RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 187937 (21) Numer zgłoszenia: 332135 (22) Data zgłoszenia: 22.03.1999 (13) B1 (51) IntCl7 C12Q 1/06 C12N 1/20 C12R 1/23 (54)Pożywka do wykrywania i oznaczania liczby komórek Lactobacillus acidophilus wmateriale biologicznym, sposób jej sporządzania oraz sposób przygotowywania materiału biologicznego do wykrywania i oznaczania w nim liczby komórek Lactobacillus acidophilus (43) Zgłoszenie ogłoszono: 25.09.2000 BUP 19/00 (45) o udzieleniu patentu ogłoszono: 30.11.2004 WUP 11/04 (73) Uprawniony z patentu: Instytut Mleczarstwa, Warszawa, PL (72) Twórcy wynalazku: Maria Kosikowska, Otwock, PL Elżbieta Jakubczyk, Warszawa, PL Stanisław Jaworski, Karczew, PL (74) Pełnomocnik: Gomólińska Małgorzata, Kancelaria Patentowa PL 187937 B1 (57) 1. Pożywka do wykrywania i oznaczania liczby komórek Lactobacillus acidophilus w materiale biologicznym o złożonym składzie mikroflory zawierająca pożywkę podstawową w skład której wchodzą pepton kazeinowy, ekstrakt drożdżowy, dwuortofosforan potasu, cytrynian amonu, Tween 80, 1-hydrat octanu sodu, siarczan magnezu, siarczan manganu, siarczan żelaza, agar, lodowaty kwas octowy i wodę oraz zawierająca komponenty selektywne, znam ienna tym, że pożywka podstawowa składa się z peptonu kazeinowego w ilości 5-10 g, ekstraktu drożdżowego w ilości 3-8 g, dwuwodoroortofosforanu potasu w ilości 4-8 g, cytrynianu amonu w ilości 2-4 g, glukozy w ilości 10-20 g, Tweenu 80 w ilości 0,15-2 g, 1-hydratu octanu sodu w ilości 10-18 g, siarczanu magnezu w ilości 0,4-0,8 g, siarczanu manganu w ilości 0,10-0,12 g, siarczanu żelaza w ilości 0,02-0,04 g, agaru w ilości 12-18 g, soku pomidorowego w ilości 10-150 ml, lodowatego kwasu octowego w ilości 0,8-1,3 ml, oraz wody w ilości 1000 ml zaś komponentami selektywnymi sątaurocholan sodu w ilości 0,05-0,15% i chlorek sodu w ilości 0,6-1,5% w stosunku do objętości pożywki.
Pożywka do wykrywania i oznaczania liczby komórek Lactobacillus acidophilus w materiale biologicznym, sposób jej sporządzania oraz sposób przygotowywania materiału biologicznego do wykrywania i oznaczania w nim liczby komórek Lactobacillus acidophilus Zastrzeżenia patentowe 1. Pożywka do wykrywania i oznaczania liczby komórek Lactobacillus acidophilus w materiale biologicznym o złożonym składzie mikroflory zawierająca pożywkę podstawową w skład której wchodzą pepton kazeinowy, ekstrakt drożdżowy, dwuortofosforan potasu, cytrynian amonu, Tween 80, 1-hydrat octanu sodu, siarczan magnezu, siarczan manganu, siarczan żelaza, agar, lodowaty kwas octowy i wodę oraz zawierająca komponenty selektywne, znamienna tym, że pożywka podstawowa składa się z peptonu kazeinowego w ilości 5-10 g, ekstraktu drożdżowego w ilości 3-8 g, dwuwodoroortofosforanu potasu w ilości 4-8 g, cytrynianu amonu w ilości 2-4 g, glukozy w ilości 10-20 g, Tweenu 80 w ilości 0,15-2 g, 1-hydratu octanu sodu w ilości 10-18 g, siarczanu magnezu w ilości 0,4-0,8 g, siarczanu manganu w ilości 0,10-0,12 g, siarczanu żelaza w ilości 0,02-0,04 g, agaru w ilości 12-18 g, soku pomidorowego w ilości 10-150 ml, lodowatego kwasu octowego w ilości 0,8-1,3 ml, oraz wody w ilości 1000 ml zaś komponentami selektywnymi są taurocholan sodu w ilości 0,05-0,15% i chlorek sodu w ilości 0,6-1,5% w stosunku do objętości pożywki. 2. Sposób sporządzania pożywki do wykrywania i oznaczania liczby komórek Lactobacillus acidophilus w materiale biologicznym, znamienny tym, że do 1 0 0 ml upłynnionej i schłodzonej do 50 ± 2 C pożywki podstawowej zawierającej pepton kazeinowy w ilości 5-10 g, ekstrakt drożdżowy w ilości 3-8 g, dwuwodoroortofosforan potasu w ilości 4-8 g, cytrynian amonu w ilości 2-4 g, glukozę w ilości 10-20 g, Tween 80 w ilości 0,15-2 g, 1-hydrat octanu sodu w ilości 10-18 g, siarczan magnezu w ilości 0,4-0,8 g, siarczan manganu 0,10-0,12 g, siarczan żelaza w ilości 0,02-0,04 g, agar w ilości 12-18 g, lodowaty kwas octowy w ilości 0,8-1,3 ml oraz wodę w ilości 1000 ml, dodaje się przed jej sterylizacją sok pomidorowy w ilości 10-150 ml, a następnie, po sterylizacji w temperaturze 117 C przez 10 minut, dodaje się wcześniej przygotowane komponenty selektywne którymi są 3%-owy wodny rozwór taurocholanu sodu w ilości 1,69-5,26 ml i 25 %-owy wodny roztwór chlorku sodu w ilości 2,45 - - 6,38 m l, miesza się i doprowadza do ph 5,7 ± 0,1. 3. Sposób przygotowywania materiału biologicznego do wykrywania i oznaczania w nim liczby komórek Lactobacillus acidophilus polegającego na posiewach dziesięciokrotnych rozcieńczeń materiału badanego do płytek Petriego, znam ienny tym, że dziesięciokrotne rozcieńczenia materiału badanego wykonuje się w 1%-owym wodnym roztworze peptonu bakteriologicznego i posiewa się je do płytek Petriego, do których następnie dodaje się wcześniej przygotowaną pożywkę z komponentami selektywnymi, miesza się i po zastygnięciu inkubuje. * * * Przedmiotem wynalazku jest pożywka do wykrywania komórek Lactobacillus acidophilus i oznaczania ich liczby w materiale biologicznym sposób jej sporządzania oraz sposób przygotowywania materiału biologicznego do wykrywania i oznaczania w nim liczby komórek Lactobacillus acidophilus. Jest ona szczególnie przydatna do określania liczby komórek Lactobacillus acidophilus w populacjach mieszanych z innymi bakteriami fermentacji mlekowej i z Bifidobacterium species, które występują w kulturach starterowych i produktach mleczarskich takich jak mleczne napoje fermentowane i niefermentowane, serki twarogowe, sery, lody i inne.
187 937 3 Z polskich opisów patentowych znane są różne podłoża do oznaczania bakterii występujących w produktach spożywczych lub do hodowli tych drobnoustrojów. I tak z polskiego opisu patentowego Nr 165425 znane jest podłoże do hodowli zawierającej bifidobakterie, składające się z laktozy w ilości 2-10 cz.wag., ekstraktu drożdżowego w ilości 0,1-3 cz.wag., cytrynianu sodu w ilości 0,3-2 cz.wag., soku z marchwi w ilości 1-5 cz.wag., colostrum w ilości 5-20 cz.wag., i/lub komponentu mlecznego w ilości 6-15 cz.wag., przy czym komponent ten składa się z odtłuszczonego mleka w proszku w ilości 3-7 cz.wag. i z koncentratu białek serwatkowych w proszku lub demineralizowanej serwatki w proszku użytych w ilości 3-8 cz.wag. i uzupełnieniem do 1 0 0 cz.wag. jest woda. Z polskiego opisu patentowego Nr 159622 znany jest sposób izolacji pałeczek Salmonella z mieszanek paszowych i ich komponentów przez kilkuetapową hodowlę. Sposób ten polega na homogenizacji w wyjałowionej destylowanej wodzie badanej próbki i po wstępnym namnożeniu we wzbogaconym bulionie hodowlę przenosi się na podłoże wybiórczo - namnażające (MK) według Muellera - Kauffmanna i prowadzi się inkubację. Następnie posiewa się na jedną płytkę zawierającą stałe podłoże różnicujące - selektywne z zielenią brylantową (BGE) według Edela i Kampelmachera i na jedną płytkę z podłożem różnicująco - selektywnym (BxLH) według Hoszowskiego i Truszczyńskiego, inkubuje się i wybiera kolonie do badań biochemicznych i serologicznych. Podłoże różnicujaco - selektywne do powyżej przedstawionego sposobu opisane jest w polskim opisie patentowym Nr 158862. Zawiera ono różne peptony i agar, wodny roztwór cukrów z czerwienią fenolow ą i wodny roztwór zieleni brylantowej. Podłoże to jest otrzymywane przez wprowadzenie przed sterylizacją do podłoża podstawowego lizyny w postaci chlorowodorku i para-amino-benzeno-sulfonamidu i po wprowadzeniu pozostałych składników, w tym sacharozy i ksylozy, dodaje się wodny roztwór tiosiarczanu sodowego z cytrynianem żelazowo-amonowym, całość m iesza się i ewentualnie koryguje ph do wartości 6,9-6,95. Z polskiego opisu patentowego Nr 158727 znane jest podłoże do oznaczania gronkowców koagulazo-dodatnich i sposób oznaczania ich w tym podłożu. Podłoże to składa się z dwóch komponentów w stanie suchym. Pierwszy komponent jest podłożem odżywczym i składa się z peptonu kefirowego, bulionu m ięsnego, ekstraktu drożdżowego, chlorku litu i agaru sproszkowanego. Drugi komponent jest podłożem selektywnym i składa się z glikolu, tellurynu potasu, sulfametazyny, pirogronianu sodu oraz zbuforowanego płynu fizjologicznego zawierającego chlorek sodu, jednozasadowy fosforan potasu, dwuzasadowy fosforan potasu oraz Tween 80 (monooleinian polioksy-etylenowo-sorbitanowy) w ilości 1,150 do 1,450 cz.wagowych w stosunku do całego podłoża w stanie suchym. Ponadto w podłożu tym występują jeszcze dwa inne komponenty w stanie suchym stanowiące podłoże różnicujące, z których jeden komponent - jako trzeci-składa się z fibrynogenu wołowego, plazmy krwi króliczej i inhibitora trypsyny z soi zaś czwarty komponent jest sproszkowanym agarem. Ponadto, z polskiego opisu patentowego Nr 153470 znany jest próbnik biologiczny do oceny liczby bakterii, przeznaczony do badań chłodziw emulsyjnych. W próbniku tym znajduje się podłoże składające się z peptonu, wyciągu mięsnego, ekstraktu drożdżowego, enzymatycznego hydrolizatu kazeiny, glukozy, sacharozy, laktozy, NaCl, M gs 0 4 7 H20, KH2P 0 4, K2HPO4, L-cystyny, L-tryptofanu oraz agar-agaru. Przedstawione powyżej rozwiązania nie są przydatne do wykrywania i izolacji komórek Lactobacillus acidophilus z materiału biologicznego będącego przykładowo fermentowanym napojem mlecznym, co jest niezbędne dla dokonania oceny wartości biologicznej takiego napoju. Z publikacji znane są sposoby oznaczania liczby komórek Lactobacillus acidophilus oparte o zróżnicowanie barwy i wyglądu kolonii lub też polegające na używaniu substancji selektywnych, które hamują wzrost drobnoustrojów towarzyszących. I tak znana jest pożywka MRS z dodatkiem 0,15 % soli żółciowych (Oxgall) hamująca wzrost towarzyszących bakterii jogurtowych za wyjątkiem niektórych szczepów Streptococcus thermophilus. Znana też jest pożywka różnicująca X-Glu-Agar, która jest jednak zbyt kosztowna do rutynowego stosowania w wymaganych badaniach jakości produktów spożywczych. Składa się ona z peptonu kazeinowego w ilości 10 g, ekstraktu drożdżowego w ilości 5 g, dwuwodorofosforanu potasu w ilości 6 g, cytrynianu amonu w ilości 2 g, dekstrozy w ilości 20 g, Tweenu 80 w ilości 1 g,
4 187 937 hydratu octanu sodu w ilości 15 g, siarczanu magnezu w ilości 0,575 g, siarczanu manganu w ilości 0,120 g, agaru w ilości 15g, lodowatego kwasu octowego w ilości 1,32 ml, siarczanu żelaza w ilości 0,034 g, 0,08 %-owego roztworu 5 - bromo - 4 chloro - 3 - indolyl - ß - D - glucopyranoside ( X-Glu) w buforze Tris w ilości 50 ml. Żadne z przedstawionych rozwiązań nie jest przydatne do rutynowego wykrywania i oznaczania liczby komórek Lactobacillus acidophilus w materiale biologicznym, w tym w kulturach starterowych i w produktach mlecznych, co jest niezbędne do oceny wartości użytkowobiologicznych używanych szczepionek zwanych kulturami starterowymi jak i samych produktów. Istota wynalazku w zakresie pożywki do wykrywania i oznaczania liczby komórek Lactobacillus acidophilus w materiale biologicznym o złożonym składzie mikroflory polega na tym, że pożywka podstawowa składa się z peptonu kazeinowego w ilości 5-10 g, ekstraktu drożdżowego w ilości 3-8 g, dwuwodoroortofosforanu potasu w ilości 4-8 g, cytrynianu amonu w ilości 2-4 g, glukozy w ilości 10-20 g, Tweenu 80 w ilości 0,15-2 g, 1-hydratu octanu sodu w ilości 10-18 g, siarczanu magnezu w ilości 0,4-0,8 g, siarczanu manganu w ilości 0,10-0,12 g, siarczanu żelaza w ilości 0,02-0,04 g, agaru w ilości 12-18 g, soku pomidorowego w ilości 10-150 ml, lodowatego kwasu octowego w ilości 0,8-1,3 ml, oraz wody w ilości 1000 ml zaś komponentami selektywnymi są taurocholan sodu w ilości 0,05-0,15% i chlorek sodu w ilości 0,6-1,5% w stosunku do objętości pożywki. Istota wynalazku w zakresie sposobu sporządzania pożywki do wykrywania i oznaczania liczby komórek Lactobacillus acidophilus w materiale biologicznym, polega na tym, że do 100 ml upłynnionej i schłodzonej do 50 ± 2 C pożywki podstawowej zawierającej pepton kazeinowy w ilości 5-10 g, ekstrakt drożdżowy w ilości 3-8 g, dwuwodoroortofosforan potasu w ilości 4-8 g, cytrynian amonu w ilości 2-4 g, glukozę w ilości 10-20 g, Tween 80 w ilości 0,15-2 g, 1-hydrat octanu sodu w ilości 10-1 8 g, siarczan magnezu w ilości 0,4-0,8 g, siarczan manganu 0,10-0,12 g, siarczan żelaza w ilości 0,02-0,04 g, agar w ilości 12-18 g, lodowaty kwas octowy w ilości 0,8-1,3 ml oraz wodę w ilości 1000 ml, dodaje się przed jej sterylizacją sok pomidorowy w ilości 10-150 ml, a następnie, po sterylizacji w temperaturze 117 C przez 10 minut, dodaje się wcześniej przygotowane komponenty selektywne którymi są 3%-owy wodny rozwór taurocholanu sodu w ilości 1,69-5,26 ml i 25%-owy wodny roztwór chlorku sodu w ilości 2,45-6,38 ml, miesza się i doprowadza do ph 5,7 ± 0,1. Istota wynalazku w zakresie sposobu przygotowywania materiału biologicznego do wykrywania i oznaczania w nim liczby komórek Lactobacillus acidophilus polega na tym, że dziesięciokrotne rozcieńczenia materiału badanego wykonuje się w 1%-owym wodnym roztworze peptonu bakteriologicznego i posiewa się je do płytek Petriego, do których następnie dodaje się wcześniej przygotowaną pożywkę z komponentami selektywnymi, miesza się i po zastygnięciu inkubuje. Opracowane rozwiązanie pozwala na uzyskanie przekraczającej 80% wykrywalności komórek Lactobacillus acidophilus w badanej próbce w opracowanej pożywce według wynalazku. W pożywce tej, w posiewach rozcieńczeń 10-4, nie rosną bakterie jogurtowe, mezofilne paciorkowce, Bifidobacterium species, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii susp. bulgaricus, gdyż pożywka ma właściwości selektywne. Przedmiot wynalazku zostanie zilustrowany w poniżej podanych przykładach: Przykład I Pożywkę według wynalazku użyto do oznaczania liczby komórek Lactobacillus acidophilus w skoncentrowanej kulturze starterowej. W celu przygotowania rozcieńczalnika i rozcieńczeń próbki rozpuszczono w 200 ml gorącej wody destylowanej 20 g peptonu bakteriologicznego, doprowadzono ph do wartości 7,2-7,4 za pomocą 0,1 N NaOH. Rozcieńczalnik rozlano miarowo po 9 ml do probówek oraz 99 ml do kolbki i wyjałowiono w temperaturze 121 C przez 15 minut. Po schłodzeniu w łaźni wodnej, do kolbki z zawartością 99 ml rozcieńczalnika dodano w sposób jałowy 1 g skoncentrowanej kultury uzyskując początkowe 100 - krotne (10'2) rozcieńczenie. Przygotowano dalsze dziesiętne rozcieńczenia dodając 1 ml rozcieńczenia początkowego do 9 ml rozcieńczalnika, aż do uzyskania rozcieńczenia 10 10. Następnie przygotowywano pożywkę. Do sporządzenia pożywki podstawowej użyto :
187 937 5 pankreatynowego hydrolizatu kazeiny 1 0 g ekstraktu drożdżowego 5 g dwuwodoroortofosforanu potasu 6 g cytrynianu amonu 2 g glukozy 20 g Tweenu 80 1 g 3 - hydrat octanu sodu 15 g siarczanu magnezu 0,6 g siarczanu manganu 0,12 g siarczanu żelaza 0,03 g agaru 15 g wody destylowanej 1000 ml lodowatego kwasu octowego 0,8 ml Powyższe składniki rozpuszczono w gorącej wodzie destylowanej a następnie dodano 100 ml przefiltrowanego soku pomidorowego i doprowadzono ph pożywki do ph 5,8 za pomocą 0,1 N NaOH. Otrzymano pożywkę podstawową, którą rozlano miarowo po 100 ml do kolbek i wyjałowiono 117 C przez 10 minut. Następnie przygotowano roztwory substancji selektywnych. W tym celu sporządzono 25%-owy wodny roztwór chlorku sodu oraz 3%-owy wodny roztwór taurocholanu sodu i wyjałowiono je w temperaturze 121 C przez 15 minut. Przygotowanie pożywki selektywnej według wynalazku polegało na dodaniu do 100 ml upłynnionej pożywki podstawowej, schłodzonej do temperatury 48 ± 2 C 3,3 ml roztworu NaCl i 4 ml roztworu taurocholanu sodu. Oznaczenia liczby komórek w badanej próbce dokonano w następujący sposób: Po 1 ml rozcieńczeń próbki 10", 10'9, 10"10 posiewano do 4 równoległych płytek Petriego, a następnie do 2 płytek z każdym rozcieńczeniem wlewano około 12 ml pożywki selektywnej, a do 2 pozostałych płytek wlewano po około 12 ml pożywki kontrolnej, którą była pożywka podstawowa bez dodatku komponentów selektywnych. Po wymieszaniu i zastygnięciu pożywek płytki inkubowano w anaerostatach w temperaturze 37 C przez 48 godzin i obliczono liczby komórek jtk/g w znany sposób. W pożywce selektywnej według wynalazku oznaczono 2,5 101 komórek/g, w pożywce kontrolnej 2,6 10 11 komórek. Tym samym wykrywalność komórek Lactobacillus acidophilus w pożywce selektywnej w porównaniu do pożywki kontrolnej wyniosła 96%. Przykład II W przykładzie tyir. wykonane jest oznaczenie liczby komórek Lactobacillus acidophilus w napoju mlecznym fermentowanym o nazwie handlowej Biojogurt, zawierającym bakterie Streptococcus thermofilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Bifidobacterium species i Lactobacillus acidophilus. Przygotowano rozcieńczalnik i rozcieńczenia próbki jak w przykładzie I. Rozlano rozcieńczalnik po 9 ml do 7 jałowych probówek i 90 ml do kolbki, wyjałowiono i schłodzono do temperatury 40 C. Następnie 10 g jałow o odważonej próbki dodano do 90 ml rozcieńczalnika uzyskując rozcieńczenie 10-1po czym sporządzono serie dziesiętnych rozcieńczeń do 10-7 przenosząc 1 ml rozcieńczonej próbki do 9 ml rozcieńczalnika. W celu wykonania oznaczeń liczby komórek Lactobacillus acidophilus po 1 ml rozcieńczeń próbki 10-4, 10-5, 10-6,10-7 posiewano do 2 równoległych płytek Petriego a następnie do płytek wlewano po około 12 ml pożywki selektywnej według wynalazku, przygotowanej jak w przykładzie I. Po wymieszaniu i zastygnięciu pożywki płytki inkubowano w anaerostatach w temperaturze 37 C przez 48 godzin i liczono kolonie oraz obliczono liczbę komórek w znany sposób. W badanej próbce oznaczono 2-107 komórek Lactobacillus acidophilus w 1 g. W badaniach mikroskopowych wyrosłych kolonii oraz w testach biochemicznych stwierdzono przynależność oznaczonych komórek do gatunku Lactobacillus acidophilus.
187 937 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.