Zmienność genomu. Przyczyny, skutki i sposoby kontroli

Zmienność genomu Przyczyny, skutki i sposoby kontroli Zmienność genomu Przez zmienność genomu (polimorfizm) rozumiemy różnice w sekwencji DNA genomowego pomiędzy osobnikami jednego gatunku. Wyróżniamy: Polimorfizm prosty występuje, jeśli w danym miejscu genomy 2 osobników różnią się pojedynczym nukleotydem (single nucleotide polymorphism SNP). Ocenia się, że pomiędzy dwojgiem ludzi różnice dotyczą jednego nukleotydu na 400. Polimorfizm złożony występuje, jeśli w danym miejscu genomy 2 osobników różnią się większym fragmentem sekwencji nukleotydów. 1

Przyczyny zmienności genomu Spontaniczne Błędy przy replikacji DNA Nieprawidłowe wbudowywanie nukleotydów Poślizg polimerazy DNA Spontaniczne przemiany chemiczne zasad azotowych (pod wpływem H 2 O) Cytozyna -> uracyl Guanina -> ksantyna Adenina -> hipoksantyna Anormalna inkorporacja nukleotydu TAGCATCGA Pol ATCGTAGCTGACGAATGC TAGCATCGA Pol ATCGTAGCTGACGAATGC TAGCATCGACTGC Pol ATCGTAGCTGACGAATGC TAGCATCGACTAC Pol ATCGTAGCTGACGAATGC Rzadka forma tautomeryczna C tworzy stabilna parę z A 1 błąd/10 4-10 5 nukl. 2

Anormalna inkorporacja nukleotydu Poślizg polimerazy DNA 3

Spontaniczne przemiany nukleotydów 100/dz./kom. 5000/dz./kom. Spontaniczne przemiany nukleotydów 4

Spontaniczne przemiany nukleotydów Typy mutacji 5

Przyczyny zmienności genomu Indukowane Czynniki fizyczne Promieniowanie UV, promieniowanie jonizujące Czynniki chemiczne Modyfikacja zasad azotowych Addukty DNA Czynniki biologiczne Niektóre wirusy Transpozony Retrotranspozony Wpływ promieniowania UV 6

Wpływ promieniowania jonizującego Bezpośrednie działanie na cząsteczki nukleotydów Cząstki wysokoenergetyczne (neutrony, cząsteczki alfa) zderzając się z atomami cząsteczek nukleotydów powoduja ich zniszczenie, lub przemianę do cząsteczek o innej budowie, np. o otwartych pierścieniach zasad azotowych. Działanie radiochemiczne Czasteczki (elektrony), lub kwanty (gamma) promieniowania doprowadzają do rozpadu cząsteczek wody, lub/i tlenu, z wutworzeniem wysoce reaktywnych wolnych rodników, np.. Rodników hydroksylowych HO, lub nadtlenowodorowych H 2 O 2, reagujących z czasteczkami zasad azotowych, co prowadzi do ich modyfikacji. Wpływ czynników chemicznych (alkilacja zasad azotowych przez metylosiarczan etylowy EMS) 7

Powstawanie adduktów DNA Powstawanie adduktów DNA 8

Powstawanie adduktów DNA Cis-platyna Addukty DNA Addukty 8-metylopsoralenu z DNA w komórkach naskórka Addukty policyklicznych węglowodorów z DNA w kom. raka sutka 9

Rzeczywista częstotliwość mutacji wynosi 1 nukleotyd an 10 9 Jesto ona tak niska dzięki istnieniu mechanizmów naprawczych usuwających mutacje w DNA Naprawa mutacji w DNA Błędnie wbudowane nukleotydy nie tworzą par Watsona-Cricka. Mutacje doprowadzają do powstania nietypowych zasad azotowych nie tworzących par Watsona-Cricka (ksantyna, hipoksantyna). Mutacje powodują powstanie zasad azotowych nie występujących w DNA (uracyl, ksantyna, hipoksantyna). Mutacje występują zwykle tylko w jednym łańcuchu DNA. Drugi łańcuch DNA zawiera prawidłową informację genetyczną. Po replikacji łańcuchy stary i nowy różnią się stopniem metylacji. 10

Korekcja błędnie wbudowanych nukleotydów TAGCATCGA Pol ATCGTAGCTGACGAATGC TAGCATCGACTA Pol ATCGTAGCTGACGAATGC Korekcja błędów w czasie replikacji DNA odbywa się dzięki posiadanej przez polimerazę DNA aktywności 3-5 egzonukleazy! Powoduje to 10-krotne zmniejszenie liczby błędów. TAGCATCGACT Pol ATCGTAGCTGACGAATGC TAGCATCGACTG Pol ATCGTAGCTGACGAATGC Naprawa uszkodzeń w DNA Deaminacja cytozyny 11

Naprawa uszkodzeń w DNA Glikozydaza (6 rodzajów) Wycięcie nieprawidłowej zasady azotowej Naprawa uszkodzeń w DNA Miejsce AP Wycięcie cząsteczki 2- deoksyrybozy przez endonukleazę AP 12

Naprawa uszkodzeń w DNA Luka w łańcuchu DNA Naprawa luki przez polimeraze DNA III i ligazę Naprawa DNA System UVR ABCD 13

System UVR ABCD System UVR ABCD 14

System UVR ABCD Zaburzenia naprawy DNA Ataxia telangiectasia Czynnik: promieniowanie gamma Nowotwory: limfoma Objawy: niezborność ruchów (ataksja), rozszerzenie naczyń krwionosnych w skórze i oczach, aberracje chromosomowe, niedobór odporności. 15

Zaburzenia naprawy DNA Xeroderma pigmentosum Czynnik: promieniowanie UV, mutageny chemiczne Nowotwory: raki skóry, czerniaki Objawy: rogowacenie skóry, wrażliwość skóry i oczu na światło słoneczne Zaburzenia naprawy DNA Syndrom Blooma Czynnik: czynniki alkilujące Nowotwory: raki, limfomy, białaczki Objawy: Wrażliwość na światło, rozszerzenie naczyń w skórze twarzy, aberracje chromosomowe Anemia Fanconiego Czynnik: czynniki sieciujące Nowotwory: białaczki Objawy: anemia hypoplastyczna, zaburzenia rozwojowe Zespół Cockayne a Czynnik: promieniowanie UV Nowotwory: różne Objawy: karłowatość, zanik siatkówki, wrażliwość na światło, progeria, głuchota 16

Rekombinacja Rekombinacja niehomologiczna 17

Transpozony Transpozycja 18

Transpozycja Skutki transpozycji 19

Retrotranspozony (LINE) LINE (long interspersed element długi element rozproszony) Retrotranspozony (SINE) Element Alu (nazwa pochodzi od znajdującej się w sekwencji retrotranspozonu sekwencji nukleotydów rozpoznawanej przez enzym restrykcyjny AluI) 20

Retrotranspozony Retrotranspozony wirusowe 21

Retrotranspozony wirusowe Rekombinacja homologiczna 22

Rekombinacja homologiczna Figura Halliday a 23

Rekombinacja homologiczna Białka rec ABCD 24

Białka rec ABCD Polimorficzne sekwencje w DNA 25

Powtarzalne sekwencje w DNA Sekwencje mikrosatelitarne (STR short tandem repeats) Motyw o długości 1-6 nukleotydów (AGAT) 8, (AT) 4 (GC) 7 (AT) 5, (AGC) 5 TGG(AGC) 7 Liczba powtórzeń motywu: 10-50 razy Długość odcinka: do 100 nukleotydów Występują w genomach z dużą częstością Ich rozmieszczenie w genomach jest równomierne Występują również w egzonach genów Sekwencja (CA) n jest sekwencją najczęściej powtarzającą się w genomie człowieka 1 element na 30 tysiecy nukleotydów Duży polimorfizm polegający na zmiennej liczbie powtórzeń Sekwencje mikrosatelitarne 26

Przykład polimorficznej sekwencji STR FGA (3 intron ludzkiego genu alfa-fibrynogenu) 4 chromosom (4q28) [TTTC] 3 TTTTTTCT[CTTT] n CTCC[TTCC] 2 Zestaw starterów: 5'-GCCCCATAGGTTTTGAACTCA-3' (CTTT strand) 5'-TGATTTGTCTGTAATTGCCAGC-3' (GAAA strand) Liczba alleli: 98 Wielkość produktu PCR: 158-314 par nukleotydów Przykłady alleli: 16.1 [TTTC] 3 TTTTTTCT[CTTT] 5 T[CTTT] 3 CTCC[TTCC] 2 (173 pn) 26.2 [TTTC] 3 TTTTTT [CTTT] 19 CTCC[TTCC] 2 (214 pn) Baza danych sekwencji STR www.cstl.nist.gov/biotech/str base/ 27

Analiza STR Powtarzalne sekwencje w DNA Sekwencje minisatelitarne (VNTR variable number of tandem repeats) Długość motywu: 9-80 nukleotydów Długość odcinka: od kilkuset do 20 tysięcy nukleotydów Jednostki powtarzające się mogą się nieznacznie różnić sekwencją Duży polimorfizm polegający na zmiennej liczbie powtorzeń Rozmieszczenie w genomie jest nierównomierne są zgrupowane w odcinkach końcowych chromosomów 28

Sekwencje minisatelitarne Sekwencje minisatelitarne Sekwencja konsensusowa - AGGATTTT 29

Polimorfizm sekwencji minisatelitarnych Polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych 30

Loci STR używane przez FBI Analiza STR 31

Elektroforeza płytowa Przykład odczytu (człowiek) 32

Elektroforeza kapilarna Polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych 33

Przykład odczytu (bydło) Analiza STR 34

Centralne Laboratorium Kryminalistyczne Centralne Laboratorium Kryminalistyczne 35

Centralne Laboratorium Kryminalistyczne Polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych 36