U N I W E R S Y T E T W AR S Z A W S K I

I n s t y t u t G e n e t y k i i B i o t e c h n o l o g i i U N I W E R S Y T E T W AR S Z A W S K I W Y D Z I AŁ B I O L O G I I ul. PAWIŃSKIEGO 5A, 02-106 WARSZAWA TEL: (+22) 592-22-44, FAX: (+22) 658-41-76 http://www.igib.uw.edu.pl Warszawa, 22.09.2015 Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Urszuli Lechowicz pt.: Profil mutacji w genie TMPRSS3 u pacjentów z niedosłuchem. Praca mgr Urszuli Lechowicz wpisuje się w prowadzone w Instytucie Fizjologii i Patologii Słuchu od wielu lat badania nad genetycznymi przyczynami niedosłuchu w Polsce. Od dawna wiadomo, że najczęstszą przyczyną izolowanego niedosłuchu są mutacje genu GJB2 ze szczególnym uwzględnieniem najczęstszej w populacjach słowiańskich mutacji c.35delg, jednak genów, których mutacje mogą do niego prowadzić są setki, a ich udział w znacznym stopniu wciąż nieznany. Jako cel pracy mgr Lechowicz postawiła sobie zidentyfikowanie mutacji w genie TMPRSS3 u pacjentów objętych opieką przez IFiPS, ocenę częstości ich występowania wraz z określeniem patogenności, a na koniec próbę zdefiniowania korelacji genotyp-fenotyp w tej grupie pacjentów. Warto zauważyć, że punktem wyjścia było znalezienie dwóch mutacji genu TMPRSS3 (p.h70tfs*19/p.c194mfs*17) u pacjenta z niedosłuchem dzięki wykorzystaniu nowoczesnego narzędzia - metodą sekwencjonowania całego eksomu (WES). Pociągnęło to za sobą zrozumiałą chęć poznania miejsca mutacji tego genu wśród genetycznych przyczyn niedosłuchu w Polsce. W bardzo licznej (2277 osób wybranych z większej, liczącej 10 000 osób grupy) grupie pacjentów autorka poszukiwała mutacji genu TMPRSS2 stosując PCR w czasie rzeczywistym z zastosowaniem specyficznych sond zaprojektowanych w sposób pozwalający na wykrycie zmian stwierdzonych w WES u probanda. U osób, u których stwierdzała obecność poszukiwanych wariantów przeprowadzała sekwencjonowanie metodą Sangera w celu potwierdzenia obecności tych zmian, i dalej całego obszaru kodującego genu - w celu znalezienia drugiej mutacji mutacje genu TMPRSS3 mają charakter recesywny. Dla

każdego nowego wariantu projektowany był nowy zestaw sond do PCR w czasie rzeczywistym i był wykorzystywany do badania całej grupy w sposób podobny do pierwszej pary. W ten sposób udało się bardzo starannie przebadać całą niemałą grupę możliwie ograniczając czas i koszty badania, choć oczywiście pozostało ryzyko pominięcia pojedynczych pacjentów z dwoma niezwykle rzadkimi wariantami genu TMPRSS3. W celu określenia częstości występowania znalezionych wariantów genu TMPRSS3 mgr Lechowicz przeprowadziła także badanie licznej grupy kontrolnej. Uzyskane wyniki autorka zanalizowała pod kątem potencjalnej patogenności znalezionych wariantów stosując dostępne narzędzia bioinformatyczne i statystyczne, następnie próbowała powiązać obecność mutacji z wiekiem zachorowania oraz charakterystyką utraty słuchu. Przedstawiona mi do recenzji, licząca 113 stron, praca ma układ klasyczny. Otwiera ją niezwykle obszerny wstęp wprowadzający czytelnika w świat niedosłuchu. Autorka opisuje budowę narządu słuchu i jego funkcjonowanie, przedstawia klasyfikację niedosłuchu oraz czynniki genetyczne odpowiedzialne za wystąpienie różnych jego rodzajów skupiając się na niedosłuchu niesyndromicznym, zapoznaje czytelnika z metodami - obecnymi i proponowanymi - terapii niedosłuchu, by na koniec przedstawić i scharakteryzować białko TMPRSS3 wraz z interesującym ją, kodującym to białko genem. Rozdział zamyka opis sekwencjonowania nowej generacji stanowiącego, z laboratoryjnego punktu widzenia, punkt wyjścia niniejszej pracy. Wstęp zatem można uznać za kompletny. Kłócić się można czy nie powinien zostać uzupełniony o krótki opis audioradiogramu, skoro jego charakterystyka jest brana pod uwagę przy analizie niedosłuchu zdiagnozowanych z mutacjami genu TMPRSS3 pacjentów. Cele pracy sformułowane zostały w sposób jasny i są dobrze uzasadnione. Rozdział materiały i metody także należy uznać za kompletny jedynie informacje na temat zastosowanych narzędzi statystycznych są lakoniczne między innymi brak informacji jaki test statystyczny został zastosowany przy ocenie częstości wystąpienia drugiej mutacji genu TMPRSS3 w grupie badanej względem grupy kontrolnej. Na szczególną pochwałę zasługuje umieszczenie schematu procedury badawczej (Rycina 22) ułatwiającego prześledzenie kolejnych etapów analiz genetycznych oraz szczegółowy opis grupy badanej i kontrolnej. Opis wykorzystanych metod laboratoryjnych pozwala na ich odtworzenie i są one dobrze dobrane do planowanych badań. Rozdział wyniki obejmuje zarówno same wyniki analiz DNA w grupie badanej i kontrolnej jak też przeprowadzone analizy statystyczne, bioinformatyczne i badania 2

funkcjonalne mające na celu określenie wpływu znalezionych wariantów na funkcjonowanie białka a zatem zakwalifikowanie ich jako patogennych lub niepatogennych, oraz próbę korelacji genotypu z fenotypem. mgr Lechowicz w grupie badanej znalazła 14 różnych wariantów badanego genu, z czego 9 wcześniej nie opisywano w literaturze. Ostatecznie jako patogenne autorka zakwalifikowała wszystkie 9 nowo znalezionych wariantów i 4 wcześniej opisane. W pełni przyjmuję argumenty za lub przeciw patogeniczności analizowanych wariantów przytoczone przez autorkę. Zastrzeżenia mam jedynie co do metody analizy statystycznej zastosowanej do porównania częstości wystąpienia konkretnych wariantów w grupie badanej względem grupy kontrolnej. Autorka stosuje dwa testy: Pearsona i Fishera. Test Pearsona w przypadku wariantów, które udało jej się stwierdzić u osób z grupy kontrolnej zaś Fishera w przypadku pozostałych. Zastosowanie takiego rozróżnienia wymaga komentarza ze strony autorki. Wybór testu statystycznego często nastręcza problemów, szczególnie w przypadku małych liczebności grup. Wprawdzie grupy analizowane przez mgr Lechowicz są liczne, jednak już poszczególne kategorie osób o konkretnym genotypie są bardzo małe, wręcz stanowią zbiory puste co faktycznie bardzo utrudnia dobór testu. Uzyskanie przez nią jednak p=1 w przypadku testu Fishera powinno wzbudzić niepokój i skłonić do poszukiwania innego rozwiązania (mam tu swojego faworyta, jednak chętnie to zagadnienie przedyskutuję podczas obrony). Dodatkowo stosowanie różnych testów w tym samym typie analizy wygląda nieelegancko. Następnie mgr Lechowicz podjęła się próby korelacji uzyskanych wariantów z fenotypem pacjentów. Skupiła się na wieku zachorowania i głębokości ubytku słuchu opisywanego w oparciu o audiogramy pacjentów. W tym miejscu do pracy wkradł się błąd. Na stronie 77 mgr Lechowicz pisze, że Rycina 35 obrazuje głęboki stopień niedosłuchu dla grupy pacjentów i wymienia genotypy, dla których audiogramy obrazujące łagodniejsze nasilenie niedosłuchu, pokazane są na Rycinie 36 i odwrotnie. W rozdziale Omówienie wyników i dyskusja autorka z dumą stwierdza, że zastosowano nowatorskie podejście do identyfikacji przyczyn niedosłuchu. Faktycznie niezależnie od samych wyników, które są interesujące i wartościowe, największym atutem tej pracy jest zastosowany algorytm postępowania pozwalający na skuteczne wykrywanie zmian genetycznych przy jednoczesnym ograniczaniu czasochłonności i kosztochłonności badań. Algorytm ten pozwolił na przeanalizowanie w sensownym czasie genu TMPRSS3, w grupie ponad 2000 osób z niedosłuchem. W ten sposób populacja polska staje się najlepiej przebadaną populacją pod względem mutacji tego genu na świecie (na podstawie danych literaturowych). 3

mgr Urszula Lechowicz ocenia częstość mutacji genu TMPRSS3 w populacji polskich pacjentów z niedosłuchem na 1,88% (47 osób ze znalezionymi mutacjami na 2277 badanych) i porównuje to z danymi dostępnymi dla populacji holenderskiej (2/212), brytyjskiej (1/142), czy ogólnie kaukaskiej - 0,38%. Kłopot w tym, że w zasadzie tych danych nie da się dobrze porównać. Grupy badane dobrane są w różny sposób - na przykład w badaniu brytyjskim stanową je pary rodzeństw z niedosłuchem, a osoby z mutacjami genu GJB2 nie zostały z niej wykluczone. Wyłączenie osób z mutacjami genu GJB2 na etapie szacowania częstości mutacji genu TMPRSS3 uważam za niedociągnięcie. Aby ocenić częstość mutacji tego genu w populacji polskich pacjentów niesłyszących należałoby albo rozpocząć od wyjściowej grupy 10 000 osób i uwzględniać wszystkie przyczyny niedosłuchu, albo skupić się na przyczynach genetycznych niedosłuchu niesyndromicznego: wykluczyć osoby z podejrzeniem niedosłuchu syndromicznego oraz z odnotowanymi istotnymi pozagenetycznymi czynnikami ryzyka wystąpienia niedosłuchu, a uwzględnić wszystkie znane czynniki genetyczne. Biorąc pod uwagę jak częste są mutacje genu GJB2 oszacowanie udziału mutacji genu TMPRSS3 z pewnością będzie niższe i bardziej zbliżone do pozostałych badań. W dalszej części autorka podsumowuje wiedzę na temat kolejnych znalezionych wariantów zarówno wcześniej znanych jak i nowo odkrytych dyskutując ich patogenność w kontekście dotychczasowych badań, jak i na podstawie własnych doświadczeń. Szczególnie dużo miejsca poświęca nowo zidentyfikowanemu wariantowi p.m448t ze względu na jego dużą częstość w badanej próbie i postulowany mechanizm patogenności (wpływ na składanie eksonów). Ostatecznym wynikiem analiz jest przypisanie znalezionym wariantom statusu zmian ciężkich lub łagodnych, przy czym w trzech (z 13) przypadkach status ten pozostaje niejasny. Tę część pracy zamyka podsumowanie próby korelacji genotypu z fenotypem. Biorąc pod uwagę fakt, że w badanej populacji znaleziono 13 różnych mutacji i większość pacjentów stanowiły złożone heterozygoty - często pod względem dwóch mutacji o różnym statusie - korelacja taka nie była łatwa. Udało się jednak zaobserwować pewne zależności - pacjenci o tym samym geneotypie charakteryzowali się podobnym fenotypem, zaś u pacjentów z większą liczbą mutacji niszczących choroba ujawniała się wcześniej, a niedosłuch był głębszy. Pracę uzupełnia spis literatury, załącznik będący wykazem pacjentów ze stwierdzonymi mutacjami genu TMPRSS3 wraz z danymi klinicznymi oraz wykaz stosowanych skrótów. 4

Ogólnie, część merytoryczną pracy oceniam bardzo wysoko. Przebadana grupa jest imponująca, zastosowane techniki skuteczne i nowoczesne a autorka bardzo dobrze orientuje się w badanych zagadnieniach. Do uzyskanych wyników podchodzi z należytym krytycyzmem. Pod względem językowym i edytorskim praca jest dobrze opracowana. Autorce udaje się nawet uniknąć wyrażeń żargonowych. W kilku miejscach pojawia się określenie składanie genu jako synonim angielskiego określenia splicing choć lepszym jest stosowane wymiennie przez mgr Lechowicz składanie eksonów. W podsumowaniu stwierdzam, że przedstawiona mi do recenzji rozprawa mgr Urszuli Lechowicz zatytułowana Profil mutacji w genie TMPRSS3 u pacjentów z niedosłuchem stanowi oryginalne rozwiązanie istotnego problemu naukowego i spełnia wymogi art. 13 ustawy o stopniach naukowych z dnia 18 marca 2011, i może stanowić podstawę do nadania stopnia doktora. W związku z powyższym, zwracam się do Wysokiej Rady II Wydziału Lekarskiego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego o dopuszczenie Pani mgr Urszuli Lechowicz do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Jednocześnie ze względu na wysoki poziom merytoryczny pracy i zastosowany warsztat badawczy wnioskuję o wyróżnienie pracy w przyjęty przez Radę sposób. 5