II. ELEKTROFOREZA BIAŁEK I REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE AMINOKWASÓW I. WSTĘP Białka są liniowymi polimerami, zbudowanymi z monomerycznych jednostek, zwanych aminokwasami. Typowy α-aminokwas jest zbudowany z centralnie usytuowanego atomu węgla, określanego jako węgiel α (Cα), połączonego z pierwszorzędową grupą aminową (-NH + 3 ), grupą karboksylową (-COOH), atomem wodoru (H) i łaocuchem bocznym (R). Wyjątkiem jest prolina, która zawiera drugorzędową grupę aminową (jest to tzw. α-iminokwas). Rys. 1. Ogólny wzór aminokwasu. Cztery różne grupy połączone z tetraedrycznym atomem węgla α nadają α-aminokwasom charakter chiralny, tzn. że cząsteczki aminokwasów mogą występowad w postaci jednego z dwóch nienakładających się na siebie lustrzanych odbid nazwanych enancjomerami (rys. 2). Wyjątek stanowi glicyna, która jest achiralna, gdyż jej Cα jest związany z dwoma atomami wodoru. Rys. 2. Enancjomery L i D aminokwasów. Białka zbudowane są wyłącznie z L-aminokwasów. D-aminokwasy wstępują rzadko i można je znaleźd w ścianie komórkowej bakterii oraz w niektórych antybiotykach. Wyróżnia się 20 standardowych aminokwasów, różniących się strukturą łaocucha bocznego (grupy R), a tym samym wielkością, kształtem, ładunkiem elektrycznym, zdolnością do tworzenia wiązao wodorowych, hydrofobowością oraz reaktywnością chemiczną. Łaocuch boczny może zawierad dodatkowo grupy aminowe, karboksylowe, karboksymidowe, tiolowe, tioeterowe, hydroksylowe lub pierścienie aromatyczne.
Tab. 1. Podział aminokwasów ze względu na budowę łaocucha bocznego Aminokwasy zawierające alifatyczne łaocuchy boczne glicyna Gly, G alanina Ala, A walina Val, V leucyna Leu, L Izoleucyna Ile, I metionina Met, M Prolina Pro, P Aminokwasy z aromatycznymi łaocuchami bocznymi fenyloalanina Phe, F tyrozyna Tyr, Y Tryptofan Trp, W ` Aminokwasy zawierające alifatyczne grupy hydroksylowe seryna Ser, S treonina Thr, T Aminokwasy zawierające alifatyczne grupy tiolowe Cysteina Cys, C arginina Arg, R Aminokwasy zasadowe lizyna Lys, K histydyna His, H
Aminokwasy z bocznymi łaocuchami karboksylowymi kwas asparaginowy Asp. D kwas glutaminowy Glu, E Aminokwasy z bocznymi łaocuchami karboksyamidowymi asparagina Asn, N glutamina Gln, Q Aminokwasy stanowią grupę związków o zróżnicowanej budowie, właściwościach i funkcji. Oprócz podziału aminokwasów ze względu na budowę i właściwości łaocucha bocznego, aminokwasy możemy podzielid również ze względu na: a. występowanie i funkcje: aminokwasy białkowe będące podstawową jednostką budującą peptydy i białka aminokwasy niebiałkowe występujące w stanie wolnym aminokwasy nietypowe aminokwasy cukrotwórcze będące prekursorami węglowodanów aminokwasy tłuszczotwórcze będące prekursorami lipidów b. możliwośd syntezy przez organizm żywy: aminokwasy endogenne syntetyzowane przez określony organizm (glicyna, alanina, kwas asparaginowy, asparagina, kwas glutaminowy, glutamina, seryna, cysteina, tyrozyna, prolina) aminokwasy egzogenne nie syntetyzowane przez określony organizm (fenyloalanina, izoleucyna, leucyna, walina, lizyna, metionina, arginina, treonina, histydyna, tryptofan) Bakterie i rośliny, poza nielicznymi wyjątkami, syntetyzują wszystkie niezbędne aminokwasy, w przeciwieostwie do człowieka i zwierząt, które pewne aminokwasy muszą pobierad z pożywienia. Poza 20 aminokwasami standardowymi przedstawionymi w tabeli 1, istnieją jeszcze dwa rzadziej występujące aminokwasy kodowane genetycznie: selenocysteina i pirolizyna. Selenocysteina powstaje w wyniku chemicznej modyfikacji seryny połączonej z trna w rybosomie i jest włączana do białek przy użyciu kodonu UGA (kodon stop). Aminokwas ten występuje np. w peroksydazie glutationowej, zapobiegającej oksydacyjnemu działaniu nadtlenku wodoru w komórkach zwierzęcych. Drugi z aminokwasów pirolizyna również powstaje w wyniku modyfikacji chemicznej aminokwasu połączonego z trna i również jest włączana do białek z wykorzystaniem kodonu stop w tym przypadku UAG. W przeciwieostwie do selenocysteiny kodowanej we wszystkich organizmach żywych, pirolizyna jest spotykana w białkach syntetyzowanych przez bakterie właściwe i archeany np. w enzymach uczestniczących w produkcji metanu przez te organizmy.
W zależności od ph środowiska aminokwasy mogą występowad w formie całkowicie lub częściowo zjonizowanej. Aminokwasy występujące w formie zjonizowanej mają protonowaną grupę aminową (-NH + 3 ) oraz deprotonowaną grupę karboksylową (-COO - ). Każdy aminokwas posiada dwie grupy ulegające jonizacji: grupa α-aminowa i α-karboksylowa połączona z Cα (rys. 3a). Aminokwasy Asp, Glu, Arg, Lys, His, Cys, Tyr posiadają jeszcze dodatkową grupę w łaocuchu bocznym (rys.3b). Ze zmianami ph zmienia się stan jonizacji cząsteczki aminokwasu. Przy spadku ph dejonizacji ulega grupa karboksylowa (protonacja), natomiast przy wzroście ph, dejonizacji ulega grupa aminowa (deprotonacja) (rys. 3). Rys. 3. Własności kwasowo zasadowe aminokwasów; a) jonizacja waliny, przykład aminokwasu zawierającego tylko dwie grupy ulegające jonizacji, b) jonizacja lizyny, przykład aminokwasu zawierającego oprócz dwóch podstawowych grup ulegających jonizacji, jeszcze jedną dodatkową grupę, znajdującą się w łaocuchu bocznym. Czerwonym kolorem zaznaczono grupę α-karboksylową, niebieskim grupę α-aminową, zielonym grupę aminową w łaocuchu bocznym; w kwadratach zaznaczono wypadkowy ładunek cząsteczki aminokwasu. Punkt izoelektryczny (pi) jest to takie ph przy którym wypadkowy ładunek cząsteczki równa się zero (zaznaczono w kwadracie pogrubionym). Wartośd ph roztworu, przy którym stężenie jonu obojnaczego (cząsteczki zawierającej tą samą ilośd protonowanych grup aminowych co deprotonowanych grup karboksylowych) osiąga maksymalną wartośd, natomiast stężenia form: anionowej i kationowej mają jednakową, minimalną wartośd (wypadkowy ładunek całkowity wynosi zero), nazywamy punktem izoelektrycznym, pi. W ph poniżej pi cząsteczki mają wypadkowy ładunek dodatni, zaś powyżej ich wypadkowy ładunek jest ujemny. Własności chemiczne wspólne wszystkim aminokwasom są uwarunkowane obecnością grupy karboksylowej i aminowej. Natomiast różnice w budowie łaocucha bocznego decydują o specyficznych
własnościach fizykochemicznych i reaktywności aminokwasów. Dzięki temu niektóre aminokwasy dają charakterystyczne reakcje barwne, umożliwiające ich wykrywanie nawet w mieszaninie z innymi aminokwasami. Aminokwasy są krystalicznymi substancjami o wysokich temperaturach topnienia (ponad 200 C), w których dochodzi do ich rozkładu. Na ogół dobrze rozpuszczają się w wodzie i innych rozpuszczalnikach polarnych. W rozpuszczalnikach niepolarnych lub w mniej polarnych (np. etanol, aceton) są słabo rozpuszczalne. Rozpuszczalnośd aminokwasów bardzo silnie zależy od ph roztworu i jest najmniejsza w punkcie izoelektrycznym (pi). W silnie kwaśnych lub silnie zasadowych roztworach wodnych aminokwasy rozpuszczają się bardzo dobrze. O właściwościach hydrofobowych aminokwasów decyduje budowa łaocucha bocznego. Aminokwasy hydrofobowe, wchodzące w skład łaocuchów białkowych, wykazują tendencje do występowania wewnątrz ich struktur, w tak zwanym rdzeniu cząsteczki, w odróżnieniu od aminokwasów hydrofilowych występujących na powierzchni. Dzięki pierścieniom aromatycznym obecnym w łaocuchach bocznych niektórych aminokwasów białka (polipeptydy) mają zdolnośd pochłaniania światła w zakresie UV (tab.2). Właściwośd ta jest powszechnie wykorzystywana do pomiaru stężenia białka. Tab. 2. Właściwości spektralne aminokwasów aromatycznych molowy współczynnik absorpcji aminokwas ε *M 1cm 1+ (λ *nm+) tryptofan tyrozyna fenyloalanina 5 500 (280 nm) 1 490 (274 nm) 220 (57 nm) Poszczególne aminokwasy w białku są połączone wiązaniami peptydowymi (zwanym także amidowym), które powstają miedzy grupą α-karboksylową jednego aminokwasu i grupą α-aminową następnego aminokwasu (rys. 4a). Wiązanie peptydowe jest płaskie, tzn. sześd atomów znajduje się w tej samej płaszczyźnie: atom Cα i grupa CO z pierwszego aminokwasu oraz grupa NH i Cα z drugiego aminokwasu. Stąd też wiązanie peptydowe ma w znacznym stopniu charakter wiązania podwójnego, co zapobiega rotacji wokół niego. Swobodna rotacja jest możliwa wokół wiązao Cα-N oraz Cα-C, czyli po obu stronach wiązania peptydowego, co umożliwia ustawienie sąsiednich grup peptydowych pod różnym kątem (rys. 4b). Ze względu na sferyczne dopasowanie grup połączonych z Cα, wiązanie peptydowe prawie zawsze występuje w konfiguracji trans (wodór z grupy aminowej znajduje się w położeniu przeciwstawnym względem tlenu grupy karbonylowej). Forma cis, występuje częściej tylko w wiązaniach peptydowych w połączeniu z proliną (X-Pro).
Rys. 4. Charakterystyka wiązania peptydowego; a) tworzenie wiązania peptydowego, b) grupy peptydowe utworzone przez kolejne wiązania peptydowe. Ramką z linii przerywanej zaznaczono sztywne, płaskie grupy peptydowe utworzone poprzez wiązanie peptydowe pomiędzy grupą aminową jednego aminokwasu a grupą karboksylową drugiego aminokwasu; czerwonymi strzałkami zaznaczono wiązania, wokół których możliwa jest swobodna rotacja. Aminokwasy połączone wiązaniami peptydowymi tworzą łaocuch oligopeptydowy (do 25 połączonych ze sobą aminokwasów) lub polipeptydowy (powyżej 25 połączonych ze sobą aminokwasów). Jednostkę aminokwasu wbudowaną w ten łaocuch nazywamy resztą aminokwasową. Łaocuch aminokwasowy jest spolaryzowany, ponieważ ma różne kooce na jednym koocu znajduje się grupa α-aminowa (koniec N) a na drugim α-karboksylowa (koniec C). Jako początek łaocucha polipeptydowego umownie przyjęto jego koniec aminowy. W łaocuchu polipeptydowym jonizacji ulęgają tylko łaocuchy boczne oraz koocowa grupa aminowa i karboksylowa. pi polipeptydu wyznacza ph, przy którym suma ładunków dodatnich równa się sumie ładunków ujemnych (wypadkowa ładunków wynosi zero). Łaocuch polipeptydowy fałduje się dzięki czemu powstaje specyficzny kształt (konformacja) białka. Można wyróżnid cztery poziomy (struktury) budowy białek: pierwszorzędowa, drugorzędowa, trzeciorzędowa i czwartorzędowa. Struktura pierwszorzędowa liniowa sekwencja aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi. Sekwencję aminokwasową wyznacza kolejnośd ułożenia zasad azotowych w genie kodującym dane białko (przyp. translacja). Struktura drugorzędowa - regularne pofałdowani rejonów łaocucha polipeptydowego w trójwymiarową α-helisę (α-helix), β-strukturę (β-kartka, β-harmonijka), strukturę typu wstęgazwrot-wstega oraz pętli. Struktury te stabilizowane są słabymi wiązaniami wodorowymi pomiędzy tlenem karbonylowym jednego wiązania peptydowego a wodorem grupy aminowej innego wiązania peptydowego. W α-helisie wiązania wodorowe tworzą się w obrębie tego samego
łaocucha polipeptydowego, regularnie, pomiędzy oddalonymi od siebie o cztery reszty aminokwasowe wiązaniami peptydowymi. W β-harmonijce wiązania wodorowe powstają miedzy wiązaniami peptydowymi różnych łaocuchów polipeptydowych lub różnych części tego samego łaocucha. Łaocuchy te mogą byd ułożone równolegle (w tym samym kierunku) lub antyrównolegle (w przeciwnym kierunku). W strukturze β-zwrot jedno wiązanie wodorowe tworzy się w odstępie czterech reszt aminokwasowych, zginając łaocuch polipeptydowy o 180. Rejony łaocucha pozbawione regularnej struktury drugorzędowej przyjmują postad zwoju lub pętli. Rozerwanie wiązao wodorowych może nastąpid pod wpływem wielu czynników fizycznych i chemicznych; np. silne kwasy, zasady, wysoka temperatura, co powoduje nieodwracalne zniszczenie struktury białek, czyli tzw. denaturację. Struktura trzeciorzędowa - przestrzenne ułożenie wszystkich aminokwasów w łaocuchu polipeptydowym. Jest to biologicznie aktywna (natywna) przestrzenna konformacja wynikająca z sekwencji aminokwasów w łaocuchu. Utrzymywana dzięki oddziaływaniom hydrofobowym, siłom elektrostatycznym wiązaniom wodorowym i kowalencyjnym wiązaniom disiarczkowym (dwusiarczkowym, miedzy dwoma resztami cysteiny, tworzącymi cystynę). Siły elektrostatyczne obejmują wiązania jonowe między przeciwstawnie naładowanymi grupami i liczne słabe oddziaływania van der Waalsa między ściśle upakowanymi alifatycznymi łaocuchami bocznymi we wnętrzu białka. Struktura czwartorzędowa przestrzenne ułożenie podjednostek, z których każda składa się z ufałdowanego do struktury trzeciorzędowej łaocucha polipeptydowego. Dotyczy tylko białek zbudowanych z więcej niż jednego łaocucha polipeptydowego. Struktura ta może byd stabilizowana przez wiązania kowalencyjne (np. wiązania di siarczkowe) lub oddziaływania niekowalencyjne (siły elektrostatyczne, wiązania wodorowe, oddziaływania hydrofobowe). Ze względu na skład i złożonośd budowy białka dzielimy na proste i złożone: 1. Białka proste tzw. proteiny zbudowane wyłącznie z aminokwasów, nie zawierające składnika niebiałkowego, do których zalicza się: a. białka włókniste (skleroproteiny) strukturalne i podporowe białka tkanek charakteryzujące się dużą zawartością cysteiny i aminokwasów zasadowych oraz kolagenu i elastyny, a także proliny i hydroksyproliny, nierozpuszczalne w wodzie i rozcieoczonych roztworach soli keratyna (składnik rogów kopyt i włosów) kolagen (materiał budulcowy szkieletu) elastyna (substancja strukturalna tkanek łącznych);
b. albuminy białka obojętne, dobrze rozpuszczające się w wodzie i rozcieoczonych roztworach soli, łatwo ulegają koagulacji. Występują w tkance mięśniowej, w mleku, jajach kurzych, nasionach, w surowicy krwi (regulują ciśnienie osmotyczne); c. globuliny białka zawierające znaczne ilości kwasu asparaginowego i kwasu glutaminowego, są źle rozpuszczalne w wodzie, dobrze rozpuszczalne w rozcieoczonych roztworach soli. Występują w dużych ilościach w tkance mięśniowej i płynach ustrojowych.np. γ-globuliny - białka surowicy krwi, biorące udział w ochronie immunologicznej organizmu; d. prolaminy - białka roślinne, stanowią materiał zapasowy nasion, rozpuszczalne w 70% etanolu; e. gluteliny białka roślinne, występują w nasionach, dobrze rozpuszczalne w rozcieoczonych kwasach i zasadach; f. histony białka zasadowe, dobrze rozpuszczalne w wodzie, zawierające znaczne ilości lizyny i argininy. Występują w chromosomach, biorą udział w regulacji procesów genetycznych. g. aktyna i miozyna białka kurczliwe występujące w mięśniach h. fibrynogen białko biorące udział w procesie krzepnięcia krwi i. protaminy są silnie zasadowe, charakteryzują się dużą zawartością argininy oraz brakiem aminokwasów zawierających siarkę. Są dobrze rozpuszczalne w wodzie. Najbardziej znanymi protaminami są: klupeina, salmina, cyprynina, ezocyna, gallina. 2. Białka złożone tzw. proteidy (dawna nazwa), zbudowane są z białka i substancji niebiałkowej. a. fosfoproteiny (/-idy) zawierają reszty kwasu fosforowego (kazeina mleka, witelina żółtka jaj, ichtulina ikry ryb); b. lipoproteiny (/-idy) zawierają tłuszcze proste lub złożone np. sterydy, kwasy tłuszczowe. (występują w błonach komórek, są nośnikami cholesterolu LDL, HDL, VLDL); c. mataloproteiny (/-idy) zawierają jako kofaktor atom metalu (miedź, cynk, żelazo, wapo, magnez, molibden, kobalt), który stanowi grupę czynną wielu enzymów; występują we krwi; d. chromoproteiny(/-idy) - zawierają barwniki, np. hemoproteidy (hemoglobina, mioglobina, cytochromy, katalaza, peroksydaza) zawierające układ hemowy oraz flawoproteiny. e. Nukleoproteiny (/-idy) połączenie białek zasadowych i kwasów nukleinowych (np. rybonukleoproteidy, zlokalizowane w rybosomach, mikrosomach i mitochondriach, w niewielkich ilościach także w jądrach komórkowych). f. glikoproteiny (/-idy) zawierają cukry, np. mukopolisacharydy (w ślinie). Glikoproteidy występują też w substancji ocznej i płynie torebek stawowych.
Funkcje białek: enzymatyczne (biokatalizatory, enzymy) przyspieszają zachodzące w komórce reakcje chemiczne. Najliczniejsza grupa białek (ponad 2000) o zróżnicowanej masie cząsteczkowej; strukturalne (budulcowe) są odpowiedzialne za mechaniczną stabilnośd narządów i tkanek (kolagen, elastyna, tubulina, aktyna, a-keratyna); do białek strukturalnych zalicza się także histony pełniące kluczową rolę w upakowaniu DNA w chromatynie; transportujące np. hemoglobina uczestniczy w transporcie tlenu i CO2, niektóre białka osocza (prealbumina) transportujące hormony, transferyna przenosząca żelazo, niektóre białka błonowe np. kanały jonowe pośredniczące w transporcie jonów, nośniki w transporcie metabolitów i jonów, pompy funkcjonujące w transporcie aktywnym jonów i metabolitów; regulacyjne np. niektóre hormony (somatotropina, insulina), receptory uczestniczące w percepcji różnych cząsteczek sygnałowych; białkami regulatorowymi są także czynniki transkrypcyjne, regulujące ekspresje genów odpornościowe białka układu immunologicznego (np. immunoglobuliny) chronią organizm przed czynnikami chorobotwórczymi i ksenobiotykami (substancjami obcymi dla organizmu) motoryczne uczestniczą w procesach związanych z ruchem (aktyna, miozyna); zapasowe np. owoalbumina w białku jaja stanowi źródło aminokwasów dla rozwijającego się zarodka, ferrytyna wiąże żelazo w wątrobie, kazeina jest białkiem zapasowym mleka, niektóre białka budujące mięśnie mogą byd wykorzystywane jako materiał energetyczny; wiele białek roślinnych pełni funkcje zapasową; wzmacniające - kolagen Białka oprócz reakcji charakterystycznych dla łaocuchów bocznych wchodzących w ich skład aminokwasów, mogą dawad specyficzne reakcje dzięki obecności wiązao peptydowych. Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek: 1. Reakcja na obecnośd cysteiny i cystyny Aminokwasy siarkowe z grupami SH (cysteina) lub S-S- (cystyna) (zarówno w stanie wolnym lub związanym w białkach), podczas ogrzewania w środowisku silnie alkalicznym, przekształcając się w kwas pirogronowy, uwalniają siarkę w postaci jonów siarczkowych. Jony siarczkowe reagują z jonami ołowiu (II), dając czarny osad PbS. Dodatkowym produktem jest amoniak. Metionina nie daje dodatniego wyniku tej reakcji. 2. Reakcja na obecnośd aminokwasów aromatycznych - ksantoproteinowa Aminokwasy zawierające pierścieo aromatyczny (fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna) zarówno wolne, jak i związane w białku, ulęgają nitrowaniu podczas ogrzewania ze stężonym kwasem
azotowym. Żółte pochodne nitrowe w środowisku zasadowym tworzą sole o intensywnym zabarwieniu pomaraoczowym. 3. Reakcja na obecnośd tryptofanu Hopkinsa i Cole'a Reakcja na obecnośd układu indolowego (w tryptofanie). W środowisku kwaśnym tryptofan reaguje z aldehydami (np. kwasem glioksalowym) dając barwny produkt kondesacji. W kwaśnych hydrolizatach peptydów i białek wynik reakcji jest ujemny ponieważ podczas kwaśnej hydrolizy tryptofan ulega zniszczeniu. 4. Reakcja na obecnośd histydyny Pauly ego Pierścieo imidazolowy histydyny w środowisku zasadowym ulega sprzęganiu z jonem p- sulfobenzodiazoniowym. Produktem reakcji jest pomaraoczowy barwnik azowy. 5. Reakcja na obecnośd wolnych aminokwasów reakcja ninhydrynowa Reakcja służy do wykrywania wolnych aminokwasów (peptydy i białka dają bardzo słaby odczyn). W ph>4 aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają najpierw utlenieniu a następnie dekarboksylacji i deaminacji. W obecności powstałego amoniaku zredukowana cząsteczka ninhydryny ulega kondesacji z utlenioną cząsteczką ninhydryny i powstaje charakterystyczny fioletowoniebieski produkt. Natężenie zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia aminokwasu. W przypadku aminokwasów - proliny i hydroksyproliny, które nie zawierają grupy α aminowej produkt reakcji kondensacji ma barwę żółtą. 6. Reakcja na obecnośd białek - biuretowa Reakcja pozwala na odróżnienie białek od aminokwasów. W środowisku zasadowym następuje tautomeryzacja grup przy wiązaniu peptydowym (-CO-NH- -C(OH)=N-). Z sąsiadującymi ze sobą ugrupowaniami tego typu jony miedziowe tworzą kompleksy o barwie fioletowej. Wolne aminokwasy tworzą również kompleksy z jonami miedziowymi ale produkty takiej reakcji mają barwę niebieską. Dzięki obecności grup dysocjujących, aminokwasy i białka posiadają ładunek elektryczny, co jest podstawą ich rozdziału w procesie elektroforezy. Elektroforeza polega na ruchu naładowanych cząsteczek umieszczonych w polu elektrycznym, w środowisku przewodzącym, w kierunku odpowiednich elektrod. Szybkośd migracji białka w polu elektrycznym zależy od natężenia pola elektrycznego, wypadkowego ładunku cząsteczki i współczynnika tarcia. Elektroforezę białek można przeprowadzid w żelach poliakrylamidowych (PAGE), które działają jak sito molekularne. Cząsteczki o wymiarach małych w stosunku do wielkości porów żelu migrują łatwo, natomiast bardzo duże cząsteczki pozostają prawie nieruchome. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym zawierającym SDS (SDS-PAGE) umożliwia rozdział białek na podstawie różnic w ich
masach cząsteczkowych. Białka przed naniesieniem na żel denaturuje się, dzięki dodaniu SDS i czynnika redukującego. SDS (siarczan dodecylu) jest anionowym detergentem, który zrywa prawie wszystkie wiązania niekowalencyjne w białku oraz wiąże się z białkami nadając im wypadkowy ładunek ujemny, proporcjonalny do masy cząsteczkowej. Wiązania dwusiarczkowe są zrywane dzięki działaniu czynnika redukującego (β-merkaptoetanol lub ditiotretiol). Ruchliwośd elektroforetyczna jest liniowo odwrotnie proporcjonalna do logarytmu masy. Białka o mniejszej masie cząsteczkowej migrują szybciej. Najczęściej stosowaną metodą detekcji białek po rozdziale w żelu poliakrylamidowym jest barwienie kwaśnym alkoholowym roztworem Coomassie Brilliant Blue. Zastosowanie kwaśnego alkoholowego roztworu powoduje utrwalenie białek w żelu, co zapobiega ich wymywaniu. W wiązaniu barwnika z białkami uczestniczą wiązania van der Waalsa i wiązania jonowe. Tą metodą można wykryd 0,1-1 µg białka. Znacznie czulszą metodą jest barwienie przy użyciu AgNO 3. SDS-PAGE jest szeroko stosowaną techniką rozdziału białek. Można ją stosowad m. in. do badania jednorodności preparatu lub wyznaczania masy cząsteczkowej białek. II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA 1. Aminokwasy: budowa chemiczna- wzory, podział uwzględniający rożną polarnośd grup R, tworzenie wiązania peptydowego, jony obojnacze, punkt izoelektryczny, aktywnośd optyczna. 2. Białka: struktura I, II, III i IV-rzędowa, budowa, podział białek, klasyfikacja białek na podstawie funkcji. 3. Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek. 4. Elektroforeza: istota procesu, zasada rozdziału, warunki rozdziału. 5. Znajomośd części doświadczalnej (+ przeliczanie stężeo). III. APARATURA I SZKŁO LABORATORYJNE 1. Mały aparat do elektroforezy poliakrylamidowej białek z kompletem szklanych płytek, przekładek i grzebieniem 2. Zasilacz prądu stałego 3. Pudełko plastikowe do barwienia żelu 4. Mikropipety nastawne 20-200 µl, 2-20 µl, 20-200 µl 200-1000 µl (1 komplet / grupa / stanowisko do przygotowania żelu). 5. Mikropipety nastawne 2-20 µl, 20-200 µl ( komplet / zestaw). 6. Rękawiczki gumowe 7. Pipety szklane (5 ml 2 szt./zestaw) + tubus pipet 5 ml przy stanowisku do wylewania żeli 8. Probówki (20 ml- 20 szt.) 9. Lignina 10. Wrząca łaźnia wodna 11. Łapy 12. Nakładki na pipety do 5 ml (1 szt./zestaw)
13. Klamry metalowe (6 szt.) 14. Pipety pasterowskie 15. Zlewki (3 szt. przy stanowisku do wylewania żeli) IV. ODCZYNNIKI 1. 30 % roztwór akrylamidów (29.2 % akrylamid i 0.8 % bis-akrylamid) 2. 1.5 M Tris (ph 8.8) 3. 1 M Tris (ph 6.8) 4. 10 % SDS 5. 10 % nadsiarczan amonu 6. TEMED 7. Roztwór Coomassie Brilliant Blue R-250: 0.25 g Coomassie rozpuścid w 125 ml metanolu, dodad 100 ml H 2 O i 25 ml kwasu octowego 8. Roztwór odbarwiacza: metanol: kwas octowy: H 2 O (stosunek obj. 2:1 :7) 9. Bufor elektrodowy (10 x): Tris- 15.125 g, glicyna- 72 g, SDS- 5 g/ 0.5 L H 2 O 10. Bufor do lizy białek (2x) (przechowywad w-20 C): 1 M Tris-HCl (ph 6.8) - 1.5 ml 10 % SDS - 4.8 ml 87 % glycerol - 2. 76 ml β-merkaptoetanol - 1.2 ml H 2 O - 13.74 ml + blekit bromofenolowy 11. 0.1 % acetonowy r-r ninhydryny 12. 1 %-owe roztwory wodne aminokwasów: glicyny, cystyny, cysteiny, fenyloalaniny, tyrozyny, tryptofanu i histydyny 13. Plazma krwi bydlęcej (10 x rozc.) 14. 1 % wodny roztwór żelatyny 15. 6N roztwór wodorotlenku sodu 16. Kwas azotowy (stężony) 17. Kwas siarkowy (stężony) 18. 0.5% roztwór siarczanu miedzi 19. 2% roztwór octanu ołowiawego 20. Roztwór kwasu glioksalowego w 2.5% kwasie octowym 21. 5% roztwór azotynu sodu 22. 1 % roztwór kwasu sulfanilowego w 1 N HCl 23. 10% roztwór węglanu sodu
V. WYKONANIE DWICZENIA A. ELEKTROFOREZA BIAŁEK a. PRZYGOTOWANIE ŻELU POLIAKRYLAMIDOWEGO Przygotowad żel rozdzielający, dolny: wymieszad roztwory wg tabeli 2 i wlad mieszaninę między płytki szklane. (katalizatory polimeryzacji, nadsiarczan amonu i TEMED dodad tuż przed wlaniem mieszaniny między płytki szklane). Roztworu powinno byd tyle, aby pozostało miejsce na grzebieo i żel górny (ok. 1 cm wysokości). Na żel nawarstwid ostrożnie 0,2-0,5 ml wody (aby uniemożliwid dostęp tlenu- inhibitora polimeryzacji) i pozostawid do polimeryzacji na ok. 10-15 min. W tym czasie przygotowad żel zagęszczający, górny wg tabeli 3. (nadsiarczan i TEMED dodad tuż przed wlaniem żelu między płyty). Tab. 2. Żel rozdzielający (dolny) Koocowe stężenie żelu 12 % 10 ml H 2 O 3,3 ml 30% r-r akrylamidów 4,0 ml l.5 M Tris (ph 8.8) 2.5 ml 10% SDS 0,1 ml 10% nadsiarczan amonu 0,1 ml TEMED 0,004 ml Tab. 3. Żel zagęszczający (górny) Koocowe stężenie żelu 5 % 5 ml H 2 O 3,4 ml 30% r-r akrylamidów 0,83 ml 1M Tris (ph 6.8) 0,63 ml 10% SDS 0,05 ml 10% nadsiarczan amonu 0,05 ml TEMED 0,005 ml Po spolimeryzowaniu żelu dolnego należy usunąd wodę i wlad roztwór żelu górnego. Natychmiast włożyd grzebieo tak, aby nie pozostawid pęcherzy powietrza w żelu. Po spolimeryzowaniu żelu wyjąd grzebieo i umieścid płyty w aparacie do elektroforezy. Górny i dolny zbiornik aparatu wypełnid buforem elektrodowym (1x stężonym). Aparat podłączyd do zasilacza (górny zbiornik do katody [-+, dolny do anody *++). Po przepłukaniu studzienek buforem elektrodowym nanieśd przygotowane wcześniej próby (objętośd ustalid z prowadzącym dwiczenie).
b. PRZYGOTOWANIE PRÓB DO ELEKTROFOREZY I ROZDZIAŁ ELEKTROFORETYCZNY Do próby (osad, ekstrakt bakteryjny lub oczyszczone białko) dodad równą objętośd buforu do lizy (2x stężony), probówkę umieścid we wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Próby odwirowad (5.000 obr./min, 30 sec) i nanieśd do studzienek w żelu. Włączyd zasilacz i prowadzid rozdział elektroforetyczny przy 100 V do momentu, gdy czoło barwnika znajdzie sie na granicy żelu górnego i dolnego. Następnie zwiększyd napięcie do 150-l80V. Elektroforezę zakooczyd, gdy barwnik będzie znajdował się przy koocu żelu. c. BARWIENIE ŻELU ROZTWOREM COOMASSIE BRILLIANT BLUE R-250 Żel inkubowad z wytrząsaniem w roztworze Coomassie przez ok. 30 min. Żel odbarwiad w roztworze metanol : kwas octowy : H 2 O (w stosunku obj. 2: 1 :7) do uzyskania wyraźnych prążków. W odbarwiaczu można umieścid kawałek gąbki, która będzie pochłaniała barwnik. B. REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE a. REAKCJE NA OBECNOŚD CYSTEINY I CYSTYNY Do sześciu ponumerowanych probówek odmierzyd kolejno po 100 µl roztworów: (1) cystyny, (2) cysteiny, (3) glicyny, (4) żelatyny, (5) plazmy krwi oraz (6) próby X, a następnie do wszystkich probówek dodad po 4 krople 6N NaOH i po kropli octanu ołowiawego. Ogrzewad przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej. b. REAKCJA NA OBECNOŚD UKŁADÓW AROMATYCZNYCH (KSANTOPROTEINOWA) Do ośmiu ponumerowanych probówek odmierzyd po 2 krople stężonego kwasu azotowego, a następnie dodad po 100 µl roztworów (1) glicyny, (2) fenyloalaniny, (3) tyrozyny, (4) tryptofanu, (5) histydyny, (6) żelatyny, (7) plazmy krwi oraz (8) próby X. Probówki ogrzewad nad palnikiem do chwili wydzielania się brązowych par tlenku azotu (OSTROŻNIE, otwór probówki skierowad pod od siebie). Po ostygnięciu do każdej probówki dodad powoli kroplami, mieszając, po około 1.5 ml 6N roztworu NaOH (OSTROŻNIE reakcja egzotermiczna!). c. REAKCJA NA OBECNOŚD TRYPTOFANU (HOPKINSA I COLE'A) Do pięciu ponumerowanych probówek odmierzyd po 200 µl roztworów: (1) glicyny, (2) tryptofanu, (3) żelatyny, (4) plazmy krwi oraz (5) próby X. Do wszystkich probówek dodad po 2 krople roztworu kwasu glioksalowego, a następnie do każdej probówki dodawad ostrożnie stężony kwas siarkowy po ściance próbówki, nie mieszając. Objętośd dodanego kwasu powinna byd zbliżona do objętości roztworu wodnego w probówce. Należy zwrócid uwagę na zabarwienie, na granicy obu warstw.
d. REAKCJA NA OBECNOŚD HISTYDYNY Do pięciu ponumerowanych probówek odmierzyd po 100 µl roztworów: (1) glicyny, (2) histydyny, (3) żelatyny (4) plazmy krwi oraz (5) próby X. Do wszystkich probówek dodad po 100 µl świeżo przyrządzonej mieszaniny równych objętości roztworu azotynu sodu i roztworu kwasu sulfanilowego, a następnie po 200 µl roztworu węglanu sodu. e. REAKCJA NINHYDRYNOWA Do pięciu ponumerowanych probówek odmierzyd po 100 µl roztworów: (1) glicyny, (2) żelatyny, (3) plazmy krwi, (4) wody destylowanej oraz (5) próby X. Następnie do wszystkich probówek dodad po 100 µl roztworu ninhydryny i wstawid je na kilka minut do łaźni wodnej o temperaturze 100 C. f. REAKCJA BIURETOWA Do sześciu ponumerowanych probówek odmierzyd po 100 µl: (1) wody destylowanej, (2) glicyny, (3) histydyny, (4) żelatyny, (5) plazmy krwi oraz (6) próby X. Następnie do wszystkich probówek dodad 4 krople 6N NaOH i po jednej kropli roztworu CuSO 4. VI. WNIOSKI / SPRAWOZDANIE: a. Cel dwiczenia b. Zinterpretowad wynik rozdziału białek w żelu poliakrylamidowym. Wyjaśnid zasadę rozdzielania białek w żelu, kierunek migracji białek w żelu, rolę poszczególnych składników w buforze lizującym, w buforze elektrodowym. Na zdjęciu elektroforetycznym zaznaczyd elektrody i kierunek migracji białek w żelu. c. Opisad obserwacje i wyniki dla każdej reakcji charakterystycznej wg tabeli: w odpowiednie rubryki wpisad roztwory traktowane jako kontrola ujemna (K-) i kontrola dodatnia (K+), opisad obserwacje dla tych prób, zwrócid uwagę na zgodnośd wyniku z wiedzą teoretyczną. opisad obserwacje dla żelatyny i plazmy krwi opisad obserwacje dla próby X na podstawie obserwacji wyciągnąd wnioski dotyczące obecności/braku danego aminokwasu/białka w roztworze żelatyny i plazmie krwi oraz zidentyfikowad roztwór w próbie X
Reakcja (nazwa) Kontrola ujemna (K-) Kontrola dodatnia (K+) Żelatyna Plazma krwi Próba X Wnioski/uwagi Próba X to.