(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/09 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 5/107 ( ) A61K 38/07 ( ) A61P 25/04 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Sposób wytwarzania nowego peptydu opioidowego (30) Pierwszeństwo: (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2011/45 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/08 (73) Uprawniony z patentu: Action For Development Of Research SP. Z.O.O., Warszawa, PL (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 ANDREJ LIPKOWSKI, Warszawa, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Rafał Witek WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 [0001] Przedmiot wynalazku stanowią nowe analogi peptydowe wykazujące powinowactwo do receptorów opioidowych o ogólnym wzorze podanym na Fig. 1, szczególnie do podawania obwodowego lub ośrodkowego układu nerwowego, w postaci wlewów lub zastrzyków lub implantów, w leczeniu silnych bólów przewlekłych w stanach reumatoidalnych, dny lub bólów neuropatycznych związanych z osteoporozą lub powikłaniami powypadkowymi lub pooperacyjnymi oraz bólów nowotworowych. [0002] Sygnał bólowy powstający na skutek uszkodzenia organów ciała lub choroby jest przekazywany do ośrodkowego układu nerwowego gdzie generuje odczucie bólu. Wielkość bodźca bólowego jest regulowana przez system receptorów nocyceptywnych i antynocyceptywnych umieszczonych na błonie komórek nerwowych. Receptory tachykininowe znajdujące się na komórkach nerwowych układu nerwowego obwodowego i ośrodkowego stanowią zasadniczy komponent receptorów nocyceptywnych i odgrywają główną rolę w przekazywaniu sygnałów bólowych. Endogennie występujące peptydy opioidowe stanowią jeden z naturalnych czynników obniżających sygnał bólowy w wyniku aktywacji receptorów antynocyceptywnych. Receptory opioidowe również są aktywowane przez podawanie opioidowych leków analgetycznych takich jak morfina lub fentanyl. Niestety podawanie dotychczas dostępnych leków analgetycznych powoduje szereg reakcji niepożądanych, w tym tolerancję i lekozależność. Zastosowanie peptydowych analogów naturalnych peptydów opioidowych o ogólnym wzorze przedstawionym na Fig. 1 daje możliwość zmniejszenia tolerancji i lekozależności. Według danych doświadczeń przeprowadzonych na zwierzętach i przedstawionych w roku 1989 na konferencji International Narcotic Research Conference 1989 i opisanych w materiałach pokonferencyjnych, przez B.S. Silbert, A.W. Lipkowski, D.B. Carr, S.K. Szyfelbein, P.F. Osgood, w rozdziale "Peptides as potential nociceptive drugs.", na stronach książki Procc. Int. Narc. Res. Conf.'89, pod redakcją R. Quirion, wydaną przez Alan R. Liss Inc, w New.York, w roku 1990 oraz D. Kosson, I. Maszczynska Bonney, D.B. Carr, E. Mayzner-Zawadzka, A.W. Lipkowski, w artykule Antinociceptive properties of biphalin after intrathecal application in rats: a reevaluation. w piśmie Pharmacological Report. Tom 57, na stronach , w roku 2005 działanie peptydu opioidowego o zwyczajowej nazwie bifalina wykazuje wysoką aktywność przeciwbólową. Związek ten wykazuje znacznie mniejsze efekty uzależnienia, jak to opisano przez M. Yamazaki, T. Suzuki, M. Narita, A.W. Lipkowski, w artykule "The opioid peptide analogue biphalin induces less physical dependence than morphine", w piśmie Life Science, tom 69, na stronach , w roku [0003] Chemicznie, bifalina jest dimerem dwóch czteropeptydowych farmakoforów opioidowych. Badania zależności aktywności biologicznej od struktury chemicznej bifaliny wykazały, że jeden z czteropeptydowych fragmentów peptydowych może być zastąpiony przez peptydowy lub niepeptydowy lipofilny komponent bez istotnej zmiany powinowactwa do receptorów opioidowych, jak to opisano przez A.W. Lipkowski, A. Misicka, P. Davis, D. Stropova, J. Janders, M. Lachwa, F. Porreca, H.I. Yamamura, V.J. Hruby, w pracy pod tytułem Biological activity of fragments and analogues of the potent dimeric opioid peptide, biphalin., w piśmie Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters w tomie 9, na stronach , w roku W wyniku zastąpienia jednego czteropeptydowego fragmentu bifaliny przez benzyloksykarbonylo-ltryptofan, otrzymano związek o powinowactwie do receptorów opioidowych porównywalnym z bifaliną z jednoczesnym działaniem jako słaby antagonista na receptory tachykininowe. W wyniku tego otrzymano związek o silnym działaniu przeciwbólowych w bólach zapalnych, jak to opisano w pracy autorstwa I.

3 2 Maszczynska Bonney, S.E. Foran, J.E. Marchand, A.W. Lipkowski, D.B. Carr w pracy pod tytułem Spinal antinociceptive effects of AA501, a novel chimeric peptide with opioid receptor agonist and tachykinin receptor antagonist moieties, w piśmie European Journal of Pharmacology w tomie 488, na stronach 91-99, w roku [0004] Niespodziewanie okazało się, że zamiana chiralności L reszty aminokwasu tryptofanu na resztę D- tryptofanu powoduje istotne zwiększenie aktywności przeciwbólowej analogu peptydowego. Jednocześnie, niespodziewanie okazało się, że podstawienie benzyloksykarbonylowego ugrupowania przez inne fragmenty zawierające ugrupowanie aromatyczne zachowuje lub zwiększa ich aktywność przeciwbólową. [0005] Z tego powodu, pierwszym przedmiotem wynalazku jest nowy związek o ogólnym wzorze: Gdzie: - L, D oznaczają chiralność reszt aminokwasów; - R 1 oznacza łańcuch boczny aminokwasów obejmujący: D-alaniny, D-Leucyny, D-argininy, D- lizyny, D-seryny lub D-treoniny, - R 2 oznacza łańcuch boczny aminokwasów obejmujący: L-fenyloalaniny lub L-tryptofanu; - -CO-R 3 oznacza benzyloksykarbonyl lub cynamoil, alfa-methyl-4-(2 metylopropyl) benzenoacetyl, salicylo-glicyl-, benzoilo-glicyl-. Lub ich farmaceutycznie dopuszczalną sól. [0006] Szczegółowo, jest to związek obejmujący: - N'-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-fenyloalanylo, N''-benzyloksykarbonylo-D-tryptofanylo hydrazydu lub jego sól, w szczególności chlorowodorek; - N'-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-fenyloalanylo, N'-salicylo-glicylo-D-tryptofanylo hydrazydu lub jego sól, w szczególności chlorowodorek; - N'-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-fenyloalanylo, N''-alfa-methyl-4-(2-metylopropyl) benzenoacetylo-dtryptofanylo) hydrazydu lub jego sól, zwłaszcza chlorowodorek. [0007] Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku według wynalazku do wytworzenia leku przeciwbólowego.

4 3 [0008] Nowe analogi peptydowe o ogólnym wzorze przedstawionym na Fig. 1 charakteryzują się silnym powinowactwem do receptorów opioidowych, jak również do innych receptorów uczestniczących w transmisji i modulacji bodźców bólowych i mogą być użyteczne w leczeniu bólu, zwłaszcza przewlekłego bólu pojawiającego się w stanach chorobowych, stanach pooperacyjnych lub w następstwie wypadków. [0009] Leki zawierające związek według niniejszego wynalazku mogą być stosowane do podawania obwodowego lub do ośrodkowego układu nerwowego, korzystnie do leczenia silnego bólu przewlekłego, zwłaszcza bólu spowodowanego stanem zapalnym. W szczególności, przewlekły ból i stan zapalny może być wywołany przez nowotwór, zapalenie stawów, podagrę, stwardnienie rozsiane, osteoporozę, neuropatię pourazową lub pooperacyjną lub zmiany nowotworowe. Ujawnione tutaj związki wykazują również powinowactwo do receptorów tachykininy. Zauważono również, że działanie związku podawanego obwodowo jest znacznie zwiększone podczas stanów chorobowych, w których obserwuje się stan zapalny. [0010] Szczególnie korzystnym sposobem podawania związku według niniejszego wynalazku jest kroplówka, implant podskórny lub dootrzewnowo oraz podawanie do ośrodkowego układu nerwowego, podpajęczynówkowo lub za pomocą implantu. [0011] Związek według niniejszego wynalazku może być podawany niezależnie, w postaci roztworu lub może być częścią składową wieloskładnikowego układu zawierającego inne składniki aktywne. [0012] Związek według niniejszego wynalazku lub jego kompozycje z innymi lekami lub nośnikami mogą być przygotowane w postaci sterylnego liofilizatu, który powinien zostać rozpuszczony przed podaniem w określonej objętości roztworu soli fizjologicznej. Korzystnie, związek lub jego kompozycje z innymi lekami i/lub substancjami nośnikowymi jest przygotowywany w połączeniu z polimerem będącym nośnikiem substancji aktywnej. [0013] Aby lepiej zobrazować istotę niniejszego wynalazku, w oparciu o działanie przeciwbólowe związków przedstawionych na Fig. 1, załączone przykłady wykazują rzeczone działanie w leczeniu przewlekłego bólu u zwierząt. Jednakże zakres niniejszego wynalazku nie powinien być ograniczany do treści poniższych przykładów. Fig. 1 przedstawia ogólny wzór związków będących przedmiotem niniejszego zgłoszenia, gdzie L, D oznaczają chiralność reszt aminokwasów; R 1 oznacza łańcuch boczny aminokwasów obejmujący: D-alaniny, D-Leucyny, D-argininy, D-lizyny, D-seryny lub D-treoniny; R 2 oznacza łańcuch boczny aminokwasów obejmujący: L-fenyloalaniny lub L-tryptofanu; -CO-R 3 oznacza benzyloksykarbonyl lub cynamoil, alfa-methyl-4-(2 metylopropyl) benzenoacetyl, salicylo-glicyl-, benzoiloglicyl-. Przykład I. [0014] T-Butyloxycarbonylo-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-fenyloalaniny (Boc-Tyr-D-Ala-Gly-Phe) (10 mmoli) i benzyloksykarbonylo-d-tryptofanylo)-hydrazydu (Cbz-D-Trp-NHNH 2 ) (10 mmoli) oraz hydroksyimid kwasu bursztynowego (HO-Su) (12 mmoli) rozpuszczono w dimetyloformamidzie (DMF) (40 cm 3 ). Po oziębieniu do temperatury w zakresie 0-5 o C do mieszanimy reakcyjnej dodano dicykloheksylkarbodiimid (10 mmoli). Reakcję mieszano przez 1 godzinę w temperaturze 5 o C, a następnie przez 12 godzin w temperaturze pokojowej (20-25 o C). Następnie, wytrącony dicykloheksylomocznik (DCU) odsączono i przemyto

5 4 dwukrotnie 10 cm 3 DMF. Do przesączu dodano 100 cm3 roztworu 5% kwaśnego węglanu potasu (KHCO 3 ). Wytrącony osad Boc-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NHNH-(Cbz-D-Trp-) odsączono, przemyto dwukrotnie 10 cm 3 roztworu 5% KHCO 3, a następnie dwukrotnie 10 cm 3 wody. Osad wysuszono. Wysuszony osad rozdrobniono i dodano do 50 cm 3 mieszaniny stężonego kwasu solnego i etanolu w stosunku objętościowym 1:1. W trakcie reakcji wydziela się CO 2, a produkt reakcji rozpuszcza się. Po 30 minutach mieszania w temperaturze pokojowej, etanol i kwas solny odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostały osad surowego produktu rekrystalizowano przez rozpuszczenie osadu w etanolu i wytrącenie produktu octanem etylu. Otrzymano produkt, którego analiza elementarna oraz spektrum masowe odpowiada chlorowodorkowi (N'-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-fenyloalanylo, N''-benzyloksykarbonylo-Dtryptofanylo) hydrazydu [HCl.Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NHNH-(CBz-D-Trp-)]. Otrzymano 7,5 mmoli produktu. U myszy wywoływano stan zapalny przez podanie do łapy myszy adjuwant Freunda. Po dwóch dniach obserwowany był narastający stan zapalny. Po tygodniu badano efekt przeciwbólowego działania analogu peptydowego HCl.Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NHNH-(CBz-D-Trp-) w bólu ostrym wywoływanym zanurzeniem ogona do wody o temperaturze 55 C. Dożylne podanie analogu peptydowego w ilości 20 mikrograma/kg powodowało całkowite zniesienie reakcji bólowej u myszy ze stanem zapalnym. Przykład II. [0015] T-Butyloxycarbonylo-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-fenyloalaniny (Boc-Tyr-D-Ala-Gly-Phe) (10 mmoli) i salicylo-glicylo-d-tryptofanylo (Salic-Gly-D-Trp-NHNH 2 ) (10 mmoli) oraz hydroksyimid kwasu bursztynowego (HO-Su) (12 mmoli) rozpuszczono w dimetyloformamidzie (DMF) (40 cm 3 ). Po oziębieniu do temperatury w zakresie 0-5 o C do mieszanimy reakcyjnej dodano dicykloheksylkarbodiimid (10 mmoli). Reakcję mieszano przez 1 godzinę w temperaturze 5 o C, a następnie przez 12 godzin w temperaturze pokojowej (20-25 o C). Następnie, wytrącony dicykloheksylomocznik (DCU) odsączono i przemyto dwukrotnie 10 cm 3 DMF. Do przesączu dodano 100 cm3 roztworu 5% kwaśnego węglanu potasu (KHCO 3 ). Wytrącony osad Boc-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NHNH-(Salic-Gly-D-Trp-) odsączono, przemyto dwukrotnie 10 cm 3 roztworu 5% KHCO 3, a następnie dwukrotnie 10 cm 3 wody. Osad wysuszono. Wysuszony osad rozdrobniono i dodano do 50 cm 3 mieszaniny stężonego kwasu solnego i etanolu w stosunku objętościowym 1:1. W trakcie reakcji wydziela się CO 2, a produkt reakcji rozpuszcza się. Po 30 minutach mieszania w temperaturze pokojowej, etanol i kwas solny odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostały osad surowego produktu rekrystalizowano przez rozpuszczenie osadu w etanolu i wytrącenie produktu octanem etylu. Otrzymano produkt, którego analiza elementarna oraz spektrum masowe odpowiada chlorowodorkowi (N'-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-fenyloalanylo, N'-salicylo-glicylo-Dtryptofanylo) hydrazydu [HCl.Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NHNH-(Salic-Gly-D-Trp-)]. Otrzymano 7,1 mmoli produktu. [0016] W modelu zwierzęcym bólu przerzutów nowotworu, u myszy wywoływano stan zapalny przez podanie do tylnej łapy ok miliona komórek nowotworu mysiego czerniaka. Po dwóch dniach obserwowany był narastający stan zapalny wywołany rozwojem nowotworu. Po dwóch tygodniach rozwoju nowotworu badano efekt przeciwbólowego działania (N -Tyrozylo-D-alanylo-glicylo-fenyloalanylo, N -salicylo-glicylo-d-tryptofanylo)-hydrazydu w bólu ostrym wywoływanym zanurzeniem ogona do wody o

6 5 temperaturze 55 C. Podanie dootrzewnowe analogu peptydowego w ilości 30 mikrograma/kg powodowało całkowite zniesienie reakcji bólowej u myszy ze stanem zapalnym. Przykład III [0017] t-butyloxycarbonylo-tyrozylo-d-alanylo-glicylo-fenyloalaniny (10 mmoli) i alfa-methyl-4-(2- metylopropyl)benzenoacetylo-d-tryptofanylo)-hydrazydu (10 mmoli) oraz hydroksyimid kwasu bursztynowego (HO-Su) (12 mmoli) rozpuszczono w dimetyloformamidzie (DMF) (40 cm 3 ). Po oziębieniu do temperatury w zakresie 0-5 o C do mieszaniny reakcyjnej dodano dicykloheksylkarbodiimid (10 mmoli). Reakcję mieszano przez 1 godzinę w temperaturze 5 o C, a następnie przez 12 godzin w temperaturze pokojowej (20-25 o C). Następnie, wytrącony dicykloheksylomocznik (DCU) odsączono i przemyto dwukrotnie 10 cm 3 DMF. Do przesączu dodano 100 cm3 roztworu 5% kwaśnego węglanu potasu (KHCO 3 ). Wytrącony osad odsączono, przemyto dwukrotnie 10 cm 3 roztworu 5% KHCO 3, a następnie dwukrotnie 10 cm 3 wody. Osad wysuszono. Wysuszony osad rozdrobniono i dodano do 50 cm 3 mieszaniny stężonego kwasu solnego i etanolu w stosunku objętościowym 1:1. W trakcie reakcji wydziela się CO 2, a produkt reakcji rozpuszcza się. Po 30 minutach mieszania w temperaturze pokojowej, etanol i kwas solny odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostały osad surowego produktu rekrystalizowano przez rozpuszczenie osadu w etanolu i wytrącenie produktu octanem etylu. Otrzymano produkt, którego analiza elementarna oraz spektrum masowe odpowiada chlorowodorkowi (N'-tyrozylo-Dalanylo-glicylo-fenyloalanylo,N''-alfa-methyl-4-(2-metylopropyl)benzenoacetylo-D-tryptofanylo) hydrazydu. Otrzymano 8.2 mmoli produktu. [0018] Dwa dni przed doświadczeniem szczurom implantowano kaniule do przestrzeni podpajęczynówkowej. W dniu doświadczenia wykonano badania efektu przeciwbólowego działania przez podanie analogu peptydu (N -Tyrozylo-D-alanylo-glicylo-fenyloalanylo, N -alfa-methyl-4-(2- metylopropyl)benzenoacetylo-d-tryptofanylo)-hydrazydu. Dawka 5 mikrogramów analogów powoduje całkowite zniesienie czułości na ból termiczny przez okres 1 godziny.

7 7 1. Związek o ogólnym wzorze: Zastrzeżenia patentowe gdzie: - L, D oznaczają chiralność reszt aminokwasów; - R 1 oznacza łańcuch boczny aminokwasów obejmujący: D-alaniny, D-Leucyny, D-argininy, D- lizyny, D-seryny lub D-treoniny, - R 2 oznacza łańcuch boczny aminokwasów obejmujący: L-fenyloalaniny lub L-tryptofanu; - -CO-R 3 oznacza benzyloksykarbonyl lub cynamoil, alfa-methyl-4-(2 metylopropyl) benzenoacetyl, salicylo-glicyl-, benzoilo-glicyl-, lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól. 2. Związek według zastrz. 1 znamienny tym, że jest to związek obejmujący: - N'-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-fenyloalanylo, N''-benzyloksykarbonylo-D-tryptofanylo hydrazydu lub jego sól, w szczególności chlorowodorek; - N'-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-fenyloalanylo, N'-salicylo-glicylo-D-tryptofanylo hydrazydu lub jego sól, w szczególności chlorowodorek; - N'-tyrozylo-D-alanylo-glicylo-fenyloalanylo, N''-alfa-methyl-4-(2-metylopropyl) benzenoacetylo-d-tryptofanylo) hydrazydu lub jego sól, zwłaszcza chlorowodorek. 3. Zastosowanie związku według któregokolwiek z zastrz. 1 do 2 do wytwarzania leku przeciwbólowego.

8 6

9 8 LITERATURA CYTOWANA W OPISIE Lista cytowanych odniesień literaturowych została przedstawiona wyłącznie dla wygody czytelnika. Nie stanowi ona części dokumentu Patentu Europejskiego. Pomimo, że podczas zestawiania listy odniesień literaturowej dołożono wszelkich starań, nie można wykluczyć błędów i pominięć, a EPO nie ponosi w tym względzie żadnej odpowiedzialności. Literatura niepatentowa cytowana w opisie: