RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1933869 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:.08.06 0681394.0 (13) T3 (1) Int. Cl. A61K39/39 A61P27/00 (06.01) (06.01) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej 14..09 Europejski Biuletyn Patentowy 09/42 EP 1933869 B1 (4) Tytuł wynalazku: Zastosowanie antagonistów IL-23 i IL-17 do leczenia autoimmunologicznej zapalnej choroby oczu () Pierwszeństwo: US060837312P US00713792P 11.08.06 01.09.0 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 2.06.08 Europejski Biuletyn Patentowy 08/26 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:.06. Wiadomości Urzędu Patentowego 06/ (73) Uprawniony z patentu: Schering Corporation, Kenilworth, US The Government of the United States of America as represented by The Secretary of the Department of Health and Human Services, Rockville, US (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP 1933869 T3 CUA Daniel J., Boulder Creek, US KASTELEIN Robert A., Redwood City, US TSAI Van T., San Diego, US CASPI Rachel, Bethesda, US SILVER Phyllis, Silver Spring, US LUGER Dror, Rockville, US (74) Pełnomocnik: Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o. rzecz. pat. Tagowska Magdalena 02-770 Warszawa 1 skr. poczt. 37 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
Opis DZIEDZINA WYNALAZKU 2 3 4 0 [0001] Niniejszy wynalazek ogólnie dotyczy modulacji odpowiedzi immunologicznych w oku. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy zastosowania antagonistów interleukiny 23 (IL-23) i/lub interleukiny 17 (IL-17) do leczenia autoimmunologicznej zapalnej choroby oczu. DZIEDZINA WYNALAZKU [0002] Zapalna choroba oczu (OID, ang. ocular inflammatory disease) jest ogólnym terminem obejmującym pewną liczbę chorób i stanów, w których stan zapalny atakuje oko lub otaczające go tkanki. Nazwa diagnostyczna nadawana OID zazwyczaj odpowiada umiejscowieniu stanu zapalnego oka. Na przykład, zapalenie błony naczyniowej jest stanem zapalnym błony naczyniowej oka; zapalenie twardówki jest stanem zapalnym twardówki, zapalenie części płaskiej obrączki rzęskowej jest stanem zapalnym części płaskiej ciała rzęskowego, itd. Choroby OID powodują ból, podrażnienie i łzawienie oraz mogą powodować utratę funkcji widzenia. Na przykład, zapalenie twardówki jest trzecią co do częstości przyczyną ślepoty w krajach rozwiniętych. Choroby OID mogą być spowodowane infekcjami, chorobami nowotworowymi, ekspozycją na toksyny, odpowiedzią na zabieg chirurgiczny lub uraz oraz zaburzeniami autoimmunologicznymi. [0003] Istnieje pewna liczba chorób autoimmunologicznych, w których oko lub różne części oka stają się celem ataku zapalnego kierowanego przez układ immunologiczny. Pacjenci z OID o podłożu autoimmunologicznym (AOID) często wykazują odpowiedzi komórkowe i humoralne na antygeny siatkówki, takie jak siatkówkowa arestyna (rozpuszczalny antygen siatkówkowy, S-Ag), wiążące retinoidy białko macierzy międzyfotoreceptorowej (IRB, ang. interphotoreceptor retinoid binding protein) oraz antygeny związane z melaniną i jej metabolizmem, łącznie z GP0, MART1, TRP1 i TRP2 (Pennesi, G. i WSP. (03) J. Clin. Invest. 111:1171-1180; Gocho, K. i wsp. (01) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42: 04-09; Sugita S. i wsp., (1996) Int. Immunol. 8:799-803; Yamake, K. i wsp. (00) J. Immunol. 16 :7323-7329. Jednak w wielu przypadkach antygen(y) AOID nie są znane. [0004] Często OID jest objawem układowej choroby autoimmunologicznej, a oko jest jednym z wielu różnych narządów ciała, które są zaatakowane. Przykłady takich autoimmunologicznych chorób układowych obejmują reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń rumieniowaty układowy, zapalenie guzkowate tętnic, nawracające zapalenie wielochrząstkowe, ziarniniaka Wegenera, twardzinę skóry, chorobę Behceta, chorobę Reitera, zapalną chorobę jelit (wrzodziejące zapalenie okrężnicy i chorobę Crohna) oraz zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa. Jednak oko może być specyficznym i jedynym celem ataku chorób autoimmunologicznych, takich jak oczny bliznowaty pemfigoid, wrzód rogówki Moorena i różne postacie zapalenia błony naczyniowej. [000] AOID, takie jak zapalenie błony naczyniowej, leczy się różnymi klasami związków, włączając w to steroidy i niesteroidowe leki przeciwzapalne, takie jak deksametazon, fluorometolon, prednizolon, indometacyna, aspiryna, flubiprofen i diklofenak. Jednak, pewna liczba przypadków zapalenia błony naczyniowej nie odpowiada na te leki lub staje się na nie oporna (zobacz, np. Kulkarni, P. (01) Journal of Ocular Pharmacology And Therapeutics 17:181-187). Poza tym, te leki są związane z poważnymi działaniami ubocznymi, takimi jak zaćma, jaskra, opóźnione gojenie się ran, zmienione wytwarzanie prostaglandyn, powikłania w obrębie rogówki, zwiększone ciśnienie oczne, superinfekcje i zmniejszona odporność na zakażenia (zobacz, np. Id., na str. 181; Guidera, A.C., i wsp. (01) Ophthalmology 8:936-944; Olsen, E.G. & Davanger M. (1984) Acta Ophtalmol. 62:893-899). [0006] Ze względu na fakt, że istniejące terapie AOID mają mniejszą od optymalnej skuteczność lub dają niepożądane działania uboczne, potrzebne są nowe metody leczenia. Sugerowano, że klinicznie korzystne może być modulowanie mechanizmów immunoregulacyjnych zaangażowanych w patogenezę AOID (Caspi, R.R. (02) Int Rev Immunol 21:197-8). [0007] Te mechanizmy patogenne badano z wykorzystaniem doświadczalnego autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej (EAU, ang. experimental autoimmune uveitis), które stanowi zwierzęcy model ludzkiego autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej. EAU jest indukowane u zwierząt doświadczalnych, takich jak mysz, szczur, świnka morska, królik i małpa, poprzez immunizację antygenem siatkówki, który dawał reakcję u pacjentów z zapaleniem błony naczyniowej (np. arestyną, IRBP, rodopsyną/opsyną, fosducyną, rekoweryną), lub poprzez infuzję komórek T specyficznych dla tych antygenów. Badania z wykorzystaniem modelu EAU dostarczyły pozornie sprzecznych dowodów co do mechanizmów indukcji i postępowania choroby. Wyniki niektórych doświadczeń wskazywały, że główny szlak patogenezy w EAU wynikał z roli interleukiny 12 (IL-12) w pobudzaniu wytwarzania komórek 1
2 3 4 0 efektorowych Th1 produkujących IFN-γ (Caspi, R.R. (02) Int Rev Immunol 21: 197-8; Tarrant, T.K. i wsp., (1998) J. Immunol. 161:122-127; Caspi, R.R. (1998) Clin Immunol Immunopathol 88:4-13; Xu, H. i wsp. (1997) Cell Immunol 178:69-78). Jednak inne doświadczenia pokazały, że myszy nokautowane z niedoborem IFN-γ były podatne na EAU, oraz że EAU ulega zaostrzeniu w wyniku neutralizacji endogennego IFN-γ, a podniesione poziomy IFN-γ chroniły myszy typu dzikiego przed EAU (Caspi, R.R. i wsp. (1994) J. Immunol. 2:890-899; Jones i wsp., J. Immunol. 8:997-600; Tarrant, T.K., i wsp. (1999) J. Exp. Med. 189:219-2). [0008] Zatem, przed niniejszym wynalazkiem, nie było jasne, które szlaki immunologiczne powinny być celem dla opracowywanych terapii zapobiegania lub leczenia autoimmunologicznej zapalnej choroby oczu. PODSUMOWANIE WYNALAZKU [0009] Niniejszy wynalazek jest oparty na odkryciu, że (1) blokowanie aktywności interleukiny 23 (IL-23) lub interleukiny 17 (IL-17) zapobiega indukcji EAU; (2) po indukcji, neutralizacja aktywności IL-17 hamuje lub cofa postęp EAU, ale neutralizacja aktywności IL-23 ma mały bądź nie ma wpływu; oraz (3) aktywność IL-17 nie jest konieczna do indukcji EAU. Niniejszy wynalazek wykorzystuje antagonistów IL-23 i/lub IL-17 w sposobach i kompozycjach do leczenia lub zapobiegania autoimmunologicznej zapalnej chorobie oczu. Antagoniści ci są antagonistami albo samej docelowej cytokiny, albo funkcjonalnego receptora docelowej cytokiny. [00] IL-23 jest heterodimeryczną cytokiną składającą się z dwóch podjednostek: p19, która jest unikalna dla IL-23, i p, która jest wspólna dla IL-23 i IL-12. IL-23 pośredniczy w przekazywaniu sygnału poprzez wiązanie się do heterodimerycznego receptora, składającego się z IL-23R i IL-12Rbeta1 (IL12RB1), występującego także w receptorze IL-12. W niedawnej publikacji doniesiono, że IL-23 promuje populację komórek T charakteryzujących się wytwarzaniem IL-17, IL-17F, TNF, IL-6 i innych czynników, a komórki te nazwano komórkami Th 17 (Langrish i wsp. (0) J. Exp. Med. 1:233-2). [0011] IL-17, która początkowo była nazywana antygenem 8 związanym z cytotoksycznymi limfocytami T (CTLA8), jest homodimeryczną cytokiną, która wiąże się z IL-17RA (zwanym także jako IL17R) i IL-17C. Uważa się, że funkcjonalny receptor IL-17 jest multimerycznym kompleksem receptorów zawierającym jeden lub oba IL-17RA i IL-17RC (np. homodimer IL-17RA, homodimer IL-17RC lub heterodimer IL-17RA/IL-17RC), a możliwie także trzecie, nieznane jeszcze, białko (Toy, D. i wsp., (06) J. of Immunol. 177(1):36-39; dane nieopublikowane). [0012] W jednym z aspektów wynalazek dostarcza antagonistów IL-17 do zastosowania w leczeniu pacjentów z autoimmunologiczną zapalną chorobą oczu. Obecność AOID nie musi być zdiagnozowana bezpośrednio, ale może być wywnioskowana z diagnozy, że pacjent ma zapalenie oka, które jest przypuszczalnie o etiologii autoimmunologicznej i/lub które wykazuje jedną lub więcej cech charakterystycznych dla odpowiedzi autoimmunologicznej. Szczególnie korzystnym AOID jest autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej, np. zapalenie błony naczyniowej bez etiologii zakaźnej. [0013] Antagonista IL-17 może hamować ekspresję IL-17 lub IL17R lub IL17RC lub może hamować przekazywanie sygnału przez IL-17 oddziaływując bezpośrednio z jednym lub większą liczbą tych polipeptydów i hamując funkcjonalne oddziaływanie ligand-receptor. W pewnych korzystnych wykonaniach antagonista IL-17 jest przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała, który wiąże się z i hamuje aktywność IL-17, IL17R, albo IL17C. W jednym szczególnie korzystnym wykonaniu antagonista IL-17 jest przeciwciałem monoklonalnym, które wiąże się specyficznie z IL-17. W innych korzystnych wykonaniach antagonista IL-17 jest przeciwciałem bispecyficznym, które wiąże się z i hamuje aktywność IL-23p19 i IL-17; IL-23p19 i IL-17RA, IL-23R i IL-17; lub IL-23R i IL-17RA. W innym szczególnie korzystnym wykonaniu antagonista IL-17 jest przeciwciałem bispecyficznym, które wiąże się z i hamuje aktywność IL-23p19 i IL-17. [0014] W pewnych wykonaniach antagonista IL-17 jest podawany zgodnie z określonym trybem leczenia. Na przykład, w jednym z wykonań określona dawka antagonisty jest podawana w określonych odstępach czasu podczas pierwszego okresu leczenia, który może zakończyć się po zniknięciu jednego lub większej liczby objawów AOID, albo po określonym upływie czasu. W korzystnym wykonaniu tryb leczenia obejmuje ponadto stopniowe zmniejszanie dawki antagonisty IL-17 podczas drugiego okresu leczenia, który zaczyna się po skończeniu pierwszego okresu leczenia i kończy się, kiedy terapia antagonistą IL-17 zostaje przerwana. Czas trwania drugiego okresu leczenia typowo wynosi od jednego do dwunastu miesięcy, od jednego do dziewięciu miesięcy, od jednego do sześciu miesięcy lub od jednego do trzech miesięcy. [00] W pewnych korzystnych wykonaniach określony tryb leczenia obejmuje także podawanie pacjentowi antagonisty IL-23 podczas obu, pierwszego i drugiego, okresu leczenia lub tylko podczas drugiego okresu leczenia. Antagonista IL-23 może hamować ekspresję albo podjednostki cytokiny (IL-23p19 lub p), albo 2
2 3 4 0 podjednostki funkcjonalnego receptora (IL-23R lub IL-12beta1), albo może hamować przekazywanie sygnału przez IL-23 oddziaływując bezpośrednio z jednym lub większą liczbą tych polipeptydów zapobiegając funkcjonalnemu oddziaływaniu ligand-receptor. W pewnych korzystnych wykonaniach antagonista IL-23 jest przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała, który wiąże się z i hamuje aktywność albo IL-23p19, albo IL-23R. W jednym szczególnie korzystnym wykonaniu antagonista IL-23 jest przeciwciałem monoklonalnym, które wiąże się specyficznie z IL-23p19. [0016] Antagonista IL-23 może być podawany w określonej dawce w określonych odstępach czasu podczas jednego lub obu, pierwszego i drugiego, okresu leczenia. Dawka antagonisty IL-23 podawana podczas drugiego okresu leczenia może być mniejsza niż dawka podawana w pierwszym okresie. Również w jednym lub w obu okresach leczenia dawki antagonistów IL-17 i IL-23 mogą być takie same lub różne od siebie. Podobnie, ci dwaj antagoniści mogą być podawani w tych samych lub różnych odstępach czasu podczas okresu leczenia. Podczas drugiego okresu leczenia dawka antagonisty IL-17 może zostać zmniejszona, podczas gdy dawka antagonisty IL-23 pozostaje stała, albo dawka każdego z antagonistów może być stopniowo zmniejszana. [0017] W innych korzystnych wykonaniach dawka antagonisty IL-23 pozostaje stała podczas drugiego reżimu leczenia, a terapia antagonistą IL-23 jest kontynuowana podczas trzeciego okresu leczenia, który rozpoczyna się po skończeniu drugiego okresu leczenia (tj. kiedy terapia antagonistą IL-17 zostaje zakończona). Podczas trzeciego okresu leczenia antagonistę IL-23 można podawać w tej samej dawce i odstępach czasu, jak w drugim okresie leczenia lub można podawać w mniejszej dawce i/lub w większych odstępach czasu niż stosowane we wcześniejszym okresie. Dawka antagonisty IL-23 może także być zmniejszana stopniowo podczas trzeciego okresu leczenia. Czas trwania trzeciego okresu leczenia wynosi zazwyczaj od jednego do dwunastu, od jednego do dziewięciu miesięcy, od jednego do sześciu miesięcy lub od jednego do trzech miesięcy. [0018] W jeszcze innych wykonaniach określony tryb leczenia obejmuje także podawanie środka leczniczego, który nie jest antagonistą aktywności IL-17 lub IL-23, ale jest zdolny do złagodzenia przynajmniej jednego z objawów AOID lub przynajmniej jednego działania ubocznego antagonistów ILrI7 lub IL-23 podczas jednego lub wszystkich okresów leczenia. W pewnych korzystnych wykonaniach tym środkiem leczniczym jest steroid lub niesteroidowy środek przeciwzapalny (np. NSAID), który jest znany ze skuteczności w leczeniu zapalenia błony naczyniowej. W innych korzystnych wykonaniach celem środka leczniczego jest cytokina, która promuje odpowiedź Th1. [0019] Inny aspekt wynalazku dostarcza antagonisty jednej lub obu IL-23 i IL-17 do zastosowania w leczeniu profilaktycznym u pacjenta, który został zdiagnozowany jako podatny na autoimmunologiczny stan zapalny oczu. W pewnych korzystnych wykonaniach tej metody profilaktycznej diagnoza stwierdzająca podatność oparta jest na fakcie, że u pacjenta wystąpił uprzednio stan zapalny oczu. W innych korzystnych wykonaniach diagnoza stwierdzająca podatność oparta jest na fakcie, że u pacjenta występuje choroba układowa. Antagonistę można podawać w określonej dawce w określonych odstępach czasu podczas pierwszego okresu leczenia, który typowo kończy się po trzech miesiącach, sześciu miesiącach, dziewięciu miesiącach lub po dwóch latach leczenia antagonistą. W pewnym korzystnym wykonaniu dawka antagonisty jest stopniowo zmniejszana podczas drugiego okresu leczenia, który rozpoczyna się po skończeniu pierwszego okresu leczenia i typowo trwa od jednego do trzech miesięcy. [00] W jeszcze innym aspekcie wynalazek dostarcza antagonisty IL-23 do zastosowania w leczeniu pacjenta na autoimmunologiczną chorobę zapalną oczu. Antagonista IL-23 może być podawany w określonych odstępach czasu podczas pierwszego okresu leczenia, po którym następuje drugi okres leczenia, w którym antagonista IL-23 jest podawany w mniejszej dawce lub w większych odstępach czasu lub w stopniowo zmniejszanych dawkach. Terapia antagonistą IL-23 zazwyczaj będzie kontynuowana przez przynajmniej trzy do sześciu miesięcy, ale może trwać nawet przez 12 miesięcy, 18 miesięcy lub 24 miesiące. [0021] Innym aspektem wynalazku jest zastosowanie antagonisty IL-17 lub antagonisty IL-23 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia lub zapobiegania autoimmunologicznej chorobie zapalnej oczu (AOID) u pacjenta. W korzystnych wykonaniach kompozycja farmaceutyczna jest przeznaczona do podawania antagonisty zgodnie z dowolnym z opisanych tutaj reżimów leczenia. [0022] W jeszcze innym aspekcie wynalazek dostarcza wytworzonego produktu leczniczego do leczenia autoimmunologicznej choroby zapalnej oczu. Produkt leczniczy obejmuje (i) pierwszy preparat farmaceutyczny zawierający antagonistę IL-17; i (ii) drugi preparat farmaceutyczny zawierający antagonistę IL-23. W korzystnych wykonaniach produkt leczniczy zawiera informację o produkcie, która zawiera instrukcje podawania preparatów farmaceutycznych według dowolnego z opisanych tutaj reżimów leczenia. 3
SZCZEGÓŁOWY OPIS 1. Definicje 2 3 4 0 [0023] Aby wynalazek był bardziej zrozumiały, poniżej określono ściśle pewne techniczne i naukowe terminy. O ile nie określono ściśle tego w innym miejscu tego dokumentu, wszystkie inne techniczne i naukowe terminy tutaj stosowane mają znaczenie powszechnie przyjmowane przez specjalistę w dziedzinie, do której należy ten wynalazek, kiedy są używane w podobnych kontekstach jak niniejszym. [0024] Stosowane tutaj, włączając w to załączone zastrzeżenia, formy słów w liczbie pojedynczej, takie jak np. jakiś oraz ten, obejmują odpowiadające im odnośniki w liczbie mnogiej, chyba że kontekst wyraźnie wskazuje inaczej. [002] Antagonista oznacza dowolną cząsteczkę, która może zapobiegać, neutralizować, hamować lub zmniejszać docelową aktywność, tj. aktywność cytokin takich jak IL-17 lub IL-23, in vitro albo in vivo. Antagoniści cytokin obejmują, ale nie ograniczają się do antagonistycznych przeciwciał, peptydów, peptydomimetyków i polipeptydów, które wiążą się z cytokiną (lub dowolną z jej podjednostek) lub jej funkcjonalnym receptorem (lub dowolną z jego podjednostek) w sposób, który ingeruje w przekazywanie sygnału przez cytokinę i aktywność cząsteczek będących następnymi na szlaku przekazywania sygnału. Przykłady antagonistów peptydu i polipeptydu obejmują skrócone wersje lub fragmenty receptora cytokiny (np. rozpuszczalne domeny pozakomórkowe), które wiążą się z cytokiną w sposób, który albo zmniejsza ilość cytokiny zdolnej do wiązania się z jej funkcjonalnym receptorem, albo w inny sposób zapobiega wiązaniu się cytokiny z jej funkcjonalnym receptorem. Antagoniści obejmują także cząsteczki, które zapobiegają ekspresji dowolnej podjednostki, która zawiera cytokinę lub jej receptor; takie jak, na przykład, oligonukleotydy antysensowne, których celem jest mrna, i interferujący informacyjny RNA (zobacz, np. Arenz i Schepers (03) Naturwissenschaften 90:34-39; Sazani i Kole (03) J. Clin. Invest. 112:481-486; Pirollo, i wsp. (03) Pharmacol. Therapeutics 99:-77; Wang, i wsp. (03) Antisense Nucl. Acid Drug Devel. 13:169-189). Działanie hamujące antagonisty można zmierzyć za pomocą rutynowych technik. Na przykład, aby określić działanie hamujące wobec aktywności indukowanej przez cytokinę, ludzkie komórki wykazujące ekspresję funkcjonalnego receptora dla cytokiny traktuje się cytokiną i w obecności lub nieobecności potencjalnego antagonisty mierzy się ekspresję genów, o których wiadomo, że są aktywowane lub hamowane przez tę cytokinę. Antagoniści użyteczni w niniejszym wynalazku, hamują docelową aktywność o około 2%, korzystnie o około 0%, bardziej korzystnie o około 7%, a najkorzystniej o około 90% w porównaniu z odpowiednią kontrolą. [0026] Przeciwciało odnosi się do dowolnej formy przeciwciała, która wykazuje pożądaną aktywność biologiczną, taką jak hamowanie wiązania liganda do jego receptora, lub hamowanie indukowanego ligandem przekazywania sygnału przez receptor. Zatem, termin przeciwciało jest stosowany w najszerszym znaczeniu i w szczególności obejmuje, ale nie ogranicza się do przeciwciał monoklonalnych (włączając w to przeciwciała monoklonalne o pełnej długości), przeciwciał poliklonalnych i przeciwciał multispecyficznych (np. przeciwciał bispecyficznych). [0027] Fragment przeciwciała i fragment wiążący przeciwciała oznaczają fragmenty wiążące antygen i analogi przeciwciał, typowo obejmujące przynajmniej część regionów wiążących antygen lub regionów zmiennych (np. jeden lub więcej CDR) przeciwciała macierzystego. Fragment przeciwciała zachowuje przynajmniej część swoistości wiązania przeciwciała macierzystego. Zazwyczaj, fragment przeciwciała zachowuje przynajmniej % macierzystej aktywności wiązania, kiedy ta aktywność jest wyrażona w oparciu o liczbę moli. Korzystnie, fragment przeciwciała zachowuje przynajmniej %, 0%, 70%, 80%, 90%, 9% lub 0% lub więcej powinowactwa wiązania do cząsteczki docelowej właściwego dla przeciwciała macierzystego. Przykłady fragmentów przeciwciał obejmują, ale nie ograniczają się do fragmentów Fab, Fab', F(ab') 2 i Fv; diciał; liniowych przeciwciał; cząsteczek przeciwciał jednołańcuchowych, np. sc-fv; przeciwciał multispecyficznych utworzonych z fragmentów przeciwciał. Przegląd zaprojektowanych wariantów przeciwciał jest przedstawiony w Holliger i Hudson (0) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136. [0028] Fragment Fab składa się z jednego łańcucha lekkiego oraz C H 1 i regionów zmiennych jednego łańcucha ciężkiego. Łańcuch ciężki cząsteczki Fab nie może tworzyć wiązania dwusiarczkowego z inną cząsteczką łańcucha ciężkiego. [0029] Region Fc zawiera dwa fragmenty łańcucha ciężkiego obejmujące domeny C H 1 i C H 2 przeciwciała. Dwa fragmenty łańcucha ciężkiego są połączone razem dwoma lub większą liczbą wiązań dwusiarczkowych i poprzez oddziaływania hydrofobowe domen CH3. [00] Fragment Fab' zawiera jeden łańcuch lekki i część jednego łańcucha ciężkiego, która zawiera domenę V H i domenę C H 1, a także region pomiędzy domenami C H 1 i C H 2, tak że wiązanie dwusiarczkowe 4
2 3 4 0 pomiędzy łańcuchami może być utworzone pomiędzy dwoma łańcuchami ciężkimi dwóch fragmentów Fab' z wytworzeniem cząsteczki F(ab') 2. [0031] Fragment F(ab') 2 zawiera dwa łańcuchy lekkie i dwa łańcuchy ciężkie zawierające część regionu stałego pomiędzy domenami C H 1 i C H 2, tak że wiązanie dwusiarczkowe pomiędzy łańcuchami tworzy się pomiędzy dwoma łańcuchami ciężkimi. Fragment F(ab') 2 składa się zatem z dwóch fragmentów Fab', które są połączone razem wiązaniem dwusiarczkowym pomiędzy dwoma łańcuchami ciężkimi. [0032] Region Fv obejmuje regiony zmienne zarówno łańcuchów ciężkich, jak i lekkich, ale brak w nim regionów stałych. [0033] Jednołańcuchowe przeciwciało Fv (przeciwciało Fv o pojedynczym łańcuchu lub przeciwciało scfv ) odnosi się do fragmentów przeciwciał zawierających domeny V H i V L przeciwciała, przy czym te domeny są obecne w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym. Ogólnie, polipeptyd Fv zawiera również łącznik polipeptydowy pomiędzy domenami V H i V L, który umożliwia scfv utworzenie pożądanej struktury do wiązania antygenu. Omówienie scfv można znaleźć w Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, tom 113, pod red. Rosenburg i Moore Springer-Verlag, Nowy Jork, str. 269-3. Zobacz także publikację międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 88/01649 i patenty USA nr 4946778 i 2603. [0034] Diciało jest małym fragmentem przeciwciała z dwoma miejscami wiążącymi antygen. Fragmenty zawierają domenę zmienną łańcucha ciężkiego (V H ) połączoną z domeną zmienną łańcucha lekkiego (V L ) w tym samym łańcuchu polipeptydowym (V H -V L lub V L -V H ). Dzięki użyciu łącznika, który jest zbyt krótki, aby pozwolić na parowanie pomiędzy dwoma domenami tego samego łańcucha, domeny są zmuszone parować się z komplementarnymi domenami innego łańcucha z wytworzeniem dwóch miejsc wiązania antygenu. Diciała są opisane obszerniej w np. EP 97; WO 93/11161 oraz Holliger i wsp. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. [003] Fragment przeciwciała obejmujący domenę jest immunologicznie funkcjonalnym fragmentem immunoglobuliny zawierającym tylko region zmienny łańcucha ciężkiego lub region zmienny łańcucha lekkiego. W pewnych przypadkach dwa lub większa liczba regionów V H jest kowalencyjnie połączona z łącznikiem peptydowym, tworząc fragment przeciwciała będący dwuwartościową domeną. Dwa regiony V H fragmentu przeciwciała będącego dwuwartościową domeną mogą wiązać ten sam lub różne antygeny. [0036] Autoimmunologiczna choroba zapalna oczu (AOID) oznacza dowolną chorobę lub stan, w którym (a) stan zapalny obecny jest w dowolnej części oka lub otaczających tkankach (włączając nerw wzrokowy, naczynia krwionośne, mięśnie) i (b) stan zapalny jest częścią odpowiedzi immunologicznej, która wymaga lub jest powodowana przez jedną lub obie IL-23 i IL-17. Stan zapalny wewnątrz oka bez etiologii zakaźnej jest typowo uważany za AOID. Nieograniczające przykłady AOID są wymienione poniżej. [0037] Retinochoroidopatia typu birdshot (BSRC, ang. birdshot retinochoriodopathy): przewlekła choroba zapalna wewnątrz oka dotykająca głównie tylną (posterior) część oka. BSRC wyróżnia się spośród innych postaci zapalenia tylnego odcinka błony naczyniowej, które mają silny związek z antygenem HLA-A29.2. Jej etiologia pozostaje nieznana. Mechanizm autoimmunologiczny prawdopodobnie odgrywa ważną rolę w patogenezie. [0038] Bliznowaciejący pemfigoid oka (OCP, ang. ocular cicatricial pemphigoid): Układowa choroba autoimmunologiczna. Coraz liczniejsze dowody potwierdzają koncepcję dysfunkcji regulacji immunologicznej: przeciwciała są skierowane przeciwko strefie błony podstawnej (BMZ) spojówki i innych błon śluzowych pochodzących od nabłonka wielowarstwowego płaskiego i ewentualnie od skóry. OCP jest chorobą grożącą utratą wzroku, która zazwyczaj wymaga leczenia środkami immunosupresyjnymi. [0039] Zapalenie rogówki, obwodowe wrzodziejące zapalenie rogówki: zapalenie rogówki jest stanem zapalnym rogówki, zewnętrznej, przezroczystej, kopulastej struktury, która tworzy z przodu większą część zewnętrznej powłoki oka. Jeśli na obwodzie rogówki rozwiną się wrzody, określa się ją jako obwodowe wrzodziejące zapalenie rogówki. [00] Współczulne zapalenie naczyniówki jest AOID, w której uraz jednego oka powoduje w późniejszym czasie destrukcyjne zapalenie w drugim ( współczującym ) oku, wyraźnie na skutek odpowiedzi autoimmunologicznej na antygeny uwalniane z uszkodzonego oka. [0041] Vogt-Koyanagi Harada (VKH): zespół Vogt-Koyanagi-Harada (VKH), wcześniej znany jako zespół naczyniówkowo-oponowy, jest zaburzeniem układowym obejmującym wiele układów narządów, włączając w to układy oczny, słuchowy, nerwowy i powłokowy (skórny). Ciężkie dwustronne zapalenie całej błony naczyniowej oka związane z akumulacją płynu pod siatkówką jest objawem charakterystycznym dla VKH ocznego. [0042] Związane z różnobarwnością zapalenie tęczówki i ciała rzęskowego Fuchsa: Przewlekłe, jednostronne zapalenie odcinka przedniego błony naczyniowej charakteryzujące się różnobarwnością
2 3 4 0 tęczówki, stanem, w którym jedno oko jest innego koloru niż drugie. Zapalenie błony naczyniowej typowo pojawia się w oku o jaśniejszym kolorze u młodych osób dorosłych. [0043] Związek wiążący odnosi się do cząsteczki, małej cząsteczki, makrocząsteczki, przeciwciała, jego fragmentu lub analogu, albo rozpuszczalnego receptora zdolnego wiązać się ze specyficznym celem. Związek wiążący odnosi się także do dowolnego związku spośród następujących, które są zdolne wiązać się ze specyficznym celem: kompleksu cząsteczek (np. niekowalencyjnego kompleksu cząsteczek), cząsteczki zjonizowanej i kowalencyjnie lub niekowalencyjnie zmodyfikowanej cząsteczki (np. zmodyfikowanej poprzez fosforylację, acylację, sieciowanie, cyklizację lub ograniczone cięcie). W przypadkach, gdzie związek wiążący można rozpuścić lub zawiesić w roztworze, wiązanie można zdefiniować jako połączenie związku wiążącego z celem, przy czym połączenie skutkuje zmniejszeniem normalnych ruchów Browna związku wiążącego. [0044] Kompozycja wiążąca odnosi się do związku wiążącego w połączeniu z przynajmniej jedną inną substancją, taką jak stabilizator, zaróbka, sól, bufor, rozpuszczalnik lub dodatek. [004] Przeciwciało bispecyficzne oznacza przeciwciało, które ma dwa miejsca wiążące antygen, wykazujace specyficzność dla dwóch różnych epitopów, które mogą być na tym samym antygenie lub na dwóch różnych antygenach. Termin przeciwciała bispecyficzne obejmuje fragmenty przeciwciał bispecyficznych. Zobacz np. Holliger i wsp. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 90: 6444-48, Gruber i wsp, J. Immunol. 2: 368 (1994). [0046] Zasadniczo składa się z i odmiany, takie jak zasadniczo składają się z lub zasadniczo składający się z, używane w opisie i zastrzeżeniach, wskazują na włączenie dowolnych wymienionych elementów lub grup elementów i ewentualne włączenie innych elementów o podobnych lub innych cechach niż wymieniowe elementy, które nie zmieniają w sposób istotny podstawowych lub nowych właściwości określonego trybu dawkowania, metody lub kompozycji. Nieograniczającym przykładem jest cytokina, która zasadniczo składa się z wymienionej sekwencji aminokwasowej, i może także zawierać jeden lub więcej aminokwasów, które w sposób istotny nie wpływają na właściwości cytokiny. [0047] Interleukina-12R beta1 lub IL12RB1 oznacza pojedynczy łańcuch polipeptydowy zasadniczo składający się z sekwencji dojrzałej formy ludzkiego IL12RB1, jak to opisano w Bazie Danych Sekwencji Białkowych NCBI pod numerami dostępu NP714912, NP0026 lub naturalnie występujących jej wariantów. [0048] Interleukina-17 (lub IL-17 ) oznacza białko składające się z jednego lub dwóch łańcuchów polipeptydowych, przy czym każdy łańcuch zasadniczo składa się z sekwencji dojrzałej formy ludzkiej IL17A, jak to opisano w Bazie Danych Sekwencji Białkowych NCBI pod dowolnym z numerów dostępu NP002181, AAH670, AAH6703, AAH6704, AAH6621, AAH6622 lub naturalnie występujących jej wariantów. [0049] IL-17R lub IL-17RA oznacza pojedynczy łańcuch polipeptydowy zasadniczo składający się z sekwencji dojrzałej formy ludzkiego IL-17RA, jak to opisano w WHO 96/298 lub dowolnym z numerów dostępu Bazy Danych Sekwencji Białkowych NCBI: NP 04, Q96F46, CAJ86 lub naturalnie występujących wariantów tych sekwencji. [000] IL-17RC oznacza pojedynczy łańcuch polipeptydowy zasadniczo składający się z sekwencji dojrzałej formy ludzkiego IL-17RC, jak to opisano w WO 238764A2 lub pod dowolnym z numerów dostępu Bazy Danych Sekwencji Białkowych NCBI NP703191, NP703190 i NP116121 lub naturalnie występujących wariantów tych sekwencji. [001] Interleukina-23 (lub IL-23) oznacza białko składające się z dwóch łańcuchów polipeptydowych. Jeden łańcuch zasadniczo składa się z sekwencji dojrzałej formy ludzkiej IL23, podjednostki p19 (znanej także jako IL23A), jak to opisano pod dowolnym z numerów dostępu Bazy Danych Sekwencji Białkowych NCBI NP07668, AAH6711, AAH66267, AAH66268, AAH66269, AAH66712, AAH6713 lub naturalnie występujących wariantów tych sekwencji. Drugi łańcuch zasadniczo składa się z sekwencji dojrzałej formy ludzkiej IL12, podjednostki p (znanej także jako IL12B i IL23, podjednostka p), jak opisano pod dowolnym z numerów dostępu Bazy Danych Sekwencji Białkowych NCBI NP002178, P29460, AAG326, AAH74723, AAH6702, AAH67499, AAH67498, AAH6701 lub naturalnie występujących wariantów tych sekwencji. [002] Interleukina-23R lub IL-23R oznacza pojedynczy łańcuch polipeptydowy zasadniczo składający się z sekwencji dojrzałej formy ludzkiego IL23R, jak to opisano w Bazie Danych Sekwencji Białkowych NCB,I numer dostępu NP632 lub naturalnie występujących jej wariantów. [003] Przeciwciało monoklonalne lub mab oznacza przeciwciało otrzymane z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał i nie należy tego interpretować jako wymóg wytwarzania tego przeciwciała jakąś określoną metodą. [004] Podawanie pozajelitowe oznacza iniekcję dożylną, podskórną lub domięśniową. [00] Mała cząsteczka oznacza cząsteczkę o masie cząsteczkowej mniejszej niż kd, typowo mniejszej niż 2 kd, a korzystnie mniejszej niż 1 kd. Małe cząsteczki obejmują, ale nie ograniczają się do 6
2 3 4 0 cząsteczek nieorganicznych, cząsteczek organicznych, cząsteczek organicznych zawierających składnik nieorganiczny, cząsteczek zawierających atom radioaktywny, cząsteczek syntetycznych, mimetyków peptydów i mimetyków przeciwciał. Mimetyki peptydowe przeciwciał i cytokin są znane w tej dziedzinie. Zobacz np. Casset i wsp. (03) Biochem. Biophys. Res. Commun. 7:198-; Muyldermans (01) J. Biotechnol. 74:277-2; Li (00) Nat. Biotechnol. 18:121-126; Apostolopoulos i wsp. (02) Curr. Med. Chem. 9:411-4; Monfardini i wsp. (02) Curr. Pharm. Des. 8:218-2199; Domingues i wsp. (1999) Nat. Struct. Biol. 6:62-66; Sato i Sone (03) Biochem. J. 371:603-608; Patent USA nr 6326482 wydany na rzecz Stewarta i wsp. [006] Specyficzny lub specyficznie ( swoisty lub swoiście ), kiedy odnosi się do oddziaływania wiążącego pomiędzy wiążącą się parą, taką jak cytokina i jej receptor oraz przeciwciało i jego antygen lub epitop, wskazuje na reakcję wiązania, która jest wyznacznikiem obecności jednego członka wiążącej się pary w heterogennej populacji białek i innych cząsteczek biologicznych. Zatem w określonych warunkach jeden członek wiążącej się pary ma znacząco większe powinowactwo do drugiego członka wiążącej się pary niż do innych nieistotnych białek. Na przykład, przeciwciało uważa się za specyficzne dla określonego białka, jeżeli wiąże ono to białko w powinowactwem, które jest przynajmniej -krotnie, a korzystnie 0- krotnie wyższe niż jego powinowactwo do innych białek. Przeciwciało, które specyficznie wiąże się z białkiem zawierającym określony epitop, nie wiąże się w żadnym mierzalnym stopniu z białkami, które nie zawierają tego epitopu. Korzystnie, jeśli przeciwciało, które jest specyficzne (swoiste) dla białka docelowego, będzie miało powinowactwo do białka docelowego większe niż około 9 litrów/mol, jak to określono, np. poprzez analizę Scatchard (Munsen i wsp. (1980) Analyt. Biochem. 7:2-239). [007] Leczyć lub leczenie oznacza podawanie środka leczniczego, takiego jak kompozycja zawierająca dowolnego z antagonistów IL-17 i IL-23 opisanych tutaj, wewnętrznie lub zewnętrznie, pacjentowi potrzebującemu tego środka leczniczego. Zazwyczaj, środek jest podawany w ilości skutecznej, aby zapobiec lub złagodzić jeden lub większą liczbę objawów chorobowych lub jeden lub większą liczbę działań niepożądanych leczenia innym środkiem leczniczym, albo przez zapobiegnięcie rozwojowi, zapoczątkowanie regresji, albo hamowanie postępu takiego (takich) objawu/objawów lub działania/działań niepożądanych w dowolnym klinicznie mierzalnym stopniu. Ilość środka leczniczego, która jest skuteczna w złagodzeniu dowolnego poszczególnego objawu lub działania niepożądanego (także określana jako ilość skuteczna terapeutycznie ) może się zmieniać w zależności od czynników, takich jak postęp choroby, wiek i waga pacjenta oraz zdolność środka leczniczego do wywołania u pacjenta pożądanej odpowiedzi. To, czy objaw choroby lub efekt niepożądany został złagodzony, można ocenić dowolnym pomiarem klinicznym typowo stosowanym przez lekarzy lub innych specjalistów w leczeniu, w celu oceny ciężkości lub postępu tego objawu lub działania niepożądanego. Kiedy środek leczniczy jest podawany pacjentowi, który ma aktywną chorobę, ilość skuteczna terapeutycznie typowo spowoduje zmniejszenie mierzonego objawu o przynajmniej %, zazwyczaj o przynajmniej %, częściej przynajmniej %, najczęściej przynajmniej %, korzystnie przynajmniej %, jeszcze korzystniej przynajmniej 0%, najkorzystniej przynajmniej 60%, idealnie przynajmniej 70%, bardziej idealnie przynajmniej 80%, a najidealniej przynajmniej 90%. Podczas gdy wykonanie niniejszego wynalazku (np. metoda leczenia lub wytwarzany przedmiot) może nie być skuteczne w zapobieganiu lub łagodzeniu docelowego objawu/objawów choroby lub działania/działań niepożądanych u każdego pacjenta, powinno ono łagodzić taki objaw(y) lub działanie(a) u statystycznie istotnej liczby pacjentów, jak to określono przy użyciu dowolnego znanego testu statystycznego, takiego jak test t Studenta, test chi kwadrat, test U Manna i Whitneya, test Kruskal-Wallisa (test H), test Jonckheere-Tepstra i test Wilcoxona. [008] Zapalenie błony naczyniowej oznacza stan zapalny dotykający jedną lub większą liczbę spośród trzech części oka, które składają się na błonę naczyniową: tęczówki (zabarwionej części oka), ciała rzęskowego (za tęczówką, odpowiedzialnego za wytwarzanie płynu wewnątrz oka) i naczyniówki (tkanki wyściełającej naczynia krwionośne pod siatkówką). Zapalenie całej błony naczyniowej oznacza obecność stanu zapalnego w wielu częściach tego samego oka (odcinek przedni, środkowy i tylny). [009] Zapalenie błony naczyniowej może być albo ostre albo przewlekłe. Postać przewlekła jest częściej związana z zaburzeniami układowymi, włączając w to zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, zespół Behçeta, chorobę zapalną jelit, młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów, zespół Reitera, sarkoidozę, kiłę, gruźlicę i chorobę z Lyme. [0060] Zapalenie przedniego odcinka błony naczyniowej, które obejmuje stan zapalny przedniej części oka, jest najczęstszą postacią zapalenia błony naczyniowej. Zapalenie zazwyczaj jest ograniczone do tęczówki, dlatego zapalenie przedniego odcinka błony naczyniowej często nazywane jest zapaleniem tęczówki. U niektórych pacjentów zapalenie przedniego odcinka błony naczyniowej może być związane z obecnością choroby autoimmunologicznej, takiej jak reumatoidalne zapalenie stawów lub zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, ale większość przypadków zapalenia przedniego odcinka błony naczyniowej pojawia się 7
2 3 4 0 u poza tym zdrowych ludzi i nie wskazuje na leżącą u podstaw chorobę układową. Ta OID może dotknąć tylko jednego oka i jest najpowszechniejsza wśród ludzi młodych i w średnim wieku. Choroba autoimmunologiczna w wywiadzie jest czynnikiem ryzyka. Większość leczonych ataków zapalenia przedniego odcinka błony naczyniowej trwa od kilku dni do tygodni, ale powszechne są nawroty. [0061] Zapalenie środkowego odcinka błony naczyniowej oznacza idiopatyczny zespół zapalny obejmujący głównie przednią część ciała szklistego, siatkówkę obwodową i ciałko rzęskowe z minimalnymi objawami lub bez objawów zapalenia odcinka przedniego lub naczyniówkowo-siatkówkowego. [0062] Zapalenie części płaskiej obrączki rzęskowej jest stanem zapalnym części płaskiej obrączki rzęskowej, wąskiego obszaru pomiędzy tęczówką a naczyniówką. Zapalenie części płaskiej obrączki rzęskowej zazwyczaj występuje u młodych mężczyzn i przeważnie nie jest związane z żadną inną chorobą. Jednak było kilka opisów przypadków opisujących związek z chorobą Crohna i niektórzy eksperci sugerują możliwy związek ze stwardnieniem rozsianym. Z tych powodów eksperci ci zalecają, aby pacjenci powyżej 2 roku życia zdiagnozowani z zapaleniem części płaskiej obrączki rzęskowej byli poddani badaniu MRI mózgu i kręgosłupa. [0063] Zapalenie tylnego odcinka błony naczyniowej dotyka tylnej części błony naczyniowej i obejmuje pierwotnie naczyniówkę. Nazywa się to zapaleniem naczyniówki. Zapalenie tylnego odcinka błony naczyniowej charakteryzuje się stanem zapalnym warstwy naczyń krwionośnych leżących pod siatkówką i zazwyczaj również siatkówki. Jeśli objęta jest także sąsiadująca siatkówka, stan ten nazywa się zapaleniem naczyniówki i siatkówki. Zapalenie tylnego odcinka błony naczyniowej może następować po infekcji układowej lub pojawiać się w związku chorobą autoimmunologiczną. W zapaleniu tylnego odcinka błony naczyniowej stan zapalny może trwać od miesięcy do lat i może powodować trwałe uszkodzenie wzroku, nawet w przypadku leczenia. II. Zagadnienia ogólne [0064] Niniejszy wynalazek dostarcza antagonistów aktywności IL-17 i IL-23 do zastosowania w leczeniu autoimmunologicznej zapalnej choroby oczu. [006] Aktywność IL17, którą omówiono w sposób przeglądowy w Kolls, J. i wsp. (04) Immunity tom 21, 467-476, obejmuje sprzyjanie gromadzeniu się neutrofili w pewnych umiejscowionych obszarach i aktywacji neutrofili. IL17 może indukować lub promować produkcję dowolnych z następujących prozapalnych i mobilizujących neutrofile cytokin, w zależności od typu komórki: IL-6, MCP-1, CXCL8 (IL-8), CXCL6, TNFα, IL-1β, G-CSF, GM-CSF, MMP-1 i MMP-13. [0066] Aktywność IL-23 obejmuje indukowanie proliferacji komórek T pamięci, komórek blastycznych PHA, komórek T CD4RO, komórek T CD4RO oraz zwiększanie wytwarzania interferonu gamma (IFNγ) przez komórki blastyczne PHA lub komórki T CD4RO. W przeciwieństwie do IL-12, IL-23 bardziej stymuluje populację komórek T pamięci niż populację komórek T, które nie zetknęły się dotąd z żadnym antygenem, zarówno u ludzi, jak i u myszy. IL-23 aktywuje pewną liczbę wewnątrzkomórkowych cząsteczek przekazujących sygnał w komórce, np. Jak2, Tyk2, Stat1, Stat2, Stat3 i Stat4. IL-12 aktywuje tę samą grupę cząsteczek, ale odpowiedź Stat4 na IL-23 jest stosunkowo słaba, podczas gdy odpowiedź Stat4 na IL-12 jest silna (Oppmann i wsp., powyżej; Parham i wsp. (02) J. Immunol. 168:699-708). Sugerowano także, że IL-23 ma udział w zachowaniu i proliferacji komórek produkujących IL-17, znanych także jako komórki Th 17 (zobacz Cua i Kastelein (06) Nature Immunology 7: 7-9). [0067] Antagoniści użyteczni w niniejszym wynalazku obejmują rozpuszczalny receptor zawierający pozakomórkową domenę funkcjonalnego receptora dla IL-17 lub IL-23. Rozpuszczalne receptory można przygotować i stosować zgodnie ze standardowymi metodami (zobacz, np. Jones i wsp. (02) Biochim. Biophys. Acta 92:21-263; Prudhomme i wsp. (01) Expert Opinion Biol. Ther. 1:39-373; Fernandez- Botran (1999) Crit. Rev. Clin. Lab Sci. 36:16-224). [0068] Preferowanymi antagonistami IL-17 do zastosowania w niniejszym wynalazku są przeciwciała, które wiążą się specyficznie z i hamują aktywność dowolnej z IL-17, IL-17RA, IL-17RC oraz heteromerycznego kompleksu zawierającego IL-17RA i IL-17RC. Bardziej korzystnie celem antagonisty IL-17 jest IL-17 lub IL-17RA. Szczególnie korzystnie antagoniści IL-17 wiążą się specyficznie z i hamują aktywność IL-17. [0069] Innym korzystnym antagonistą IL-17 do zastosowania w niniejszym wynalazku jest przeciwciało bispecyficzne lub fragment przeciwciała bispecyficznego, który także antagonizuje aktywność IL-23. Tacy bispecyficzni antagoniści specyficznie wiążą się z i hamują aktywność każdego członka w dowolnej z następujących kombinacji: IL-17 i IL-23; IL-17 i IL-23p19; IL-17 i IL-12p; IL-17 i kompleksu IL-23R/IL-12RB1; IL-17 i IL-23R; IL-17 i IL12RB1; IL17RA i IL-23; IL-17RA i IL-23p19; IL-17RA i IL-12p; IL-17RA i kompleksu IL-23R/IL12RB1; IL-17RA i IL-23R; IL-17RA i IL12RB1; IL17RC i IL-23; IL-17RC i IL-23p19; IL-17RC i IL-12p; IL-17RC i kompleksu IL-23R/IL12RB1; IL-17RC i IL-23R; IL-17RC i IL12RB1; 8
2 3 4 0 kompleksu IL-17RA/IL-17RC i IL-23; kompleksu IL-17RA/IL-17RC i IL-23p19; kompleksu IL-17RA/IL-17RC i IL-12p; kompleksu IL-17RA/IL-17RC i kompleksu IL-23R/IL12RB1; kompleksu IL-17RA/IL- 17RC i IL-23R; oraz kompleksu IL-17RA/IL-17RC i IL12RB1. Korzystnymi kombinacjami, które są celem przeciwciał bispecyficznych użytych w niniejszym wynalazku, są: IL-17 i IL-23; IL-17 i IL-23p19; IL17RA i IL-23; oraz IL-17RA i IL-23p19. Szczególnie korzystne bispecyficzne przeciwciało wiąże się specyficznie z i hamuje aktywność każdego z IL-17 oraz IL-23p19. [0070] Korzystnymi antagonistami IL-23 są przeciwciała, które wiążą się z i hamują aktywność dowolnej z IL-23, IL-23p19, IL-12p, IL23R, IL12RB1 oraz kompleksu IL-23/IL12RB1. Innym korzystnym antagonistą IL-23 jest polipeptyd wiążący IL-23, który zasadniczo składa się z pozakomórkowej domeny IL-23R, np. aminokwasów 1-33 GenBankAAM44229, lub jego fragment. [0071] Antagonistów w postaci przeciwciał do zastosowania w wynalazku można przygotować dowolnym sposobem otrzymywania przeciwciał znanym w tej dziedzinie. Przygotowanie przeciwciał monoklonalnych, poliklonalnych i humanizowanych jest opisane w Sheperd i Dean (red.) (00) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, Nowy Jork, NY; Kontermann i Dubel (red.) (01) Antibody Engineering, Springer- Verlag, Nowy Jork; Harlow i Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, str. 139-243; Carpenter i wsp. (00) J. Immunol. 16:6; He i wsp. (1998) J. Immunol. 160:29; Tang i wsp. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Baca i wsp. (1997) J. Biol. Chem. 272:678-684; Chothia i wsp. (1989) Nature 342:877-883; Foote i Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499 oraz Patencie USA nr 632911 wydanym na rzecz Vasqueza i wsp. [0072] Można zastosować dowolną formę antygenową pożądanej cząsteczki docelowej do wytworzenia przeciwciał, które można przeszukiwać przesiewowo pod kątem znalezienia tych o pożądanej aktywności antagonizującej. Zatem, antygen wywołujący odpowiedź może być peptydem zawierającym pojedynczy epitop lub wiele epitopów, albo może być całym białkiem, samym lub w połączeniu z jednym lub większą liczbą czynników zwiększających immunogenność znanych w tej dziedzinie. Aby poprawić właściwości immunogenne peptydu antygenowego, można sprzęgać peptyd z białkiem nośnikowym. Antygen może także być wyizolowanym białkiem pełnej długości, białkiem powierzchniowym komórki (np. immunizacja komórkami transfekowanymi przynajmniej częścią antygenu) lub białkiem rozpuszczalnym (np. immunizacja tylko częścią będącą domeną pozakomórkową białka). Antygen może ulegać ekspresji w genetycznie zmodyfikowanej komórce, w której DNA kodujący antygen jest genomowy lub niegenomowy (np. na plazmidzie). [0073] Do wytworzenia przeciwciała można zastosować peptyd zasadniczo składający się z regionu o przewidywanej wysokiej antygenowości. Na przykład, regiony o wysokiej antygenowości ludzkiego p19 występują przy aminokwasach 16-28; 7-87; 1-114; 136-4 oraz 182-186 GenBank AAQ89442 (gi:37183284), a regiony o wysokiej antygenowości ludzkiego IL-23R występują przy aminokwasach 22-33; 7-63; 68-74; 1-112; 117-133; 164-177; 244-264; 294-2; 3-326; 347-34; 444-473; - i 4-8 GenBank AAM44229 (gi: 2123922), jak to określono przy użyciu analizy z wykorzystaniem wykresu Parkera używając zestawu Vector NTI (Informax, Inc, Bethesda, MD). [0074] Można zastosować dowolny sposób immunizacji. Takie sposoby mogą obejmować użycie adiuwantów, inne czynniki immunostymulujące, powtarzane immunizacje przypominające i zastosowanie jednej lub więcej dróg immunizacji. Immunizację można także przeprowadzić przez immunizację wektorowym DNA, zobacz, np. Wang i wsp. (1997) Virology 228:278-284. Inaczej, zwierzęta można immunizować komórkami niosącymi interesujący nas antygen, co może zapewniać większe wytwarzanie przeciwciał niż immunizacja oczyszczonym antygenem (Kaithamana i wsp. (1999) J. Immunol. 163:7-164). [007] Korzystnymi antagonistami będącymi przeciwciałami są przeciwciała monoklonalne, które można otrzymać rozmaitymi technikami znanymi specjalistom w tej dziedzinie. Sposoby wytwarzania przeciwciał monoklonalnych są ogólnie opisane w Stites i wsp. (red.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (wydanie 4-te) Lange Medical Publications, Los Altos, CA i cytowanych tam odnośnikach; Harlow i Lane (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (wydanie 2-gie) Academic Press, Nowy Jork, NY. Typowo, splenocyty izolowane z immunizowanego gospodarza ssaczego unieśmiertelnia się, zwykle poprzez fuzję z komórkami szpiczaka tworząc hybrydomę. Zobacz Kohler i Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:11-19; Meyaard i wsp. (1997) Immunity 7:283-290; Wright i wsp. (00) Immunity 13:233-242; Preston i wsp. (1997) Eur. J. Immunol. 27:1911-1918. Alternatywne sposoby unieśmiertelniania obejmują transformację wirusem Epsteina Barra, onkogenami lub retrowirusami; lub inne sposoby znane w tej dziedzinie. Zobacz, np. Doyle i wsp. (red. 1994 i okresowe suplementy) CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley and Sons, Nowy Jork, NY. Kolonie powstające z pojedynczej unieśmiertelnionej komórki są przeszukiwane pod kątem produkcji przeciwciał o pożądanej specyficzności, powinowactwie i aktywności 9
2 3 4 0 hamującej przy użyciu odpowiednich testów wiązania i biologicznych. Na przykład, właściwości wiązania się przeciwciała z cząsteczką docelową można zmierzyć, np. przy użyciu rezonansu plazmonów powierzchniowych (Karlsson i wsp. (1991) J. Immunol. Methods 14:229-2; Neri i wsp. (1997) Nat. Biotechnol. :1271-127; Jonsson i wsp. (1991) Biotechniques 11:6-627) lub przy użyciu kompetycyjnego testu ELISA (Friguet i wsp. (198) J. Immunol. Methods 77:-319; Hubble (1997) Immunol. Today 18:-6). [0076] Inaczej, można wyizolować sekwencje DNA, które kodują przeciwciało monoklonalne, lub ich fragment wiążący poprzez przeszukiwanie biblioteki DNA z ludzkich komórek B, zobacz np. Huse i wsp., Science 246:127-1281 (1989). Inne odpowiednie techniki obejmują przeszukiwanie bibliotek prezentujących przeciwciało na fagu. Zobacz, np. Huse i wsp., Science 246:127-1281 (1989) oraz Ward i wsp., Nature 341:44-46 (1989); Clackson i wsp. (1991) Nature 32: 624-628 oraz Marks i wsp. (1991) J. Mol. Biol. 222: 81-97; Presta (0) J. Allergy Clim Immunol. 116:731. [0077] Korzystne przeciwciała monoklonalne do zastosowania w niniejszym wynalazku są przeciwciałami (immunoglobulinami) chimerycznymi, w których domena zmienna pochodzi z przeciwciała macierzystego wytworzonego w zwierzęciu doświadczalnym będącym ssakiem, takim jak szczur lub mysz, a domeny stałe są otrzymane z ludzkiego przeciwciała tak, że otrzymane przeciwciało chimeryczne z mniejszym prawdopodobieństwem będzie wywoływać niepożądaną odpowiedź immunologiczną u człowieka niż macierzyste przeciwciało ssacze. Korzystniej, jeśli przeciwciało monoklonalne użyte w niniejszym wynalazku jest przeciwciałem humanizowanym, w którym wszystkie lub zasadniczo wszystkie pętle hiperzmienne (np. regiony determinujące dopasowanie lub CDR) w domenach zmiennych odpowiadają tym pochodzącym z innych niż ludzkie immunoglobulin, a wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony zrębowe (FR) w domenach zmiennych są tymi o sekwencji ludzkiej immunoglobuliny. Szczególnie korzystne przeciwciało monoklonalne do zastosowania w niniejszym wynalazku jest w pełni ludzkim przeciwciałem, np. przeciwciało, które zawiera tylko sekwencje białka ludzkiej immunoglobuliny. W pełni ludzkie przeciwciało może zawierać łańcuchy węglowodanowe z tych rodzai komórek, w których jest ono wytwarzane, np. jeśli jest wytwarzane w myszach, w komórce mysiej lub w hybrydomie pochodzącej z komórki mysiej, w pełni ludzkie przeciwciało typowo będzie zawierało łańcuchy węglowodanowe mysie. [0078] Przeciwciała monoklonalne stosowane w niniejszym wynalazku mogą także obejmować podobne do wielbłądzich przeciwciała z pojedynczą domeną. Zobacz, np. Muyldermans i wsp. (01) Trends Biochem. Sci. 26:2; Reichmann i wsp. (1999) J. Immunol. Methods 231:2; WO 94/04678; WO 94/291; patent USA nr 600079. [0079] Przeciwciała antagonistyczne stosowane w niniejszym wynalazku mogą posiadać zmodyfikowane (lub zablokowane) regiony Fc, aby zapewnić zmienione funkcje efektorowe. Zobacz, np. patent USA nr 624821; WO03/0863; WO0/171 WO06/007702. Zmiany regionu Fc obejmują zmiany aminokwasów (podstawienia, delecje i insercje), glikozylację lub deglikozylację i dodawanie wielokrotnych powtórzeń Fc. Modyfikacje Fc mogą zmieniać okres półtrwania przeciwciał leczniczych, umożliwiając mniej częste dawkowanie i w ten sposób zwiększając wygodę użytkowania oraz zmniejszając zużycie substancji. Zobacz Presta (0) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 na str. 734-3. [0080] Przeciwciała mogą być także sprzężone (np. połączone kowalencyjnie) z cząsteczkami, które polepszają stabilność przeciwciała podczas przechowywania lub zwiększają okres półtrwania przeciwciała in vivo. Przykładami cząsteczek, które zwiększają okres półtrwania, są albumina (np. ludzka albumina surowicza) i glikol polietylenowy (PEG). Przeciwciała połączone z albuminą i pochodne będące wynikiem reakcji z PEG można przygotować stosując techniki dobrze znane w tej dziedzinie. Zobacz, np. Chapman, A.P. (02) Adv. Drug Deliv. Rev. 4:31-4; Anderson i Tomasi (1988) J. Immunol. Methods 9:37-42; Suzuki i wsp. (1984) Biochim. Biophys. Acta 788:248-2 oraz Brekke i Sandlie (03) Nature Rev. 2:2-62). [0081] Przeciwciała bispecyficzne, które antagonizują aktywność zarówno IL-17, jak i IL-23, można wytworzyć dowolną techniką znaną w tej dziedzinie. Na przykład, przeciwciała bispecyficzne można wytworzyć w sposób rekombinowany przy użyciu koekspresji dwóch par łańcuch ciężki/łańcuch lekki immunoglobuliny. Zobacz, np. Milstein i wsp. (1983) Nature : 37-39. Inaczej przeciwciała bispecyficzne można przygotować przy użyciu połączenia chemicznego. Zobacz, np., Brennan i wsp. (198) Science 229: 81. Te przeciwciała bifunkcjonalne można także przygotować przez wymianę mostka dwusiarczkowego, wytworzenie hybrydom hybryd (komórek typu quadroma), przez transkrypcję i translację, tworząc pojedynczy łańcuch polipeptydowy uosabiający przeciwciało bispecyficzne, lub transkrypcję i translację, tworząc więcej niż jeden łańcuch polipeptydowy, który może asocjować kowalencyjnie w celu wytworzenia przeciwciała bispecyficznego. Rozważane przeciwciało bispecyficzne może także być całkowicie wytworzone poprzez syntezę chemiczną. Przeciwciało bispecyficzne może zawierać dwa różne regiony zmienne, dwa różne regiony stałe, region zmienny i region stały lub inne odmiany.
2 3 4 0 [0082] Przeciwciała stosowane w niniejszym wynalazku zazwyczaj będą się wiązały z K D przynajmniej około -3 M, częściej przynajmniej -6 M, typowo przynajmniej -7 M, bardziej typowo przynajmniej -8 M, korzystnie przynajmniej około -9 i korzystniej przynajmniej - M, a najkorzystniej przynajmniej -11 M (zobacz, np., Presta i wsp. (01) Thromb. Haemost. 8:379-389; Yang i wsp. (01) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 38:17-23; Carnahan i wsp. (03) Clin. Cancer Res. (Suppl.) 9:3982s-3990s). [0083] Antagoniści IL-17 i antagoniści IL-23 są typowo podawani pacjentowi w postaci kompozycji farmaceutycznej, w której antagonista jest zmieszany z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub zaróbką, zobacz, np., Remington s Pharmaceutical Sciences i Farmakopea USA: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984). Kompozycję farmaceutyczną można przygotować w dowolny sposób odpowiedni dla zamierzanej drogi podania. Przykłady preparatów farmaceutycznych obejmują liofilizowane proszki, papki, roztwory wodne, zawiesiny i preparaty o przedłużonym uwalnianiu (zobacz, np., Hardmann i wsp. (01) Goodman i Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nowy Jork, NY; Gennaro (00) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams i Wilkins, Nowy Jork, NY; Avis i wsp. (red.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman i wsp. (red.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman i wsp. (red.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner i Kotkoskie (00) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork, NY). [0084] Droga podania będzie zależeć od właściwości antagonisty lub innego środka leczniczego zastosowanego w kompozycji farmaceutycznej. Możliwą drogą podawania jest podanie kompozycji farmaceutycznej miejscowo do oka w postaci maści, żelu lub cieczy w kroplach przy użyciu systemu podawania leku do oka znanego w tej dziedzinie, takiego jak aplikator lub zakraplacz do oczu. Alternatywnie, kompozycja farmaceutyczna może być podawana do oka poprzez polimerowy implant, który zostaje umieszczony pod spojówką oka, lub w iniekcji bezpośrednio do oka. Korzystnie kompozycje farmaceutyczne zawierające antagonistów IL-17 i antagonistów IL-23 są podawane ogólnoustrojowo poprzez przyjmowanie doustne, iniekcję lub wlew drogą dożylną, dootrzewnową, do mózgu, domięśniową, do oka, dotętniczą, do rdzenia kręgowego, do miejsca zmienionego chorobowo lub płucną, albo poprzez systemy o przedłużonym uwalnianiu, takie jak implanty. Zostało także opisane wstrzyknięcie wektorów przenoszących geny do ośrodkowego układu nerwowego (zobacz, np., Cua i wsp. (01) J. Immunol. 166:602-608; Sidman i wsp. (1983) Biopolymers 22:47-6; Langer i wsp. (1981) J. Biomed Mater. Res. :167-277; Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-; Epstein i wsp. (198) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:3688-3692; Hwang i wsp. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:-34; patenty USA nr 6466 i 6316024). [008] Kompozycje farmaceutyczne stosowane w wynalazku można podawać zgodnie z dowolnym reżimem leczenia, który łagodzi lub zapobiega jednemu lub większej liczbie objawów AOID. Wybór reżimu leczenia będzie zależał od kilku czynników zależnych od kompozycji i zależnych od pacjenta, włączając w to, ale nie ograniczając się do okresu półtrwania antagonisty, ciężkości objawów u pacjenta i typu lub długości trwania jakichkolwiek działań niepożądanych. Korzystnie, jeśli reżim podawania maksymalizuje ilość środka leczniczego podawanego pacjentowi zgodnie z akceptowalnym poziomem działań ubocznych. Wskazówki dotyczące wyboru odpowiednich dawek przeciwciał leczniczych i małych cząsteczek są dostępne (zobacz, np., Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (red.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nowy Jork, NY; Bach (red.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nowy Jork, NY; Baert i wsp. (03) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom i wsp. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon i wsp. (01) New Engl. J. Med 344:783-792; Beniaminovitz i wsp. (00) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh i wsp. (03) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky i wsp. (00) New Engl. J. Med. 343:94-1602). [0086] Antagonistów biologicznych, takich jak przeciwciała, można dostarczyć poprzez ciągły wlew lub w dawkach podawanych w odstępach czasu, np., raz dziennie, raz na tydzień lub 2 do 7 razy na tydzień, raz na dwa tygodnie lub raz na miesiąc. Całkowita dawka tygodniowa dla przeciwciała wynosi przeważnie przynajmniej 0,0 μg/kg masy ciała, częściej przynajmniej 0,2 μg/kg, najczęściej przynajmniej 0, μg/kg, typowo przynajmniej 1 μg/kg, bardziej typowo przynajmniej μg/kg, najbardziej typowo przynajmniej 0 μg/kg, korzystnie przynajmniej 0,2 mg/kg, korzystniej przynajmniej 1,0 mg/kg, najkorzystniej przynajmniej 2,0 mg/kg, optymalnie przynajmniej mg/kg, bardziej optymalnie przynajmniej 2 mg/kg, a najbardziej optymalnie przynajmniej 0 mg/kg (zobacz, np., Yang i wsp. (03) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold i wsp. (02) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu i wsp. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:41-46; Portielji i wsp. (003) Cancer Immunol. Immunother. 2:133-144). Pożądana dawka małej cząsteczki leczniczej, np., mimetyku peptydu, produktu naturalnego lub organicznej substancji chemicznej, wynosi mniej więcej tyle samo, co dla przeciwciała lub polipeptydu, w przeliczeniu na mole/kg. Określenia odpowiedniej dawki dokonuje klinicysta, np. przy użyciu parametrów lub czynników znanych lub 11
2 3 4 0 podejrzewanych w tej dziedzinie o to, że wpływają na leczenie, lub przewiduje się, że będą miały wpływ na leczenie. Ogólnie, dawka początkowa jest ilością nieco mniejszą niż dawka optymalna i dawkę zwiększa się następnie o małe ilości dopóki nie osiągnie się pożądanego lub optymalnego efektu w stosunku do dowolnych negatywnych działań ubocznych. [0087] Reżimy leczenia przy użyciu antagonistów IL-17 lub IL-23 typowo zostaną określone przez lekarza prowadzącego i będą brały pod uwagę wiek pacjenta, historię medyczną, objawy choroby i tolerancję na różne typy lekarstw i tryby dawkowania. Ogólnie reżim leczenia jest zaprojektowany tak, aby stłumić nadmiernie agresywny układ immunologiczny, pozwalając organizmowi w końcu na ponowne wyregulowanie, często z takim rezultatem, że po tym, jak pacjentowi podawano lekarstwa ogólnoustrojowe tłumiące niewłaściwą odpowiedź immunologiczną przez określony czas (na przykład, jeden rok), można następnie zmniejszyć dawkę i odstawić lekarstwo bez nawrotu ataku autoimmunologicznego. Czasami pojawia się nawrót ataku, w którym to przypadku pacjent musi być ponownie leczony. [0088] Zatem, w niektórych przypadkach, lekarz może przepisać pacjentowi pewną liczbę dawek antagonisty do brania przez przepisany okres czasu, po czym leczenie antagonistą zostaje przerwane. Korzystnie, jeżeli po początkowym okresie leczenia, w którym jeden lub więcej ostrych objawów choroby zniknie, lekarz będzie kontynuował leczenie przez określony czas, w którym ilość i/lub częstość podawania antagonisty jest stopniowo zmniejszana przed zakończeniem leczenia. [0089] Niniejszy wynalazek rozważa także reżimy leczenia, w których antagonista IL-17 jest stosowany w połączeniu z antagonistą IL-23. Takie reżimy mogą być szczególnie użyteczne w leczeniu ostrej fazy AOID, w której antagonista IL-17 hamuje aktywność istniejących komórek Th 17, podczas gdy antagonista IL-23 zapobiega wytworzeniu się nowych komórek Th 17. Taka terapia kombinowana może zapewnić efektywne leczenie AOID przy użyciu mniejszej dawki antagonisty IL-17 i/lub podawanie antagonisty IL-17 przez krótszy czas. Kiedy objawy ulegną złagodzeniu, leczenie antagonistą IL-17 korzystnie zostaje przerwane, podczas gdy podawanie antagonisty IL-23 kontynuuje się w celu zapobieżenia tworzenia się nowych autoreaktywnych komórek Th 17, które mogłyby prowadzić do nawrotu choroby. Dwóch antagonistów można podawać w tym samym czasie w pojedynczej kompozycji lub w oddzielnych kompozycjach. Alternatywnie, dwóch antagonistów można podawać w oddzielnych odstępach czasu. Można także zastosować różne dawki antagonistów. Podobnie, podczas ostrej fazy może być także podawany i stopniowo wycofywany antagonista bispecyficzny, ustępując leczeniu antagonistą IL-23 w celu utrzymania represji choroby. [0090] Reżim leczenia może także obejmować zastosowanie innych środków leczniczych w celu złagodzenia jednego lub większej liczby objawów AOID lub w celu zapobieżenia lub złagodzenia niepożądanych działań ubocznych terapii antagonistą. Przykładami środków leczniczych, które zostały użyte do leczenia objawów AOID, są steroidy i inne środki przeciwzapalne. Przykłady takich terapii obejmują, ale nie ograniczają się do, steroidów, takich jak deksametazon, flurometolon i prednizolon, jak również niesteroidowych środków przeciwzapalnych, takich jak indometacyna, aspiryna, flubiprofen i diklofenak, antymetabolitów (np. metotreksat, azatiopryna), inhibitorów czynników transkrypcyjnych (np., cyklosporyna, takrolimus) i środków sieciujących DNA (np., cyklofosfamid, chlorambucyl). Nowe środki skierowane przeciwko cytokinom i ich receptorom, z których wiele działa raczej poprzez hamowanie ważnej cytokiny Th1 niż ścieżek przekazywania sygnału, zaczyna być stosowane do leczenia pacjentów z zapaleniem błony naczyniowej oka. Obejmują one inhibitory TNF, takie jak Infliximab (Remicade, Centocor, Malvern, PA), Etanercept (Enbrel, Amgen, Thousand Oaks, CA) i Adalimumab (Humira, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) i specyficzne inhibitory przekazywania sygnału przez IL-2, włączając w to Daclizumab (Zenepax, Roche Laboratories, Nutley, NJ) i Basiliximab (Simulect, Novartis Pharmaceutical Co.; East Hanover, NJ). [0091] W dowolnej z terapii opisanych tutaj, w której stosuje się dwie lub więcej różnych substancji leczniczych (np., antagonistę IL-17 i antagonistę IL-23, antagonistę IL-17 i środek leczniczy, który nie antagonizuje aktywności IL-17 lub IL-23), należy rozumieć, że różne substancje lecznicze są podawane razem, to znaczy mogą być jednocześnie podawane w tej samej kompozycji farmaceutycznej lub jako oddzielne kompozycje lub substancje te można podawać o różnym czasie i w różnej kolejności. [0092] Diagnozowanie występowania AOID u pacjenta typowo będzie się wiązało z badaniem pacjenta pod kątem objawów znanych, jako związane z takimi chorobami. Na przykład, typowy obraz zapalenia przedniego odcinka błony naczyniowej obejmuje ból, fotofobię i nadmierne łzawienie. Pacjenci zgłaszają głęboki, tępy ból chorego oka i otaczających tkanek. Związana z tym wrażliwość na światło może być znaczna. Nadmierne łzawienie pojawia się wtórnie w odpowiedzi na zwiększenie się stymulacji nerwów gruczołu łzowego i pacjent nie zgłasza odczuwania ciała obcego. Ostrość wzroku jest zmienna wahając się od łagodnego zamazywania się obrazu do poważnej utraty wzroku, jeśli obecne są zrosty lub błony powstałe z naciekania komórek ciała rzęskowego. Badanie może ujawnić łagodny do umiarkowanego obrzęk powieki powodujący rzekome opadanie powiek. Typowa jest głęboka iniekcja okołorąbkowa spojówki i 12
2 3 nadtwardówki, chociaż spojówka powieki jest w sposób charakterystyczny prawidłowa. Rogówka może wykazywać łagodny obrzęk. [0093] Objawy charakterystyczne zapalenia przedniego odcinka błony naczyniowej obejmują obecność komórek i zaczerwienienie w komorze przedniej. Jeżeli reakcja komory przedniej jest znaczna, mogą być obecne małe szare do brązowych osady śródbłonka znane jako osady na rogówce. To może następnie prowadzić do dysfunkcji komórek śródbłonka i obrzęku rogówki. Zmiany na tęczówce mogą obejmować adhezję do torebki soczewki (tylne zrosty) lub, rzadziej, do rogówki obwodowej (przednie zrosty). Dodatkowo, mogą pojawić się guzki ziarniniakowe na powierzchni tęczówki. Ciśnienie wewnątrzgałkowe jest początkowo zmniejszone w chorym oku ze względu na hipotonię wydzielniczą ciała rzęskowego. Jednak, kiedy reakcja się utrzymuje, produkty uboczne stanu zapalnego mogą akumulować się w beleczce. Jeżeli zgromadzi się znaczny osad i jeżeli ciało rzęskowe powróci do swojej normalnej wydajności wydzielniczej, IOP może wzrosnąć gwałtownie powodując wtórnie jaskrę błony naczyniowej. [0094] Identyfikacja pacjentów, którzy są podatni na AOID, w typowych przypadkach będzie oparta na medycznej historii pacjenta i rodziny oraz może obejmować testy genetyczne. Na przykład, niektóre osoby będą miały genetyczną predyspozycję do zapalenia błony naczyniowej oka, które jest związane z procesami choroby autoimmunologicznej. Najpowszechniejszym z tych genów jest haplotyp HLA B27, który predysponuje do samego zapalenia błony naczyniowej oka lub także do seronegatywnych spondyloartropatii i artropatii związanych z enteropatiami. Przykładami są zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, reaktywne zapalenie stawów (zespół Reitera), łuszczycowe zapalenie stawów, choroba drażliwego jelita i choroba Crohna. Pacjent może być także zdiagnozowany jako podatny na AOID, jeżeli w historii rodzinnej występowała dowolna z tych chorób autoimmunologicznych lub pacjent był już diagnozowany z taką chorobą. [009] Efektywność terapii antagonistą w celu zapobieżenia lub leczenia AVOID u określonego pacjenta może zostać określona przy użyciu środków diagnostycznych, takich jak zmniejszenie lub pojawienie się objawów stanu zapalnego, np., rozmiarów stanu zapalnego oka lub poziomu cytokin zapalnych w chorym oku (oczach). Objawy zapalenia oka w przeważającej mierze zależą od zajętego obszaru w oku. Najpowszechniejszymi oznakami i objawami są: bolesne zaczerwienienie, męty, zmniejszona zdolność widzenia i wrażliwość na światło. Poziom cytokin zapalnych można zmierzyć, np., poprzez kontakt związku wiążącego interesującą nas zapalną cytokinę z próbką z oka pacjenta, jak również z próbką od osoby kontrolnej lub z tkanki albo płynu nie dotkniętego przez chorobę pochodzącego od pacjenta, a następnie porównanie poziomów cytokin wykrytych przez związek wiążący. Ekspresja lub aktywność u osoby kontrolnej lub w próbce kontrolnej może być wcześniej określoną wartością, np., otrzymaną z odpowiedniej statystycznie grupy osób kontrolnych. PRZYKŁADY [0096] Niniejszy wynalazek jest oparty na badaniach na myszach z nokautem (KO) IL-23p19 i na podawaniu przeciwciał anty-il-23p19 oraz anty-il-17 w mysim modelom autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej oka. Doświadczenia te przeprowadzono jak opisano poniżej w podrozdziale II Materiały i metody. I. Wyniki i omówienie 4 0 [0097] W doświadczeniach z myszami IL-23p19 KO porównano podatność myszy IL-23p19 KO (z niedoborem IL-23) na EAU z podatnością myszy IL-12p3 KO (z niedoborem IL-12) i IL-12p KO (z niedoborem IL-12 i IL-23) na EAU. Wszystkie myszy wywodziły się od C7BL/6, a indukcja EAU oraz ocena punktowa były przeprowadzone tak, jak to opisano poniżej w Metodach ogólnych. Ujawniono, że IL-12p3 nie jest konieczna do generowania specyficznej względem IRBP destrukcji tkanki oka. W przeciwieństwie do tego, IL-23p19 jest niezbędna do rozwoju EAU (Tabela 1). Analiza cytokin hodowli komórek węzła limfatycznego pochodzących od myszy immunizowanych białkiem IRBP wykazała, że podatne na EAU myszy z niedoborem IL-12 (IL-12p3KO) miały podwyższony poziom IFN-γ, IL-6, IL-17 i IL-18 w porównaniu z myszami z niedoborem IL-23 (IL-23p19KO i IL-12pKO). Odpowiedzi w postaci opóźnionej nadwrażliwości (DTH) na IRBP w 3 szczepach KO, zbadane za pomocą oznaczenia opuchlizny uszu, wykazały, że odpowiedź DTH na IRBP była dobrze skorelowana z punktacją EAU lub odpowiednimi myszami, przy czym odpowiedzi w przypadku p19 i p KO były znacząco słabsze, a w przypadku p3 KO były znacząco silniejsze w porównaniu z typem dzikim (WT). 13
Tabela 1: IL-23, ale nie IL-12, jest istotna dla rozwoju EAU. Typ dziki IL-12p3KO IL-23p19KO IL-12pKO Średnia punktacja EAU +/- SE 0,21 ± 0,11 0,7 ± 0,12 0 0 Obrzęk specyficzny dla DTH +/- SE (μm x -1) 44 ± 7 7 ± 2 2 ± 4 22 ± 3 IFN-γ (ng/ml) 39 16 6, <1 IL-6 (ng/ml) 3,2 1,9 0, 0,08 IL-17 (ng/ml) 2,2 4,9 1,2 0,8 IL-18 (ng/ml) 0,2 0,29 0, 0,11 2 [0098] Wyniki te zostały następnie poparte doświadczeniami przy użyciu przeciwciała anty-mysia IL-23p19 w mysim modelu zapalenia błony naczyniowej oka, w wysoce podatnym szczepie B.RIII. Ujawniono, że leczenie przeciwciałem przeciwko mysiej IL-23p19 znacząco blokowało stan zapalny w oku związany z odpowiedzią immunologiczną. Przy dawce 3 μg na mysz co drugi dzień indeks choroby EAU u myszy leczonych przeciwko mysiej IL-23p19 dramatycznie spadł w porównaniu z kontrolami leczonymi przeciwciałem anty-izotypowym oraz nieleczonymi żadnym przeciwciałem, jak to określono na podstawie histopatologii oczu zebranych w dniu 11 po immunizacji (Tabela 2). W dodatku, leczenie anty-il-23p19 było tak samo skuteczne w blokowaniu EAU, co Prednizon. Poziomy ekspresji mrna IL-17, ale nie IFN-γ, w oczach myszy leczonych anty-il-23p19 były niższe niż w grupach kontrolnych, co sugeruje, że wiązanie docelowej IL-23 hamowało EAU poprzez blokowanie naciekania komórek wytwarzających IL-17 lub zapobieganie ekspansji patogennych komórek wytwarzanie IL-17 w oczach. Poziomy mrna neutrofilowej elastazy i mieloperoksydazy u myszy leczonych anty-il-23p19 były porównywalne z grupami kontrolnymi nie mającymi styczności z antygenem, jak również leczonymi Prednizonem, podczas gdy myszy kontrolne nieleczone żadnym przeciwciałem i leczone izotypowo wykazywały - 0-krotny wzrost ekspresji tych genów zapalnych. Inne czynniki prozapalne, takie jak IL-1β, TNF, IL-6, NOS2 i COX2, były nieco zmniejszone u myszy leczonych IL-23p19. Wyniki te pokazują, że wiązanie docelowe IL-23 hamuje rozwój autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej oka. 3 4 0 14
2 3 4 0 Tabela 2: Leczenie anty-il-23p19 hamuje EAU i ekspresję cytokin zapalnych w oku. Analiza ekspresji genów w oku przy użyciu ilościowej PCR (Pokazano jako poziom ekspresj i względem ubikwityny). Próbki tkanek zebrane w dniu11 po immunizacji IRBP. Mieloperoksydaza Elastaza neutrofilowa COX2 NOS2 IL-1β TNF IL-17 IL-6 IFN-γ Histopatologia 0=prawidłowa 1=niewielkie naciekanie monocytów 4=poważne uszkodzenie (poszczególne oczy) 0 0,1 4,8 2,7 3,8 0 0 0,16 0,44 0 0 0 0 0 4,11 1,23 24,6 22,2 117,8 37,8 7,1 37,6 6,2 3,09 1,3 14, 19,2 3,0 28,3 3,1 13,6 0 0,08 8,9 14,7 64,3 12, 0,013,3 nie oznaczono 6,9 0 0, 14,6,2 74,6 17,9 0 1,2 0,1 4 4 4 4 4 3 3 3 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 4 4 4 4 4 4 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 4 4 2 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 Myszy niemające styczności z antygenem (naiwne) Kontrola nie leczona żadnym mab Kontrola leczona izotypowym mab anty-il-23p19 Prednison
[0099] Przeprowadzono także inny zestaw doświadczeń porównujący leczenie przeciwciałami anty- IL-23p19 z leczeniem przeciwciałami anty-il-12p. W tym doświadczeniu myszy otrzymywały 00 μg wskazanych przeciwciał co drugi dzień, zaczynając od dnia przed immunizacją, a oczy oraz narządy limfoidalne zbierano 17 dni po immunizacji lub 6-7 dni po pojawieniu się choroby u osobników kontrolnych. Dane wskazują, że przeciwciała anty-il-23p19 były tak samo skuteczne jak przeciwciała anty-p w blokowaniu pojawienia się zapalenia błony naczyniowej. Dane są przedstawione w Tabeli 3. [00] Dodatkowo, przy użyciu testu ELISA typu multipleks oszacowano ekspresję białek cytokin w węzłach chłonnych tych myszy. Dane te pokazują, że leczenie antagonistami IL-23 zmniejsza wytwarzanie Th1 i cytokin prozapalnych. Dane są przedstawione w Tabeli 3. 2 3 4 0 16
IL-17 pg/ml 72,9 37,0 198,0 29,7 IL-12 pg/ml 2,7 2,1 3,1 < 0,8 2 3 4 0 Tabela 3 Leczenie anty-il-23p19 hamuje EAU i układowe odpowiedzi cytokin naantygen zapalenia błony naczyniowej. TNF-α pg/ml IFN-γ pg/ml IL- pg/ml IL-6 pg/ml IL- pg/ml IL-4 pg/ml IL-2 Próbka Punktacja EAU pojedynczych oczu pg/ml Kontrola 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 0, 0,2 247,6 0,4 < 3,1 14,7 8,6 129,3 46, Anty IL-23p19 3, 3, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 1,0 1,3 19,1 163,7, 143,3 87, Anty Izotyp 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3,2 1,4 < 3,1 6,7 12,4 279,6 1,2 Anty IL-12p 0,2, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 1,9 0,4 < 3,1 26, 4,4, 16,6 17
[01] Druga część tego doświadczenia badała etap procesu patogennego, podczas którego wymagana jest IL-23. Myszy leczono 00 μg przeciwciała anty-il-23p19 co drugi dzień, zaczynając 7 dni po immunizacji, a chorobę porównywano z myszami, które były leczone od dnia przed immunizacją (powyżej). Można było zapobiec EAU przez wczesne leczenie przeciwciałami albo anty-p19, albo anty-p. Jednak, kiedy leczenie rozpoczynano 7 dni po immunizacji, w momencie, kiedy efektorowe komórki T wywołujące zapalenie błony naczyniowej już zapoczątkowały pierwotną odpowiedź immunologiczną i można je było wyizolować z LN (węzły chłonne) i śledziony, rozwój EAU nie mógł być przerwany i punktacja opisująca chorobę rozwijającą się u leczonych myszy była podobna do kontroli. To sugeruje, że zapotrzebowanie na IL-23 pojawia się na wczesnym etapie patogenezy choroby. Dane są przedstawione w Tabeli 4. Tabela 4: Leczenie przeciwciałem anty-p19 zapobiega, ale nie odwraca, EAU. Początek leczenia Przeciwciało Punktacja EAU ± SE anty-izotyp 2,9 ± 0,1 dzień 1 anty P19 0,6 ± 0,6 anty P 0 ± 0 anty-izotyp 2,0 ± 0, dzień 7 anty P19 2,3 ± 0, anty P 2,07 ± 0, 2 3 [02] W sumie doświadczenia te pokazują, że neutralizacja IL-23 zapobiega zapaleniu błony naczyniowej w modelach zwierzęcych, ale nie odwraca go, i wskazują, że leczenie antagonistami IL-23 powinno mieć korzystny efekt w przewlekłym zapaleniu błony naczyniowej u ludzi poprzez zapobieganie werbunkowi nowych komórek T do puli efektorowej, tym samym zmniejszając ciężkość i zatrzymując postęp choroby. [03] W celu zbadania, czy niedobór IL-17 może wpłynąć na rozwój EAU, myszy IL-17A -/- (zobacz, np., Nakae i wsp. (02) Immunity 17:37-387) immunizowano IRBP w reżimie wywołującym zapalenie błony naczyniowej oka. Hamowanie EAU przez genetyczny niedobór IL-17 było tylko częściowe (Tabela ). Stosunkowo niewielkie zmniejszenie punktów EAU u myszy IL-17 -/- można wytłumaczyć faktem, że myszy te cierpią na brak izoformy IL-17A cytokiny i w warunkach wrodzonego niedoboru mogą ten niedobór kompensować zazwyczaj mniej licznie wytwarzaną izoformą IL-17F. Tabela : Genetyczny niedobór IL-17 zmniejsza, ale nie znosi, podatność na EAU. 4 0 Dośw. nr WT IL-17A-/- 1 0,* 1, 0,8 0,8 0,4 1,3 0, 1,0 0,9 0,1 0,9 0,6 0, 2 0, 0,9 1,8 1,0 1, 0, [04] Przeciwnie, neutralizacja IL-17A za pomocą przeciwciał IL-17A dawała ochronę u myszy typu dzikiego, albo przez cały przebieg choroby, albo tylko podczas fazy efektorowej (zaczynającej się dnia 7). Ważne, że w przeciwieństwie do neutralizacji IL-23, neutralizacja IL-17 mogła zahamować chorobę po 0, 0,0 0,3 0,0 Średnia punktacja ± SE 0,9±0,1 0,±0,1 18
podaniu począwszy od dnia 7 po immunizacji, kiedy to cząsteczki efektorowe wywołujące zapalenie błony naczyniowej zostały już wytworzone. Zmniejszenie punktacji EAU korelowało ze zmniejszeniem związanych z nim odpowiedzi immunologicznych, nadwrażliwości typu opóźnionego (DTH) i proliferacji komórek LN specyficznych wobec antygenu. Zatem, IL-17 odgrywa rolę w patogenezie EAU i, inaczej niż IL-23, wydaje się uczestniczyć w fazie efektorowej choroby. Dane są przedstawione w Tabeli 6. Tabela 6: Leczenie przeciwciałami anty-il-17a zapobiega i odwraca EAU Początek leczenia dzień -1 dzień 7 Przeciwciało Punktacja EAU ± SE DTH ± SE Proliferacja ± SE (x -3 ) Antyizotyp 1,6 ± 0,7 16 ± 1 19,2 ± 1,2 Anty-IL-17 0,02 ± 0,02 7,6 ± 2 6,6 ± 6,4 Antyizotyp 1,6 ± 0,6,2 ± 3 2,4 ± 1,4 Anty-IL-17 0, ± 0, 6,0 ± 2,9 ± 0,3 2 3 4 0 Rozdział II. Materiały i metody A. Ogólne [0] Standardowe metody biologii molekularnej są opisane (Maniatis i wsp. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook i Russell (01) Molecular Cloning, wyd. 3-cie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, tom 217, Academic Press, San Diego, CA). Standardowe metody pojawiają się także w Ausbel i wsp. (01) Current Protocols in Molecular Biology, tomy 1-4, John Wiley and Sons, Inc. Nowy Jork, NY, które opisują klonowanie w komórkach bakteryjnych i mutagenezę DNA (tom 1), klonowanie w komórkach ssaczych i w drożdżach (tom 2), glikokoniugaty i ekspresję białek (tom 3) oraz bioinformatykę (tom 4). [06] Sposoby oczyszczania białek obejmujące immunoprecypitację, chromatografię, elektroforezę, wirowanie i krystalizację są opisane (Coligan i wsp. (00) Current Protocols in Protein Science, tom 1, John Wiley and Sons, Inc., Nowy Jork). Analiza chemiczna, modyfikacje chemiczne, modyfikacje potranslacyjne, wytwarzanie białek fuzyjnych, glikozylacja białek są opisane (zobacz, np., Coligan i wsp. (00) Current Protocols in Protein Science, tom 2, John Wiley and Sons, Inc., Nowy Jork; Ausubel i wsp. (01) Current Protocols in Molecular Biology, tom 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, str. 16.0.-16.22.17; Sigma- Aldrich, Co. (01) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; str. 4-89; Amersham Pharmacia Biotech (01) BioDirectory, Piscataway, N.J., str. 384-391). Wytwarzanie, oczyszczanie i fragmentacja przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych jest opisana (Coligan i wsp. (01) Current Protcols in Immunology, tom 1, John Wiley and Sons, Inc., Nowy Jork; Harlow i Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow i Lane, powyżej). Standardowe techniki charakteryzowania oddziaływań ligand/receptor są dostępne (zobacz, np., Coligan i wsp. (01) Current Protcols in Immunology, tom 4, John Wiley, Inc., Nowy Jork). [07] Metody cytometrii przepływowej, włączając w to sortowanie komórek z użyciem fluorescencji (FACS), są dostępne (zobacz, np., Owens i wsp. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (01) Flow Cytometry, wyd. 2-gie; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (03) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Odczynniki fluorescencyjne odpowiednie do modyfikacji kwasów nukleinowych, włączając w to startery i sondy, polipeptydy i przeciwciała, do zastosowania, np., jako odczynniki diagnostyczne, są dostępne (Molecular Probes (03) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (03) Catalogue, St. Louis, MO). [08] Standardowe metody histologiczne układu odpornościowego są opisane (zobacz, np., Muller- Harmelink (red.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, Nowy Jork, NY; Hiatt i wsp. (00) Color Atlas of Histology, Lippincott, William i Wilkins, Phila, PA; Louis i wsp. (02) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, Nowy Jork, NY). [09] Pakiety oprogramowania i bazy danych do określania, np., fragmentów antygenowych, sekwencji liderowych, fałdowania białek, domen funkcjonalnych, miejsc glikozylacji, oraz do porównania sekwencji są dostępne (zobacz, np., GenBank, zestaw Vector NTI (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin 19