że aktywność apoptozy w komórkach raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Czas. Stomatol., 2006, LIX, 3 Apoptoza w komórkach raka płaskonabłonkowego jamy ustnej Krzysztof Osmola Apoptosis in the cells of squamous cell oral carcinoma Z Kliniki Chirurgii Szczękowo-Twarzowej AM im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Kierownik: prof. dr hab. med. L. Lewandowski Streszczenie Cel pracy: zbadano apoptozę w komórkach raka płaskonabłonkowego jamy ustnej u chorych z guzami o różnym stopniu zaawansowania i typie ploidii DNA. Materiał i metody: materiał stanowiły wycinki z guzów nowotworowych 51 chorych leczonych w Klinice Chirurgii Szczękowo-Twarzowej AM im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. W badaniu zastosowano cytometrię obrazową. Wyniki: analiza wyników nie wykazała zależności pomiędzy wielkością guza T, a liczbą komórek apoptotycznych. Statystycznie istotna była natomiast różnica pomiędzy stosunkiem liczby komórek w fazie S cyklu komórkowego do liczby komórek apoptotycznych w komórkach guzów o różnej ploidalności. Guzy o diploidalnych układach DNA cechowała wyższa liczba komórek apoptotycznych niż obserwowana w guzach aneuploidalnych. Podsumowanie: uzyskane wyniki pozwalają na stwierdzenie, że aktywność apoptozy w komórkach raka płaskonabłonkowego jamy ustnej jest związana z ploidalnością DNA jąder komórkowych. Summary Aim of the study: Assessment of apoptosis in the squamous cell carcinomas of the oral cavity in patients with tumors at different stages, and ploidy of DNA. Material and methods: The material consisted of tumor samples collected from 51 patients treated in the Department of Maxillofacial Surgery of the University of Medical Sciences in Poznań. The examination was performed by cytometry imaging. Results: Data analysis did not reveal any correlation between tumor size T and the number of apoptotic cells. However, statistically significant was the ratio of the number of S-phase cells to the number of apoptotic cells in tumors of various ploidy. Findings revealed that tumors with diploidal histograms are characterized by the increased number of apoptotic cells than aneuploidal tumors. Conclusion: The results obtained confirm that the intensity of apoptosis in the squamous cell carcinoma of the oral cavity is related to the ploidy of nuclei DNA. HASŁA INDEKSOWE: rak jamy ustnej, ploidia, apoptoza KEYWORDS: oral cancer, ploidy, apoptosis Wstęp Apoptoza wraz z procesem podziału komórkowego jest odpowiedzialna za utrzymywanie stałej liczby komórek organizmu poprzez eliminację komórek uszkodzonych. W przebiegu przemiany nowotworowej może dojść do zachwiania tej równowagi, np. w wyniku zaburzeń w mecha- 203

K. Osmola Czas. Stomatol., nizmie apoptozy (2). Jednym z takich zjawisk jest uodpornienie się komórki neoplazmatycznej na sygnały wywołujące apoptozę. Powoduje to gromadzenie się coraz większej liczby błędów genetycznych zaburzających cykl komórkowy. Zdaniem Kaufmana, Goresa i innych autorów (4, 8, 21) pojawia się fenotyp komórki odpornej na apoptozę. Wyłączenie komórki nowotworowej spod wpływu innych czynników sterujących przyczynia się do zwiększenia jej niezależność. Apoptoza jest zjawiskiem wieloetapowym. Na początku tego procesu swoiste sygnały wewnątrz i zewnątrzkomórkowe, ze znaczącym udziałem enzymów NUC-18 oraz DNA-za I i DNA-za II kierują komórkę na drogę apoptozy (6, 20). Nieaktywne początkowo kaspazy zapoczątkowują serię reakcji. Zmiany stężenia Ca++ pobudzają endonukleazę powodując fragmentację DNA na odcinki zawierające 180-200 par zasad. Oprócz endonukleaz aktywne są także gamma-glutamylotranspeptydazy, rybonukleazy oraz plazminogen. W drugim etapie zwanym fazą egzekucji następuje wiele zmian enzymatycznych powodujących zmniejszanie się komórki, utratę mikrokosmków i stopniowe zanikanie połączeń z sąsiednimi komórkami. Komórka stopniowo obkurcza się na skutek utraty wody. Chromatyna zaczyna się skupiać pod błoną jądrową, która uwypukla się i wraz ze skupiskiem chromatyny oddziela tworząc tzw. kule chromatynowe. Kolejno następuje rozpad cytoszkieletu przy udziale proteaz i rozpad komórki na ciałka apoptotyczne. Składają się one z otoczonych błoną jądrową fragmentów jądra komórkowego, cytoplazmy i organelli. W ostatnim etapie są one fagocytowane przez sąsiednie komórki i makrofagi. Proces ten zapobiega tworzeniu się odczynów zapalnych, jakie towarzyszą martwicy komórek. Czynnikami inicjującymi proces apoptozy, na co wskazuje wielu autorów, mogą być zjawiska fizyczne, jak promieniowanie czy szok termiczny, procesy chemiczne z wolnymi rodnikami tlenowymi lub cytostatyki oraz czynniki biologiczne: np.tnf (tumour necrosis factor), przeciwciała Fas/APO, glikokortykoidy, hormony (3, 7, 13, 15, 17). Zwraca się uwagę, że w procesie apoptozy pewne znaczenie mają również mitochondria. Uważa się, że początkowo następują zmiany potencjału elektrochemicznego ich błony. Zaburzenia te wyprzedzają fragmentację DNA. Powodują powstawanie megapor, przez które następuje utrata nukleotydów, jonów i białek. Różnica ciśnienia osmotycznego pomiędzy cytoplazmą a mitochondriami powoduje ich pęcznienie na skutek wchłaniania wody. Wytworzenie megakanałów prowadzi do uwalniania czynnika inicjującego apoptozę, tzw. AIF (Apoptosis Inducing Factor). Wyraźną rolę odgrywa również uwalnianie cytochromu c z mitochondriów komórek ulegających apoptozie, który łącząc się z apoptotyczną proteazą Apaf-1, powoduje aktywację kaspazy 9 i zmiany komórkowe (10, 14). Natomiast czynnik AIF indukuje zmiany w jądrze komórkowym. Z uwalnianiem cytochromu c i AIF z mitochondriów związane jest białko Bcl-2. Znajduje się ono w błonie jądrowej, mitochondriach i siateczce endoplazmatycznej. Blokuje ono uwalnianie cytochromu c i AIF hamując tym apoptozę. Odpowiedzialny za jego wytwarzanie gen bcl-2 występuje w niektórych nowotworach, których komórki rzadko ulegają apoptozie (16). Zastosowanie i upowszechnienie technik laserowych i cyfrowych w badaniach mikroskopowych pozwoliło na polepszenie wyników badań. W technice cytometrii obrazowej obraz mikroskopowy badanych komórek jest rejestrowany przez kamerę video i poddawany obróbce elektronicznej polegającej na rozłożeniu obrazu na piksele i pomiarze stopnia szarości. Tak analizowany obraz jest przetwarzany przez komputer w drodze tzw. progowania. Cel pracy Celem jest ocena aktywności apoptozy w komórkach raka płaskonabłonkowego jamy ustnej o różnych typach ploidii DNA w odniesieniu do wielkości guza wg klasyfikacji TNM. 204

2006, LIX, 3 Apoptoza w komórkach raka Materiał i metody Badanie wykonano u 51 chorych z rakiem błony śluzowej jamy ustnej (tab. I). Materiał tkankowy pochodził z wycinków pobranych z guza nowotworowego. Po badaniu histopatologicznym określającym budowę komórkową raka tkankę poddawano barwieniu metodą Feulgena i oceniano aktywność apoptotyczną cytometrem obrazowym MAGICAL (Joyce Loebl. England). Komórki apoptotyczne i komórki w poszczególnych fazach cyklu zliczano za pomocą programu CYT FIT. Analizę statystyczną przeprowadzono metodą Manna Whitneya. T a b e l a I. Zestawienie badanych chorych l.p. Płeć TNM APOP S PLOIDIA 1 k 2 1 0 3,857 18,627 AN 2 k 3 2b 0 6,867 16,667 AN 3 k 4 2c 0 1,178 24,083 AN 4 k 2 0 0 4,280 11,370 AN 5 k 2 1 0 2,940 10,428 AN 6 k 2 1 0 5,340 21,676 AN 7 k 3 2c 0 7,771 12,513 AN 8 k 3 2a 0 3,730 14,228 D 9 k 3 2b 0 13,649 8,571 D 10 k 3 2b 0 7,972 3,423 D 11 k 2 0 0 6,230 13,141 D 12 k 2 1 0 6,930 15,093 D 13 k 2 1 0 15,222 22,619 D 14 k 1 1 0 4,810 12,603 D 15 k 4 1 0 14,798 13,511 D 16 k 3 1 0 9,698 9,422 D 17 m 3 2c 0 7,956 10,879 AN 18 m 2 2b 0 6,100 12,217 AN 19 m 3 2c 0 6,441 12,174 AN 20 m 3 2c 0 1,340 12,359 AN 21 m 3 x 0 5,525 9,659 AN 22 m 3 2a 0 3,576 13,658 AN 23 m 2 0 0 4,000 13,096 AN 24 m 2 1 0 5,570 8,035 AN 25 m 3 1 0 4,438 12,619 AN 26 m 3 2c 0 4,465 6,647 AN 27 m 2 1 0 6,020 5,023 AN Wyniki W większości przypadków występowały guzy klasyfikujące się w grupach T 2 i T 3 (44 chorych). Tylko jeden guz miał wielkość T 1. W sześciu przypadkach rozpoznano guzy T 4. Cytometrycznie oznaczono również ploidalność DNA komórek raka i w 30 przypadkach stwierdzono układy diploidalne. Aneuploidalne były układy w komórkach 21 guzów. W badanych preparatach komórki apoptotyczne wykazywały charakterystyczne barwienie i prezentowały różne etapy przemiany chromatyny jądra komórkowego. Typowy obraz apoptotycznej c.d tab. I l.p. Płeć TNM APOP S PLOIDIA 28 m 3 2 0 6,550 10,535 AN 29 m 2 1 0 5,019 16,297 AN 30 m 4 2c 0 4,768 14,587 AN 31 m 3 1 0 11,553 9,076 D 32 m 3 2b 0 12,462 10,087 D 33 m 3 1b 0 5,570 8,035 D 34 m 3 2a 0 12,810 10,000 D 35 m 3 2a 0 6,331 7,922 D 36 m 3 2a 0 5,210 17,451 D 37 m 3 2b 0 12,120 5,430 D 38 m 2 2b 0 4,320 18,373 D 39 m 3 2c 0 12,632 23,596 D 40 m 3 2c 0 10,900 12,327 D 41 m 2 0 0 6,150 15,217 D 42 m 3 0 0 8,530 10,789 D 43 m 2 0 0 11,810 9,687 D 44 m 3 1 0 16,990 16,121 D 45 m 3 1 0 11,881 9,228 D 46 m 2 1 0 10,410 8,975 D 47 m 3 1 0 7,221 12,319 D 48 m 2 1 0 9,412 12,241 D 49 m 4 2 0 6,432 8,273 D 50 m 4 3 0 12,834 10,011 D 51 m 4 2c 0 12,460 22,927 D Legenda: APOP-apoptoza, S- faza s, An aneuploidia, D - diploidia) 205

K. Osmola Czas. Stomatol., fragmentacji jądra i charakterystycznego formowania się chromatyny obrazuje rycina 1. W cytometrycznej analizie obrazów stwierdzono różnice w nasileniu apoptozy w obrębie tego samego guza. Pewne jego strefy cechowało liczne występowanie komórek apoptycznych Ryc. 1. Fragmentacja jądra komórkowego w przebiegu apoptozy. z wyraźną fragmentacją jąder, a w innych tylko obecność pojedynczych komórek apoptotycznych (ryc. 2 i 3). Analiza liczby komórek apoptotycznych w preparatach odpowiadających grupom poszczególnych wielkości guza T nie wykazała istnienia statystycznie istotnej różnicy. Zwłaszcza w grupie guzów T 3-4 wartości były bardzo zróżnicowane (tab. II). Aktywność zjawiska apoptozy różniła się w zależności od ploidalności guza i była wyraźnie większa w guzach o diploidalnym rozkładzie DNA. Natomiast raki aneuploidalne wykazywały mniejszą liczbę komórek w fazie apotozy. Odsetek komórek apoptycznych w guzach o układach diploidalnych wynosił 8,30 ± 3,66 i był statystycznie wyższy (p<0,001) od odsetka 4,28 ± 1,66 stwierdzonego w guzach aneuploidalnych (tab. III, ryc. 4). Określono również stosunek liczby komórek w fazie S do liczby komórek apoptycznych Ryc. 2. Liczne komórki apoptotyczne w utkaniu guza diploidalnego. Pow. 1000 x. Ryc. 3. Pojedyncze komórki apoptotyczne w guzie aneuploidalnym. Pow. 400 x. 206

2006, LIX, 3 Apoptoza w komórkach raka T a b e l a I I. Liczba komórek apoptotycznych w guzach T S Ap T 1-2 10,43 (SD 6,67) 6,27 (SD 4,23) T 3-4 12,45 (SD 8,65) 8,966 (SD 6,34) p > 0,001 Legenda: Ap liczba komórek apoptotycznych, T guz, S liczba komórek w fazie S. T a b e l a I I I. Liczba komórek apoptotycznych (Ap) i w fazie S w rakach diploidalnych D i aneuploidalnych A p < 0,001 Ploidia S Ap D 13,73 (SD 5,8) 8,30 (SD 3,66) A 11,27 (SD 4,04) 4,28 (SD 1,66) Ryc. 4. Aktywność apoptozy w komórkach raków o różnej ploidalności; A aneuploidalne, D diploidalne, Apo apoptoza. (S/Apop.) w guzach diploidalnych i aneuploidalnych. Współczynnik S/Apop. był wyraźnie wyższy w guzach aneuploidalnych i wynosił 2,63:1 a w guzach diploidalnych 1,65:1, natomiast nie wykazywał istotnych statystycznie różnic w odniesieniu do wielkości guza. Omówienie Metoda cytometrii obrazowej pozwala na analizę pojedynczych komórek i morfometrię jąder komórkowych (obwód, powierzchnia, chromatyna). Zastosowanie barwienia Feulgena, barwników fluorescencyjnych, jak jodek propidyny, czy Hoechst 33258 pozwala na jednoczasową i dokładną ocenę DNA lub RNA oraz cech morfologicznych komórki nowotworowej. Ponadto umożliwia ocenę materiału tkankowego już wcześniej barwionego (1, 5, 11, 12, 22). W badanym materiale liczba komórek apoptotycznych w preparatach była podobna jak w badaniach Koha i wsp., którzy analizowali 42 przypadki raków jamy ustnej. Autorzy ci podają średnią wartość wskaźnika AI (apoptosis index 2,35) (9). Statystycznie istotna była różnica pomiędzy wartościami współczynnika S/Apop., który wyraźnie wskazywał na większą aktywność proliferacyjną komórek nowotworowych w utkaniu guzów aneuploidalnych niż diploidalnych wykazujących stosunkowo więcej form apoptotycznych. Nie stwierdzono natomiast takiej zależności w odniesieniu do wielkości T badanych guzów nowotworowych. Wielkość guza T nie korelowała również z ploidalnością DNA komórek rakowych. W obu typach ploidalności obserwowano zbliżoną liczbę przypadków prezentujących poszczególne stopnie klinicznego zaawansowania nowotworu. Problem ten jest jednak dyskutowany. Schimming i wsp. (18) badając 52 chorych z rakami jamy ustnej, stwierdzili istotny związek wielkości guza pierwotnego z ploidią. Ponadto obserwowali statystycznie istotną różnicę w występowaniu przerzutów do węzłów chłonnych. Towarzyszyły one 62% guzów aneuploidalnych, a tylko 29% diploidalnych. Natomiast nie obserwowali zależności pomiędzy ploidią a stopniem zróżnicowania histologicznego. Podobnie brak istotnej statystycznie zależności ploidii od stopnia zróżnicowania histologicznego podaje Seoane (19), stwierdzając ponadto brak zależności od płci, wieku chorych oraz lokalizacji guza. Podsumowanie Uzyskane wyniki pozwalają na stwierdzenie, że aktywność apoptozy jest wyższa w komór- 207

K. Osmola Czas. Stomatol., kach raka płaskonabłonkowego jamy ustnej o diploidalnym układzie DNA niż w komórkach o układzie aneuploidalnym. Ponadto w badanym materiale nie stwierdzono związku pomiędzy ploidalnością komórek raka a wielkością (T) guza nowotworowego. Piśmiennictwo 1. Bertino B., Knape W. A., Pytlinska M., Strauss K., Hammou J. C.: A comparative study of DNA measured by flow cytometry and image analysis in 1864 specimens. Anal. Cell Pathol., 1994, 6, 377-394. 2. Birchall M. A., Schock E., Harmon B. V., Gobe G.: Apoptosis, mitosis, PCNA and bcl-2 in normal, leukoplakic and malignant epithelia of the human oral cavity: in vivo study. Oral Oncol. 1997, 33, 6, 419-425. 3. Darzynkiewicz Z.: Apoptosis in antitumour strategies: Modulation of cell cycle or differentation. J. Cell. Biochem., 1995, 58, 151-159. 4. Hanahan D., Weinberg R. A.: The hallmarks of cancer. Cell 2000, 100, 57-70. 5. Hedley D. W., Friedlander M. K., Taylor J. W i wsp.: Method for analysis of cellular DNA content of parafin-embedded pathological material using Flow Cytometry J. Histochem. Cytochem., 1983, 31, 1333-1335. 6. Kamińska B., Stańczyk M.: Molekularne mechanizmy neurodegeneracji. Post. Biol. Kom., 1998, 25, 11, 303-318. 7. Kawiak J., Hoser G., Skórski T.: Apoptosis and some of its medical implications. Fol. Histochem. Cytobiol., 1998, 36, 99-110. 8. Kaufman S. H., Gores G. J.: Apoptosis in cancer: cause and cure. Bio Essays., 2000, 22, 1007-1017. 9. Koh J. Y., Cho N. P., Lee J. D., Yoon K.: p-53 mutations and human papillomavirus DNA in oral squamous cell carcinoma: correlation with apoptosis. Br. J. Cancer 1998, 78, 354-359. 10. Kroemer D. G.: The central executioners of apoptosis: caspases or mitochondria? Cell Biology, 1998, 8, 267-271. 11. Krygier-Stojałowska A., Tessmann D., Schutz M., Urasiński I.: Próba zastosowania metody Feulgena dla oceny czynności jądra komórkowego. Annales Acad. Med. Stetinensis, 1972, 4, 65-70. 12. Laerum O. D., Farsund T.: Clinical application of flow cytometry. Cytometry 1981, 2, 1-7. 13. Limon J., Siedlecki J. A.: Badania molekularne i cytogenetyczne w medycynie. PWN W-wa, 1998, 141-174. 14. Nunez G., London L., Hockenbery D. i wsp.: Deregulated Bcl-2 gene expression selectively prolongs survival of growth factor-deprived hemopoetic cell lines. J. Immunol., 1990, 144, 3602-3610. 15. Radziszewska E.: Fizjologiczna rola apoptozy. Post. Biol. Kom., 1995, 22, 247-263. 16. Reed L. J. C.: Double identity for proteins of Bcl-2 family. Nature 1997, 387, 773-776. 17. Rożynkowa D.: Genetyczne regulacje apoptozy programowanej śmierci komórek. Post. Biol. Kom., 1994, 21, 303-318 18. Schimming R., Hlawitschka M., Haroske G., Eckelt U.: Prognostic relevance of DNA image cytometry in oral cavity carcinomas. Anal. Quant. Cytol. Histol., 1998, 20, 1, 43-51. 19. Seoane J., Asenjo J. A., Bascones A., Valera-Centelles P. I., Romero M. A.: Flow cytometric DNA ploidy analysis of oral cancer comparison with histologic grading. Oral Oncol., 1999, 35, 266-272. 20. Sikora E.: Mechanizmy śmierci programowanej komórek (apoptozy). Post. Biochem., 1994, 40, 3, 150-160. 21. Szala S.: Swoista indukcja apoptozy w komórkach nowotworowych. Nowotwory 2000, 407, 789-795. 22. Zandona C., Budel V., Larsimont D., Petein M., Gasperin P., Pasteels J. L., Kiss D.: Digital cell image analysis of Feulgen-stained nuclei from human papillary, medullary, colloid, lobular and comedocarcinomas of the breast. Anticancer Res, 1994, 14, 2173-2182. Otrzymano: dnia 6.X.2005 r. Adres autorów: 60-355 Poznań, ul. Przybyszewskiego 49. 208