadujących, ale również dla zapewnienia odpowiedniej puli RNAP2, dostępnej w procesie globalnej transkrypcji. O ile wiedza o mechanizmach regulacji inicjacji i elongacji jest dość obszerna, to w przypadku terminacji, mechanizm tego etapu transkrypcji pozostaje wciąż mało poznany. Terminacja w wykonaniu prokariotycznych polimeraz RNA, podobnie jak eukariotycznych RNAPI oraz III, ma miejsce w obrębie specyficznych sekwencji i wymaga obecności krótkich motywów sekwencyjnych (czynniki cis) DNA lub RNA, które pośrednio lub bezpośrednio destabilizują kompleks elongacyjny. U ssaków, przecięcie pierwotnego transkryptu mrna i poliadenylacja ma miejsce od 10 do 30 nukleotydów poniżej konserwatywnej sekwencji heksanukleotydu AAUAAA (lub AUUAAA) oraz w odległości ~30 nukleotydów powyżej rejonu bogatego w powtórzenia U lub GU. Sekwencje te rozpoznawane są przez kompleksy białkowe, katalizujące reakcję przecięcia i poliadenylacji. Jednakże dotąd nie ujawniono specyficznej, uniwersalnej sekwencji DNA ani 5

6 stałej odległości od miejsca poliadenylacji transkryptu, determinujących odłączenie kompleksu elongacyjnego RNAP2 od matrycy in vivo. Terminacja transkrypcji genów kodujących białka u eukariontów wydaje się być zatem wydarzeniem losowym, niezależnym od elementów cis, którego prawdopodobieństwo rośnie znacząco, gdy kompleks elongacyjny przesunął się poza miejsce poli(a), znajdujące się na 3 końcu genu. Już ponad 20 lat temu zaproponowano dwa modele opisujące, w jaki sposób transkrypcja sięgająca poza sekwencję heksanukleotydu AAUAAA zwiększa prawdopodobieństwo terminacji. Pierwszy z nich, nazwany modelem allosterycznym, zakłada, że przejście kompleksu elongacyjnego przez AAUAAA prowadzi do zmian konformacyjnych kompleksu poprzez odłączanie czynników stymulujących elongację i jednoczesne wiązanie białek pro-terminacyjnych.. Drugi model, nazwany torpedo, został oparty na obserwacji szybkiej degradacji 5 końca RNA tuż za rejonem poli(a). Uwolniony koniec 5 RNA rozpoznawany jest przez 5-3 egzonukleazę (Rat1/Xrn2), która degraduje mrna w kierunku RNAP2, powodując jej uwolnienie z matrycy DNA. Wyłączenie tego enzymu zarówno u drożdży, jak i w ludzkich liniach komórkowych powodowało przesuwanie RNAP2 poza typowy rejon terminacji, charakterystyczny dla wybranych genów. Wyniki zaprezentowane w pracy opublikowanej w Journal of Biological Chemistry w 2013 roku opisujące nową rolę białka K w procesie terminacji transkrypcji obejmowały doświadczenia wykonane w trakcie stażu podoktorskiego oraz w ramach projektu własnego Iuventus Plus MNiSW "Badanie interaktomu białkowego oraz modyfikacji potranslacyjnych białka hnrnpk w raku jelita grubego". Publikacja ta została uznana przez Polskie Towarzystwo Biochemiczne za najlepszą pracę z chemii i biochemii kwasów nukleinowych w roku Stosując technikę ChIP w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji, ChIP-Seq, wykazałem, że białko K gromadzi się na 3 końcach genów bezpośrednio wczesnych po stymulacji komórek HCT116 surowicą cielęcą płodową. To zjawisko ma bezpośredni związek z indukcją transkrypcji genów wczesnych, a białko K, jak dowiodłem w pracy z 2011 roku, odgrywa rolę w procesie transkrypcji tych genów, w tym genu EGR1, który został użyty jako model badawczy. Badanie interaktomu białkowego hnrnpk w linii HCT116 z użyciem metody immuoprecypitacji połączonej z identyfikacją białek techniką MS wskazało na oddziaływanie białka K z białkiem XRN2, enzymem pełniącym istotną rolę w regulacji procesu terminacji transkrypcji i ko-transkrypcyjnej degradacji RNA. Potwierdziłem ponadto oddziaływanie rekombinowanych białek hnrnpk i XRN2 in vitro. Akumulacja białka K na końcach genów wczesnych i identyfikacja białka XRN2 jako komponentu jego interaktomu stały się podstawą dalszych badań w celu wyjaśnienia funkcjonalnego znaczenia tej interakcji. Czasowe obniżenie ekspresji białka K z użyciem sirna istotnie podwyższyło poziom pre-mrna poniżej miejsca poli (A) genu EGR1, co nie przekładało się na zmianę ilości kompleksu transkrypcyjnego RNAP2 w tym rejonie, ale zmniejszało mierzony techniką ChIP poziom XRN2. Podobny efekt w postaci wzrostu poziomu pre-mrna w rejonie 3' genu EGR1 uzyskano wyciszając ekspresję genu XRN2 z użyciem sirna. Wyniki tej pracy potwierdzają, że białko K spełnia funkcje rusztowania molekularnego dla innych białek. Interakcja białka K z XRN2 w obrębie miejsc aktywnej transkrypcji może wpływać na proces terminacji transkrypcji i metabolizmu RNA poniżej 3 końców genów. W podsumowaniu, za najważniejsze dokonania prac składających się na osiągnięcie naukowe uważam: scharakteryzowanie promotora genu hnrnpk zawierającego motyw palindromowy TCTCGCGAGA; wykazanie, że inhibitory kinazy CK2 hamują aktywność kinazy CDK9 i blokują elongację transkrypcji polimerazy 2 RNA; wykazanie, że wszystkie komponenty szlaku MAPK oddziałują z chromatyną jądrową, a ich wiązanie i propagacja sygnału w obrębie szlaku jest zależna od białka K; wskazanie na nową rolę białka K w procesie terminacji transkrypcji przez tworzenie kompleksu z egzonukleazą XRN2. 6

7 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych (artystycznych) a) podsumowanie dorobku naukowego Liczba cytowań publikacji według bazy Web of Science (01/06/2014): 344 Indeks Hirscha według bazy Web of Science: 11 Współautor 34 publikacji, w tym 10 jako pierwszy autor, których sumaryczny impact factor (IF) wynosi 119,822 17,366 - sumaryczny IF 4 publikacji z pierwszym autorstwem składających się na osiągnięcie naukowe 43,008 - sumaryczny IF 12 prac, w tym 4 jako pierwszy autor, opublikowanych przed uzyskaniem tytułu doktora 56,448 - sumaryczny IF 18 prac, w tym 1 jako pierwszy autor, opublikowanych po uzyskaniu tytułu doktora i niewchodzących w skład osiągnięcia naukowego b) Kierownictwo projektów badawczych finansowanych ze środków budżetowych na naukę NCN 2011/01/D/NZ2/05307 SONATA1 "Wielkoskalowe badanie interakcji komponentów szlaku sygnałowego kinazy ERK z ludzkim genomem" MNiSW IP Iuventus Plus 3 "Zastosowanie sekwencjonowania nowej generacji w celu optymalizacji sposobów oznaczania mutacji w genach BRCA1 i BRCA2 na potrzeby poradnictwa genetycznego" MNiSW IP Iuventus Plus 1 "Badanie interaktomu białkowego oraz modyfikacji potranslacyjnych białka hnrnpk w raku jelita grubego" 6. Informacje dodatkowe a) Doświadczenie dydaktyczne i popularyzatorskie 2013, godzinny cykl wykładów "Inżynieria genetyczna" w ramach studiów 2-go stopnia na kierunku Inżynieria Biomedyczna Politechniki Warszawskiej 2013, 2014 Medycyna molekularna techniki i aplikacje praktyczne kurs praktyczny prowadzony przez Klinikę Gastroenterologii i Hepatologii CMKP 2014 Promotor pracy inżynierskiej "Wpływ inhibitora kinazy CDK8 na ekspresję genów w ksenograftach linii raka jelita grubego HCT 116" na kierunku biotechnologia SGGW b) Inna działalność zawodowa Recenzja pracy oryginalnej dla International Journal of Cancer 4 recenzje grantów krajowych dla Narodowego Centrum Nauki (NCN) Opiekun naukowy projektu NCN (2012/05/N/NZ2/00602) PRELUDIUM c) Doświadczenie naukowe zdobyte za granicą USA; University of Washington; UW Medicine Lake Union; Seattle. Termin: VII-VIII tygodni; short term scholar USA; University of Washington; UW Medicine Lake Union; Seattle. Termin: X X.2009; staż podoktorski, udział w realizacji projektu badawczego pt. Co-recruitment of signaling kinases with K protein to loci driving colon cancer cell proliferation w ramach programu MNiSW Wsparcie międzynarodowej mobilności naukowców 7

8 óę ę Ź ół ę ł ó Ś ół ą ł ó óż ą ę ł ó ł ę ą ę ę ą ł ę ą ą ł ó ę Ę ó ł ł ę ą ł ą ń ą ł ó