Ekologia molekularna wykład 1
Podręczniki Agnieszka Kloch Zakład Ekologii akloch@biol.uw.edu.pl CNBiCh, IV p, pok. 4.37 Egzamin: 31 stycznia,12:30, w tej sali wykład 1/2
Podręczniki DL Hartl, AG Clark Podstawy genetyki populacyjnej JC Avise Markery molekularne JR Freeland Ekologia molekularna wykład 1/3
Kalosze vs. fartuchy Ekologia molekularna nie jest prostym zastosowaniem metod molekularnych do starych problemów ekologicznych. To nowa dziedzina biologii. wykład 1/4
Informacja genetyczna
Informacja genetyczna 1. Informacja jest zakodowana w kodzie DNA 3 zasady = 1 kodon = 1 aminokwas DNA ACG GCT CTT białko Met Ala Leu 2. Kod genetyczny jest zdegenerowany Kilka kodonów koduje jeden aminokwas GCT GCA alanina GCC GCG CCG prolina wykład 1/6
Informacja genetyczna 3. Główny paradygmat biologii molekularnej (Crick 1958) wykład 1/7
Informacja genetyczna 3. Polimeraza się myli źródło mutacji Nie mają zdolności naprawczych: polimeraza III prokariotyczna polimerazy RNA Tempo mutacji związanych z polimerazą: 10-4 pomyłka polimerazy 10-8 po naprawie błędów tempo mutacji u człowieka 1/40 000 000 na zasadę na pokolenie genom człowieka ma 3 mld par zasad 75 zasad mutuje co pokolenie! wykład 1/8
Poziomy zmienności 1. sekwencje nukleotydowe SNP single nucleotide polymorphism ACGTCCTGGAAGCT.G...C....C...A......G..T... 2. sekwencje aminokwasowe (obszary kodujące) AGG TCC TGC Arg Ser Cys AGG TCG TGT Thr Ser Cys wykład 1/9
Poziomy zmienności 3. Zmiany epigenetyczne Dziedziczne cechy kodowane poza sekwencją DNA: metylacja DNA i histonów wygaszanie genów przez mirna priony Dynamika metylacji w rozwoju zarodkowym myszy wykład 1/10
Poziomy zmienności 4. Zmiany chromosomowe ryjówka aksamitna mogą występować jako samodzielne chromosomy akrocentryczne lub łączyć się w chromosomy metacentryczne (fuzje Robertsona) 2n = od 20 do 33 kilkadziesiąt ras chromosomowych Wójcik i in. 2002, Acta Theriol. 47 wykład 1/11
Genom prokariotyczny nukleoid - region komórki zawierający materiał genetyczny (kolisty chromosom) plazmid -mała cząsteczka DNA poza chromosomem Wielkość genomu (E. coli): 4.6 mln bp 2584 operonów bp = base pairs = par zasad
Genom mitochondrialny (mtdna)
Genom mitochondrialny (mtdna) Genom mitochondrialny (zwierzęta) kolista jednoniciowa cząsteczka, 12-15bp 37 genów (22 trna, 2 rrna, 13mRNA) geny mrna białka szlaku oddechowego Region kontrolny (~1000bp) obszar niekodującego DNA regulacja replikacji i transkrypcji najbardziej zmienna część mtdna (w tym 3 regiony hiperzmienne)
Genom mitochondrialny zwierząt dziedziczony w linii matczynej* homoplazmia (brak zmienności wewnątrz osobnika) duża zmienność między osobnikami szybko mutuje, zwłaszcza w regionie kontrolnym * Mytilus (omułki) i tylko może zachodzić rekombinacja między mtdna od każdego z rodziców wykład 1/15
Genom mitochondrialny roślin Duże różnice międzygatunkowe w rozmiarze (200-2500 Kbp) Duża zmienność wewnątrzosobnicza, rekombinacje Szybsza niż u zwierząt ewolucja na poziomie ułożenia genów 100x wolniejsze tempo mutacji na poziomie sekwencji słabo się nadaje do ekologii molekularnej wykład 1/16
Genom chloroplastowy (cpdna) zwykle dziedziczone po matce, ale np. u nagozalążkowych po ojcu wolne tempo ewolucji analogiem regionu kontrolnego jest gen rbcl Budowa 2 dwa fragmentów (LSC, SSC) zawierających sekwencje unikatowe 2 x zduplikowany, odwrócony region IR wykład 1/17
Genom jądrowy eukariontów w jądrze komórkowym zorganizowany w liniowe chromosomy nawinięte na białka (histony) wykład 1/18
Genom eukariotyczny Budowa genomu eukariotycznego geny (<30%) introny elementy powtarzające się: powtórzenia tandemowe transpozony LTR (długie powtórzenia końcowe) i inne genom (bp) geny % kodujący człowiek 3 200 000 000 30 000 ~1% C. elegans 102 000 000 20 400 ~25% wykład 1/19
Techniki molekularne
Skąd wziąć DNA? W biologii molekularnej W ekologii molekularnej: wykład 1/21
Skąd wziąć DNA? Bezpośrednio od organizmu: zalety dużo DNA wiadomo, od kogo pobrane Metody pośrednie: zalety bez niszczenia/niepokojenia organizmów wady problem z gatunkami rzadkimi małe osobniki zabicie czasem mało DNA wady nieznana tożsamość dawcy mało DNA często DNA złej jakości wykład 1/22
Skąd wziąć DNA? Metody pośrednie wypluwki, odchody pióra włosy ( pułapki włosowe ) wykład 1/23
Wypadanie alleli p-stwo ilość DNA (1=DNA z 1 komórki 2n) Ryzyko wypadnięcia allelu w zależności od wyjściowej ilości DNA. Taberlet et al. Trens Ecol Evol 1999 wykład 1/24
Przechowywanie odwadnianie / konserwacja: - w 70% alkoholu etylowym - w specjalnym buforze (np. ATL Qiagen) odwadnianie (żel krzemionkowy): rośliny, bezkręgowce mrożenie karty FTA (Whatman) wykład 1/25
Izolacja DNA Ogólna zasada (etapy) 1. Trawienie tkanki: rozbicie błon komórkowych 2. Strącenie roztworem soli niechcianych elementów (białka, RNA, etc) 3. Wytrącenie DNA etanolem Istnieje wiele modyfikacji w zależności od ilości materiału sposobu konserwacji ilości tkanki wykład 1/26
PCR (polimerase chain reaction) obszar docelowy powstają 2 nowe kopie dołączenie primerów synteza nici Ilość produktu rośnie wykładniczo: 2 4 8 16 cząsteczek 30 cykli 230 = 1 073 741 824 wykład 1/27
PCR: odkrycie 1983 Kary Banks Mullis Nagroda Nobla (1993) wykład 1/28
Elektroforeza cząsteczka DNA ma ładunek wędruje od do + małe (krótkie) cząsteczki wędrują szybciej niż duże (długie) prąd dłuższe krótsze znacznik wielkości wykład 1/29
Sekwencjonowanie Technologia Sangera synteza nici DNA losowo przyłączany nukleotyd kończący syntezę odczyt na żelu (w sekwenatrorze) Sekwencjonowanie nowej generacji Illumina 454 Roche Ion Proton / Ion Torrent Sekwencjonowanie nowej nowej generacji PacBio Oxford Nanopore MinION wykład 1/30
Sekwencjonowanie Sangera A C A T C T GCC A T A CGG T T A ACA TC T A G T C dntp A C C G A T G T ddntp A T C
Sekwencjonowanie NGS 1. Enzymatyczne pocięcie DNA 2. Dodanie adapterów i barcodów wykład 1/32
Sekwencjonowanie NGS (Illumina) amplifikacja mostkowa matryc unieruchomionych na złożu od 75 do 200bp detekcja znakowanych fluorescencyjnie nukleotydów Metzker, Nat Rev Genet 11, 2010
Sekwencjonowanie NGS (454) amplifikacja na kulkach (złożach) w emulsji do 400bp przyłączenie nukleotydu wywołuje reakcję świetlną (lucyferaza) Metzker, Nat Rev Genet 11, 2010
Porównanie technologii Sanger NGS input wyizolowana sekwencja prawie dowolny dł. fragmentu max. 800-1000bp max. 250bp dokładność wysoka zależy od projektu czas pracy praca mokra analiza danych
Markery molekularne
Markery molekularne Podstawowe narzędzie ekologii molekularnej. = Dziedziczne cechy wykazujące zmienność (polimorficzne) w RNA, DNA, lub białkach (dawniej). Markery służą do identyfikacji: pozycji w obrębie genomu (mapy genetyczne) komórek i tkanek (np. nowotworowych) osobników (analizy rodzicielstwa, medycyna sądowa) populacji gatunków wykład 1/37
Analiza restrykcyjna Endonukleaza II (enzym restrykcyjny) rozpoznaje i tnie określoną sekwencję. EcoRI 5' XXXXXXXGAATTCXXXXX 3' 3' XXXXXXXCTTAAGXXXXX 5' 5' XXXXXXXG 3' XXXXXXXCTTAA AATTCXXXXX 3' GXXXXX 5' wykład 1/38
Analiza restrykcyjna RFLP restriction fragment length polymorphism łosoś Clarka mtdna, 2 enzymy, 2 populacje wzór RFLP charakterystyczny dla populacji Forbes, 1990 wykład 1/39
PCR + kombinacje RAPD randomly amplified polymorphic DNA 10bp 10bp 10bp 10bp 10bp 1. Weź losowe startery długości 10bp 2. Zrób PCR 10bp 10bp 10bp 10bp 3. Jeżeli starter przyłączy się w 2 miejscach blisko siebie, powstaje produkt PCR 4. Zrób elektroforezę. Układ prążków jest charakterystyczny dla osobnika (zależy od jego sekwencji DNA) 10bp 10bp 10bp 10bp Zalety: łatwa i tania Wady: problem z powtarzalnością Raczej technika historyczna wykład 1/40
PCR + kombinacje AFLP amplified fragment length polymorphism 1. Potnij DNA dwoma enzymami restrykcyjnymi 2. Przyłącz do lepkich końców adaptory. 3. Zrób PCR (primery pasują do adaptorów) 4. Zrób elektroforezę 5. Powstaje układ prążków zależny od występowania miejsc restrykcyjnych. zmienność w pobliżu miejsc restrykcyjnych (SNP, indele) wykład 1/41
Mikrosatelity = STR, short tandem repeats wielokrotne powtórzenia tego samego motywu dł 2-6bp np. -CA-CA-CA-, -GTCGG-GTCGG-GTCGGMikrosatelity są wysoce zmienne przed replikacją niektóre powtórzenia mogą się wypętlić podczas amplifikacji polimeraza może przegapić kilka powtórzeń wysoka zmienność długości fragmentów prawie każdy osobnik ma inną, właściwą dla siebie liczbę powtórzeń w danym locus sekwencja wyjściowa błąd replikacji wykład 1/42
Mikrosatelity W identyfikacji osobników analizuje się naraz kilka (>10) loci mikrosatelitarnych osobnik 1 locus 1 locus 2 -CAA-CAA-CAA-CAA-CAA-CAA-CAA-CAA -GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT- -CAA-CAA-CAA-CAA-CAA-CAA-CAA-CAA- -GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT- -CAA-CAA-CAA-CAA-CAA-CAA-CAA-CAA-CAA- -GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT-GT- locus 3... osobnik 2 osobnik 3 wykład 1/43
Mikrosatelity Rozdział na żelu (1 locus np. CA-CA-CA-CA-CA) bp 18 16 14 12 10 8 6 osobniki wskaźnik wielkości (długość w bp) genotypy A B C 10+14 10 12 D E F 8+14 10+12 12+14 wykład 1/44
Mikrosatelity Rozdział w kapilarze (w sekwenatorze) długość cząsteczki wiele loci naraz (multiplex) locus 1 standard wielkości locus 2 ryciny: LifeTechnologies
Mikrosatelity