Główne szlaki transdukcji sygnału

Główne szlaki transdukcji sygnału

Dziś tylko fragment...

ligand receptora jądrowego

Spotkanie 1: - Podstawowe typy receptorów - Główne szlaki transdukcji sygnału - Metody badania kinaz i czynników transkrypcyjnych - Inhibitory transdukcji sygnału w medycynie: gleevec

Zewnątrzkomórkowe drogi przenoszące cząsteczkę sygnałową do komórki docelowej: 1. Szlak endokrynowy - jeden typ komórek wydziela cząsteczkę sygnałową która aktywuje inne komórki, często odległe - cząsteczka sygnałowa często przenoszona jest z krwią 2. Szlak parakrynowy - jeden typ komórek w tkance wydziela cząsteczki sygnałowe, które aktywują natychmiast sąsiadujące komórki - cząsteczka sygnałowa zwykle nie jest przekazywana przez układ krążeniak 3. Szlak okołokrynowy (jukstakrynowy) - związany z adhezją komórek; pobudzeniu ulega jedna z komórek lub b obie 4. Szlak autokrynowy - komórka odpowiada na swój własny sygnał (wytwarza cząsteczkę sygnałową,wydziela ją i ma na powierzchni odpowiedni receptor)

Przekaźniki II rzędu Cechy charakterystyczne: - małe cząsteczki - tworzone szybko i w dużych ilościach - aktywne przez krótki czas a następnie szybko inaktywowane przez swoiste mechanizmy - wzmacniają sygnał inicjowany przez aktywacje receptora Przykłady: - camp (cykliczny adenozynomonofosforan) - cgmp (cykliczny guanozynomonofosforan) - DAG (diacylglicerol( diacylglicerol) - IP3 (1,4,5-trifosforan inozytolu) - wapń

camp - produkowany przez cyklazy adenylanowe (9 cyklaz błonowych i 1 cytozolową) - rozkładany przez fosfodiesterazy camp - aktywuje kinazy białkowe A (PKA) i kanały jonowe zależne od camp Cyklaza adenylanowa synteza camp hydroliza camp Fosfodiesteraza camp Kofeina

Kinazy białkowe A (PKA): - kinazy Ser/Thr - jednostki katalityczne PKA mogą być transportowane do jądra gdzie fosforylują białka CREB (camp responsive element binding protein) utrzymując aktywność genów z CRE w promotorze [CREB może być fosforylowany w tym samym miejscu (ser133) przez kinazę zależną od kalmoduliny w odpowiedzi na wzrost poziomu wapnia] - różne izoformy są albo białkami cytozolowymi,, albo związanymi z cytoszkieletem, organellami i błonami

1,4,5-trifosforan inozytolu (IP3): - produkowany jest przez fosfolipazę C (PLC) z fosfatydyloinozytolu, fosfolipidu błonowego - PI3 jest hydrofilowy i po powstaniu wędruje do cytoplazmy, gdzie e wiąże się do wewnątrzkomórkowych kanałów wapniowych inicjując ich otwarcie - wzrost poziomu wapnia aktywuje kinazę białkową C (PKC) DAG - produkowany wraz z PI3 przez PLC z fosfatydyloinozytolu - wiąże się do PKC i aktywuje je Kinazy zależne od IP3 (PI3K) - kinazy zlokalizowane w błonie komórkowej aktywowana przez receptory o aktywności kinaz tyrozynowych,, integryny, receptory związane z białkami G - jej aktywacja prowadzi do aktywacji kinazy Akt (PKB) - Akt fosforyluje mtor (mammalian target of rapamycin), mediując immunosupresyjne działanie rapamycyny

Wapń - wiąże się ze swoistymi miejscami w kinazach lub z wyspecjalizowanymi białkami (np. z kalmoduliną) - jest aktywatorem wielu ważnych kinaz, np. kinaz białkowych C (PKC) i kinaz zależnych od kalmoduliny (kinaz CaM) Kinazy białkowe C (PKC) - kinazy Ser/Thr zależne od wapnia - do pełnej aktywacji potrzebują jonów Ca2+, DAG i powiązania z fosfolipidami wewnętrznej powierzchni błony, zwłaszcza z fosfatydyloseryną - w stanie nieaktywnym są białkami cytozolowym,, po pobudzeniu przechodzą na błonę - PKC mogą aktywować kinazy MAP, prowadząc np. do fosforylacji jądrowego czynnika transkrypcyjnego Elk-1 1 indukującego replikację komórek - PKC inicjują aktywność NFκB tymocyty

Kinazy zależna od wapnia i kalmoduliny (kinazy CaM) - kinazy ser/thr - mogą być monomeryczne lub oligomeryczne - wapń wiąże się do kalmoduliny zmieniając jej konformację, przez co może ona aktywować kilka klas kinaz,, między innymi kinazę fosforylującą ef2 (elongation( factor-2, niezbędny przy translacji) i CaMKII (jedną z najważniejszych kinaz w neuronach) - niektóre z kinaz CaM mogą fosforylować CREB i CBP (CREB-binding protein) przez co biorą udział w regulawanej przez wapń transkrypcji genów - niektóre mogą aktywować kinazy Akt (PKB)

cgmp - produkowany przez cyklazy guanylowe (cytozolowe lub błonowe) - rozkładany przez fosfodiesterazy cgmp - jego synteza indukowana jest np. przez NO i CO - działa poprzez - kanały jonowe regulowane przez cgmp - fosfodiesterazy regulowane przez cgmp - kinazy białkowe G (PKG) - GTPazy Kinazy białkowe G (PKG) - obecne w dużych ilościach w niektórych komórkach (np. mięśniach gładkich, płytkach krwi); w większości komórek jest ich jednak znacznie mniej niż PKAP - zbudowane z jednej jednostki - w zależności od izoformy są albo białkami cytozolowym,, albo związanymi z błoną

GTPazy 1. Małe białka G - białka monomeryczne (znanych jest ich co najmniej 20: np. ras, ) - występują w cytoplazmie - występuja w stanie aktywnym (związane z GTP) lub nieaktywnym (związane z GDP) 2. Trimeryczne białka G - związane z receptorami powierzchniowymi - zbudowane z trzech połączonych niekowalencyjnie podjednostek: α, β, γ - podjednostka α (ma aktywność GTPazy) ) występuje w kilku izoformach spełniających. odrębną funkcję w transdukcji sygnału - typy podjednostek Gα Gαs pobudza cyklazę adenylanową Gαi hamuje cyklazę adenylanową Gαo pośredniczy w zamykaniu kanałów wapniowych GαT pośredniczy w aktywacji fosfodiesteraz w fotoreceptorach

Komunikacja między komórkami A. Receptory hydrofilowe - integralne białka błonowe - ligandy są przeważnie hydrofilowe 1. Receptory połączone z białkami G związanie ligandu prowadzi do aktywacji swoistego białka G, a w konsekwencji do aktywacji cząsteczek docelowych (cyklaz( adenylanowych, fosfolipaz,, kanałów jonowych i fosfodiesteraz) 2. Receptory będące kanałami jonowymi ligand wiąże się z receptorem (białkiem kanału) i powoduje otwarcie kanału prowadząc do napływu i wypływu odpowiednich jonów 3. Receptory mające domenę kinazy związanie ligandu prowadzi do aktywacji domeny kinazowej a to z kolei prowadzi do fosforylacji substratów cytoplazmatycznych 4. Receptory aktywowane przez cytozolowe kinazy tyrozynowe kinazy Tyr zwiazane są niekowalencyjnie z receptorem powierzchniowym i ulegaja aktywacji po związaniu liganda do receptora 5. Receptory będące fosfatazami związanie liganda aktywuje domenę fosfatazy

Typy receptorów powierzchniowych With thyrosine kinase domain

Receptory będące kanałami jonowymi - białka transbłonowe regulujące przejście swoistych jonów do i z komórki - wielkość kanałów jest ograniczona a jony przechodzące muszą pozbyć się wody hydratacyjnej - ruch jonów odbywa się zgodnie z gradientem stężeń

Receptory związane z białkami G - receptory 7TM (siedem domen transbłonowych) ) z końcem aminowym na zewnątrz komórki - znanych jest co najmniej kilkaset tego typu receptorów - w stanie nieaktywnym są fosforylowane (przez PKA, PKC lub specjalna klasę kinaz GRK, G-G protein coupled receptor kinases) ) co zapobiega łączeniu się z białkami G - po związaniu ligandu przekazują sygnał poprzez aktywację trimerycznych białek G (jeden receptor może aktywować kilka białek G) Działanie trimerycznych białek G: - związanie GDP do jednostki α powoduje jej połączenie z dimerem β/γ i utworzenie nieaktywnego trimeru - kiedy ligand zwiąże się z receptorem, α łączy się z GTP, oddysocjowuje od β/γ i aktywuje cząsteczki efektorowe - aktywacja podjednostki α trwa dopóki GTP nie zostanie zhydrolizowany przez aktywność GTPazy.. Po hydrolizie GTP podjednostka α ponownie łączy się z dimerem β/γ. - cząsteczki docelowe białek G to np. cyklaza adenylanowa,, PLC, PLA2, IP3

G-protein receptor

Receptory o aktywności kinaz tyrozynowych - białka o pojedynczej domenie transbłonowej - zawierają domenę kinazy w części cytoplazmatycznej - ich ligandy to przede wszystkim różne czynniki wzrostu. np. VEGF, EGF, PDGF, NGF, FGF - sygnalizacja rozpoczyna się od związania ligandu,, co prowadzi do dimeryzacji lub oligomeryzacji receptorów i ich autofosforylacji lub krzyżowej fosforylacji - ufosforylowanie reszt tyrozyny pozwala na przyłączenie białek adaptorowych z domenami SH2 które zostają ufosforylowane i przekazują sygnał na kolejne białka. Białka adaptorowe to np. Grb-2. - Grb2 przyłącza białko GEF (zwane też SOS) i taki kompleks pobudza GTPazę Ras (prowadząc do wymiany GDP na GTP) - Aktywowany Ras aktywuje szlak kinaz MAP

Kinazy MAP - występują we wszystkich komórkach - aktywowane są poprzez fosforylację reszt serynowych, treoninowych i tyrozynowych - są kinazami cytoplazmatycznymi, ale po aktywacji mogą przechodzić do jądra gdzie g fosforylują liczne czynniki transkrypcyjne (np. c-junc jun,, ATF-2, elk-1, CHOP) - główne grupy kinaz MAP to: > ERK1/2 (p42/p44) extracellular signal-regulated protein kinase > JNK (c-jun NH2-terminal kinase) > p38 - aktywacja p38 może reguluje stabilność mrna zawierającego regiony bogate w regiony AU

Etc.

Komunikacja między komórkami B. Receptory lipofilowe - ligandy obejmują np. - steroidy - hormony tarczycy - witamina D3 - retinoidy - prostaglandyny serii D i J - ligandy są zwykle lipofilowe i przechodzą przez błonę do cytoplazmy (najczęściej są transportowane przez białka nośnikowe) - pusty receptor jest zwykle w cytozolu,, związany z innymi białkami - gdy ligand zwiąże się z receptorem, kompleks przenoszony jest do jądra gdzie e wiąże się do swoistych sekwencji DNA działając jako czynnik transkrypcyjny - niektóre puste receptory zlokalizowane są w jądrze gdzie przyłączone są do promotora genu docelowego hamując jego transkrypcję (czyli zachowują się jak represory). Związanie ligandu prowadzi do przebudowy allosterycznej receptora i aktywacji transkrypcji genu

Komórki transfekowane plazmidem reporterowym HRE-luc 300 wild-type HRE luminescence luminescence [RLU] RLU] 200 100 0 600 * control 15d-PGJ 2 control 15d-PGJ 2 normoxia hypoxia mutated HRE NS * HRE luminescence luminescence [RLU] RLU] 400 200 0 NS control 15d-PGJ 2 control 15d-PGJ 2 normoxia hypoxia

EMSA description - The gel shift or electrophoretic mobility shift assay provides a simple and rapid method for detecting DNA-binding proteins. - This method is widely used to study sequence-specific specific DNA-binding proteins such as transcription factors. - The assay is based on the observation that complexes of protein and DNA migrate through a nondenaturing polyacrylamide gel more slowly than free DNA fragments or double-stranded oligonucleotides. - The gel shift assay is performed by incubating a purified protein, or a complex mixture of proteins (such as nuclear or cell extract preparations), with a 32 P end-labeled DNA fragment containing the putative protein binding site. - The reaction products are then analyzed on a nondenaturing polyacrylamide gel. - The specificity of the DNA-binding protein for the putative binding site is established by competition experiments using unlabeled DNA fragments or oligonucleotides containing a binding site for the protein of interest or other unrelated DNA sequences.

EMSA typical results

Supershift assays can be used to assess the specificity of the retarded band. Cell extracts were processed for NF-kB gel shift analysis. Antibodies raised against either p50 (lanes( 5 and 6) or p65 (lanes( 7 and 8) were added to the cell extract before adding the probe. Supershift indicates that this proteic complex is composed of the bona fide p50-p65 p65 heterodimer.

Gel shift competition assay, using a wild-type probe and a mutated probe,, on the DNA- binding of NFkB. The radioactive probe was first mixed with an increasing excess (0, 1, 5 and 20 x) of the cold probe containing either the wild-type (lanes 1-4 and 9-12) or the mutated (lanes 4-8 and 13-16) 16) NFkB-binding consensus sequence.. EMSA was then performed with 25 µg g protein of cell extracts coming from unstimulated (lanes 1-8) of IL-1-stimulated cells (lanes 9-16).

TransAm Assay

120 100 TransAM Assay HIF-1 activity [% of control] 80 60 40 20 * * Badanie aktywności HIF-1 0 120 100 control 15d-PGJ 2 control 15d-PGJ 2 normoxia hypoxia NS HIF-1 activity [% of control] 80 60 40 20 # * NS # Kontrola specyficzności 0 control control WT-HIF1 control mut-hif1 15d-PGJ 2 15d-PGJ 2 WT-HIF1 15d-PGJ 2 mut-hif1

Badanie translokacji NFκB (przciwciała anty-p65 znakowane FITCem,, analiza przy pomocy mikroskopu konfokalnego) control 15d-PGJ 2 TNFα komórki HMEC-1

Subcellular localization of NFkB analysed by immunofluorescence and confocal microscopy in human fibroblasts stimulated or not for 20 min with 5 µg/ml of IL-1. NFkB anti-p65 antibody was labeled with FITC (green( green). Nuclei (blue) were conterstained with topo 3.

Badanie translokacji kinaz: -transfekcja komórek plazmidem kodującym białko fuzyjne PKCγ/GFP -obserwacje przyżyciowe lokalizacji świecącego białka (mikroskop konfokalny) kontrola 10 min po stymulacji IL-1β

Typy białaczek A. - Limfoidalna - Mieloidalna B. - ostra (wynika z transformacji stosunkowo niezróżnicowanych komórek progenitorowych,, z jedynie niewielkimi możliwościami dalszego różnicowania się) - przewlekła (wynika z transformacji bardziej dojrzałych komórek, które mają zdolność dalszego różnicowania się)

Chroniczna białaczka mieloidalna - chroniczna białaczka mieloidalna stanowi około 3% nowotworów u ludzi (15-20% wszystkich białaczek u dorosłych) około 1-21 2 przypadki na 100 000 osób - średnia wieku osób zdiagnozowanych to 53 lata (30% pacjentów ma ponad 60 lat, mniej niż 10% - poniżej 20 lat) - nieco częściej występuje u mężczyzn - u około połowy pacjentów przebiega bezobjawowo i zostaje wykryta a w trakcie rutynowych badań krwi - nieleczona prowadzi do śmierci - w terapii stosuje się przeszczep szpiku (dostępny dla mniej niż 20% nowo zdiagnozowanych pacjentów) oraz terapie interferonem-α - w zaawansowanym stadium choroba jest praktycznie nieuleczalna mimo m stosowania chemioterapii - ostatnio lekiem pozwalającym leczyć chroniczną białaczkę szpikową jest gleevec

Chroniczna białaczka mieloidalna - pierwszy nowotwór dla którego wykryto przyczynę genetyczną (1960 rok, Philadelphia) - chromosom Philadelphia powstaje na skutek translokacji fragmentu długiego ramienia chromosomu 9 na długie ramię chromosom 22 - aberracja ta obecna jest u 95% pacjentów z chroniczną białaczka szpikową; wystepuje tez u pacjentów z innymi typami białaczek (np. u 15-30% chorych na ostrą białaczke limfoidalną) - translokacja genu kinazy abl w pobliże regionu bcr prowadzi do powstania hybrydowego genu i fuzyjnego białka o konstytutywnej aktywności kinazy - w zalezności od miejsca translokacji białko fuzyjne moze być różnej wielkości

Diagnostyka przewlekłej białaczki mieloidalnej - u zdecydowanej większości pacjentów chromosom Philadelphia może być wykryty standardowymi metodami cytogenetycznymi - można tez stosować FISH lub RT-PCR

Normalna kinaza tyrozynowa Abl w leukocytach zwiazana jest z regulacją proliferacji komórek i ich różnicowania się Kinaza Bcr-Abl Abl,, aktywna konstytutywnie powoduje: - zwiększenie proliferacji - zahamowanie apoptozy - zmniejszenie ekspresji adhezyn (osłabienie adhezji i ogranicznie możliwości odbierania sygnałów z mikrośrodowiska szpiku)

Gleevec (imatinib) gleevec 2 -phenylaminopyrimidine derivative - pierwszy komercyjnie dostępny inhibitor kinazy tyrozynowej przeznaczony do terapii klinicznej - hamuje specyficznie kinazy Bcr-Abl (jej aktywacja powoduje przewlekłą białaczkę mieloidalną) ) oraz kinaz c-kit c (CD117) i PDGF-R blokuje proliferację i indukuje apoptozę komórek mających te kinazy - powoduje stosunkowo niewielkie efekty uboczne - istotne cofnięcie objawów choroby obserwuje się u 49% pacjentów w chronicznej fazie choroby, którzy nie odpowiedzieli na leczenie IFNα α

Kinazy hamowane przez gleevec

GIST can be divided into four major groups: - Differentiation towards smooth muscle cells. - Differentiation towards neural elements. - Dual differentiation (neural and smooth muscle). - Lacking differentiation of either cell type. Immunohistochemistry: - CD34 - c-kit gene product (CD117) - Vimentin

GIST (Gastrointestinal stromal tumors) - Common in adults aged 50-60 years. - Present as a primary tumor r or metastatic mass - 25% of GISTs are malignant. Localization: - Esophagus: 5% - Stomach: 50-70% - Small intestine: 25-40% - Colorectal: Less than 10% Therapy: - Surgery - Gleevec

GIST (Gastrointestinal stromal tumors) Mesenchymal tumours arising in the GI tract and sometimes within the abdomen without gastrointestinal connection nnection. Single or multiple tumours. Size vary between 1 to more than 20 cm. Submucosal or intramuscular mass. Usually well circumscribed but lack a true capsule. Cut surface gray to pink in colour. Areas of cystic degeneration, infarction and hemorrhage and necrosis. Prone to surface ulceration and bleeding.

Dziekuję i zapraszam za tydzień. Co warto zapamiętać: - podstawowe kinazy i wtórne przekaźniki - typy receptorów - na czym polega EMSA i transfekcja plazmidami reporterowymi - jak działa gleevec Slajdy będą dostępne w bibliotece i na stronie Fan-clubu hemoksygenazy: www.mol..mol.uj.edu.pl/~jdulak