Reaktywne formy tlenu i azotu

Reaktywne formy tlenu i azotu 313 Reaktywne formy tlenu i azotu MATEUSZ ŁUGOWSKI, JOLANTA SACZKO, JULITA KULBACKA, TERESA BANAŚ Akademia Medyczna we Wrocławiu, Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, kierownik: prof. dr hab. A. Gamian Reaktywne formy tlenu i azotu Ługowski M., Saczko J., Kulbacka J., Banaś T. Akademia Medyczna we Wrocławiu, Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej W pracy zebrano najważniejsze informacje dotyczące reaktywnych form tlenu (RFT) i azotu (RFA), a także procesów, w jakich uczestniczą. Odgrywają one istotną rolę w patogenezie wielu chorób. Wytwarzanie RFT jest nieodłącznym elementem tlenowego metabolizmu komórek. W stężeniach fizjologicznych mają one duży wpływ na prawidłowy przebieg wielu procesów komórkowych. Do ich nadmiernego wytwarzania dochodzi podczas wywołanego stresu oksydacyjnego. Ze stresem tym ściśle jest związany stres nitrozacyjny. Tlenek azotu (NO) reaguje z tlenem cząsteczkowym, anionorodnikiem ponadtlenkowym i kationami metali, powodując powstawanie kolejnych reaktywnych form tlenu. Reaktywne formy tlenu i azotu, reagując z białkami, powodują upośledzenie ich funkcji przez utlenienie bądź nitrozylację reszt aminokwasowych, co może skierować komórki na drogę apoptozy. Ponadto tlenek azotu wzmacnia efekt indukowany przez cyklooksygenazy i staje się mediatorem stanu zapalnego. Słowa kluczowe: reaktywne formy tlenu, reaktywne formy azotu, tlenek azotu, stres oksydacyjny Pol. Merk. Lek., 2011, XXXI, 185, 313 Reactive oxygen and nitrogen species Ługowski M., Saczko J., Kulbacka J., Banaś T. Medical University of Wrocław, Poland, Department of Medical Biochemistry Reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS respectively) play an important role in the proper functioning of many cellular processes. Generation of reactive oxygen species is an integral part of aerobic metabolism of cells. Their overproduction and subsequent oxidative stress occurs during pathogenesis of many diseases. Nitrosative stress is very closely linked to oxidative stress. Nitric oxide (NO), can react with molecular oxygen, superoxide anions and metal cations generating consecutive reactive oxygen species. These highly reactive chemical compounds react with proteins impairing their function by oxidation, or nitrosylation of amino acid residues, which may induce apoptosis. Furthermore, nitric oxide enhances the effect induced by cyclooxygenases and becomes a mediator of the inflammatory response. This paper gathers key information on the reactive oxygen and nitrogen species as well as processes in which they participate. Key words: reactive oxygen species, reactive nitric species, nitric oxide, oxidative stress Pol. Merk. Lek., 2011, XXXI, 185, 313 Reaktywne formy tlenu (RFT, tab. 1) powstają w komórkach w warunkach fizjologicznych podczas wielu procesów metabolicznych. Do ich nadmiernego wytwarzania dochodzi podczas wywołanego stresu oksydacyjnego (np. w czasie terapii fotodynamicznej). Do najbardziej rozpowszechnionych RFT należą rodnik ponadtlenkowy ( ) i wodoronadtlenkowy (H ). Rodniki te powstają głównie w wyniku wycieku elektronów z łańcucha oddechowego, dokładnie na poziomie dehydrogenazy NADH oraz na etapie przekazywania elektronów z ubichinonu na cytochrom b. Rodnik ponadtlenkowy może również zostać utworzony w procesie redukcji tlenu cząsteczkowego przez mieloperoksydazę (MPO) i oksydazę NADPH kluczowe enzymy uczestniczące w pierwszej linii obrony przed patogenami. Dalsza jego redukcja przez dysmutazę ponadtlenkową (SOD) prowadzi do powstania nadtlenku wodoru H 2 [11]. Sam rodnik ponadtlenkowy uważa się za relatywnie mało reaktywny, jednak może on ulec konwersji do o wiele bardziej reaktywnych rodników: peroksylowego (R ), alkoksylowego (RO ) oraz hydroksylowego Tabela 1. Najbardziej powszechne reaktywne formy tlenu i azotu [4, 36, 41] Table 1. The most common reactive oxygen and nitrogen species [4, 36, 41] Reaktywne formy tlenu (RFT) Reaktywne formy azotu (RFA) tlen singletowy 1 tlenek azotu NO anionorodnik ponadtlenkowy anion nitrozylowy NO rodnik hydroksylowy HO kation nitrozylowy NO + nadtlenek wodoru H 2 dwutlenek azotu N rodnik alkoksylowy RO kation nitrylowy N + rodnik nadtlenkowy R nadtlenoazotyn ONOO (HO ). Stężenie RFT w komórkach jest ściśle kontrolowane przez całą grupę niskocząsteczkowych antyoksydantów, takich jak zmiatacze wolnych rodników tioredoksyna, glutation, tokoferole oraz przez antyoksydacyjne enzymy: katalazę (CT) i dysmutazę ponadtlenkową (SOD). W sytuacji zaburzenia równowagi pro- i antyoksydacyjnej dochodzi do stresu oksydacyjnego, co może prowadzić do śmierci komórki na drodze nekrozy lub apoptozy. Ze stresem oksydacyjnym ściśle jest związany stres nitrozacyjny [11, 41]. Tlenek azotu (NO) powstaje z argininy przy udziale syntazy tlenku azotu (NOS). Wyróżnia się trzy podstawowe izoformy NOS: neuronalną (nnos), endotelialną (enos) oraz indukowalną (inos). Tlenek azotu jest cząsteczką o krótkim czasie półtrwania, rzędu kilku sekund, jednocześnie będąc wysoce reaktywną formą tlenu. Potrafi reagować z tlenem cząsteczkowym, anionorodnikiem ponadtlenkowym i kationami metali, dając kolejne reaktywne formy tlenu. RFT i reaktywne formy azotu (RFA, tab. 1) mogą powstawać w komórkach w odpowiedzi na stres, uczestnicząc jako wtórny przekaźnik w stymulowaniu śmierci komórki przez pośrednią aktywację szlaków apoptotycznych lub bezpośrednie oddziaływanie na białka komórki. Reagując z białkami, powodują upośledzenie ich funkcji na skutek utlenienia bądź nitrozylacji reszt aminokwasowych. Często jest to przyczyną skierowania komórki na drogę apoptozy, która jest procesem regulowanym przez wiele szlaków sygnałowych. Może zostać wyindukowana przez uszkodzenia DNA, pozbawienie czynników wzrostowych czy też wiązanie się specyficznych ligandów do receptorów śmierci (death receptors) [41]. Wszystkie te czynniki aktywują postranslacyjne zmiany w białkach, co nieuchronnie kieruje komórkę na drogę apoptozy. Wśród postranslacyjnych modyfikacji białek występują zarówno nie-

314 M. Ługowski i wsp. enzymatyczne, jak i typowo enzymatyczne fosforylacja oraz specyficzne cięcie białek, charakterystyczne dla szlaków kaspaz. MODYFIKACJE BIAŁEK, WYINDUKOWANE RFT I RFA Reaktywne formy tlenu i azotu uszkadzają białka, lipidy i węglowodany. Uważa się, że zmienione w ten sposób białka mogą mieć znaczący wpływ na szlaki przekazywania sygnału. W tabeli 2 przedstawiono powszechne modyfikacje białek wywołane wolnymi rodnikami. Zmiany te mogą być odwracalne, np. w przypadku modyfikacji reszt cysteinowych, lub nieodwracalne, czyli karbonylacja i powstawanie dityrozyn [3, 4, 16, 25, 31]. Tlenek azotu Tlenek azotu (NO), reaktywna forma tlenu, jest jedną z głównych cząsteczek sygnałowych w neuronach i układzie immunologicznym. Działa w miejscu swego powstania bądź przenika przez błony komórkowe do otaczających komórek. Powstaje z argininy w reakcji katalizowanej przez syntazę tlenku azotu (NOS). W naczyniach krwionośnych NO reaguje z jonem żelaza centrum aktywnego cyklazy guanylowej (GC), indukując wytwarzanie mediatora międzykomórkowego, cyklicznego GMP (cgmp). W wyniku tego procesu zwiększa się uwalnianie neurotransmiterów, co prowadzi w rezultacie do relaksacji mięśni gładkich śródbłonka oraz rozszerzenia światła naczyń krwionośnych. Zewnątrzkomórkowo NO reaguje z tlenem i wodą, tworząc azotany i azotyn. Jego toksyczność wynika ze zdolności do tworzenia nadtlenoazotynu (ONOO ) w reakcji z anionorodnikiem ponadtlenkowym ( ). Ten wysoce reaktywny utleniacz może powodować uszkodzenia DNA oraz utlenianie lipidów. W mitochondriach ONOO oddziałuje na kompleksy I IV łańcucha oddechowego oraz na mitochondrialną dysmutazę ponadtlenkową (MnSOD), powodując wytwarzanie odpowiednio anionów ponadtlenkowych i nadtlenku wodoru (H 2 ) (ryc. 1) [4, 6, 7]. Fizjologiczna rola tlenku azotu Tlenek azotu może być wytwarzany przez wiele komórek powiązanych z odpowiedzią immunologiczną organizmu. Makrofagi uaktywnione cytokinami wytwarzają duże ilości NO, by zniszczyć komórki docelowe, takie jak bakterie bądź komórki nowotworowe. Tlenek azotu, wzmacniając efekt indukowany cyklooksygenazami, staje się mediatorem stanu zapalnego. Wytwarzanie NO przez indukowalną izoformę tlenku azotu (inos) może być ponadto stymulowane wieloma różnymi czynnikami powiązanymi ze stanem zapalnym, m.in. interleukinami, interferonem gamma, TNF- i LPS. Wykazano również istotną rolę tlenku azotu w regulacji procesu apoptozy. Wpływ pro- lub antyapoptotyczny NO zależy przede wszystkim od jego stężenia oraz typu komórek, na które oddziałuje. Tlenek azotu jest w stanie chronić przed apoptozą komórki śródbłonka, hepatocyty, leukocyty i trofoblasty. Bezpośrednim antyapoptotycznym efektem wywołanym przez NO jest S-nitrozylacja odpowiednich kaspaz, zwłaszcza kaspazy 3 i 8. Inne mechanizmy to aktywacja białka p53 i szlaku przekazywania sygnału przez cgmp oraz wyindukowanie nadekspresji białka szoku cieplnego 70, białek Bcl-2 i Bcl-XL, co prowadzi do zahamowania wypływu cytochromu c z mitochondriów. NO, oddziałując z hemem cyklazy guanylowej, indukuje syntezę cgmp, co przyczynia się do aktywacji cgmp-zależnych kaspaz oraz wzmożonej ekspresji antyapoptotycznych białek [11, 12]. Syntazy tlenku azotu Tlenek azotu jest syntetyzowany przez grupę enzymów, zwaną syntazami tlenku azotu, w wyniku konwersji argininy do cytruliny w obecności tlenu i NADPH jako niezbędnych kofaktorów. Wyróżnia się, o czym już wpsomniano trzy główne izoformy syntazy tlenku azotu w zależności od umiejscowienia w tkance: izoformę neuronalną (nnos), endotelialną (enos) oraz indukowalną (inos). W literaturze można znaleźć inny podział opierający się na numeracji: nnos oznacza się jako NOS1, inos NOS2, a enos NOS3. Nazewnictwo może sugerować, że istnieje tylko jedno źródło poszczególnych lizoform. Wszystkie trzy można jednak wyizolować z wielu różnych tkanek i rodzajów komórek. Biorą one udział w wielu procesach przekazywania sygnału, takich jak regulacja skurczu naczyń krwionośnych czy komunikacja międzyneuronalna [6, 22]. Dwie główne izoformy endotelialna (enos) i neuronalna (nnos) są konstytutywnie syntetyzowane w komórkach, odpowiadając za większość szlaków przekazywania sygnału powiązanych z tlenkiem azotu (NO) [6, 30, 39]. Wykazano, że trzecia izoforma indukowalna (inos) stanowi źródło cytotoksycznych ilości tlenku azotu. Nadmiar NO służy nieswoistej odpowiedzi immunologicznej organizmu lub aktywności antynowotworowej [5, 26]. Wszystkie trzy izoformy mają podobną strukturę cząsteczki [14, 28, 35] są homodimerami. Każdy z monomerów ma domenę reduktazową, Tabela 2. Powszechne modyfikacje białek wywołane wolnymi rodnikami [3, 11] Table 2. The common modifications of protein induced by free radicals [3, 11] Aminokwas RFT/RFA Produkt Arg HO (+ inne) kwas 5-hydroksy-2-aminowalerianowy Cys NO S-nitrozylacja Cys HO (+inne) Cys-SH, Cys-SOH, Cys-SO2H, Cys-SO3H, utworzenie mostków disiarczkowych (wewnątrzlub międzycząsteczkowych), mieszane (Cys-S-S-glutation) Glu HO (+ inne) wodoronadtlenki kwasu glutaminowego His HO (+ inne) 2-oksyhistydyna/2-oxohistydyna Leu/Val/Lys/Pro/Ile/Tyr HO (+ inne) wodoronadtlenki i hydroksypochodne aminokwasów Lys, Arg, Pro, Thr HO (+ inne) utworzenie grupy karbonylowej przez bezpośrednie utlenienie Lys, Cys, His HO (+ inne) karbonylacja przez oddziaływanie z produktami utleniania lipidów i glikanów Met HO (+ inne) sulfotlenek metioniny Phe HO o-tyrozyna, m-tyrozyna Trp HO (+ inne) N-formylokinurenina, kinurenina, 5-hydroksytryptofan, 7-hydroksytryptofan Tyr HO lub RFA DOPA Tyr HOCl 3-chlorotyrozyna Tyr RFA 3-nitrotyrozyna Tyr HO (+ inne) dityrozyna (Tyr-Tyr)

Reaktywne formy tlenu i azotu 315 fragmentacja DNA śmierć komórki mitochondrium Ryc. 1. Rola tlenku azotu w komórce. Zmodyfikowano na podstawie http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-biology/learning-center/pathway-slidesand.html Fig. 1. The role of nitric oxide in the cell. Modified according the following website: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-biology/learning-center/ pathway-slides-and.html. w której skład wchodzi miejsce wiązania dla FMN, FAD i NADPH, domenę oksygenazową, wiążącą tetrahydrobiopterynę (H 4 B) oraz żelazową protoporfirynę IX (ryc. 2) [15]. Ryc. 2. Schemat budowy syntazy tlenku azotu. Zmodyfikowany na podstawie [26] Fig. 2. The scheme of nitric oxide synthase modified according [26] W przypadku obu konstytutywnych izoform zależne od jonów wapnia wiązanie kalmoduliny umożliwia transfer elektronów pochodzących od NADPH z flawin na hem oraz inicjację syntezy tlenku azotu [35]. Reakcja katalizowana przez trzy izoformy jest praktycznie identyczna. Enzymy te wykonują dwustopniowe utlenienie L-argininy do L-cytruliny przez pośredni związek N-hydroksy-L-argininę, w wyniku czego powstaje tlenek azotu (ryc. 3 i 4) [1]. Mechanizm ten jest analogiczny do monooksygenacji katalizowanej przez cytochromy P450 [13, 29]. Aktywna cząsteczka syntazy tlenku azotu jest dimerem składającym się z dwóch identycznych podjednostek. W budowie każdej z izoform można wyróżnić trzy regiony: domenę reduktazową, domenę wiążącą kalmodulinę oraz domenę oksygenazową. Zadaniem domeny reduktazowej, zawierającej FAD i FMN jako grupy funkcyjne, jest transport elektronów z NADPH do domeny oksygenazowej przeciwległej podjednostki. Taki transport elektronów nie następuje w obrębie tej samej podjednostki. Wiązanie kalmoduliny jest niezbędne do zachowania aktywności każdej z izoform syntazy tlenku azotu. W komórkach ssaków konstytutywnie ekspresjonowane są dwie izoformy nnos i enos. Syntetyzują one NO w odpowiedzi na zwiększone wewnątrzkomórkowe stężenie jonów wapnia (Ca 2+ ) [2]. Wykazano, że w niektórych przypadkach możliwa jest niezależna droga aktywacji tych enzymów w odpowiedzi na stres. Aktywność izoformy induko- 2 elektrony 1 elektron L-arginina N-hydroksy-arginina (NOHA) L-cytrulina Ryc. 3. Reakcja katalizowana przez trzy izoformy syntazy tlenku azotu. Zmodyfikowano na podstawie [27, 32] Fig. 3. The reaction catalyzed by Tyree isoforms of nitric oxide synthase modified according [27, 32]

316 M. Ługowski i wsp. Ryc. 4. Cykl katalityczny NOS. Końcowy produkt syntezy NO kompleks Fe III -NO efektywnie uwalnia tlenek azotu, regenerując cząsteczkę NOS. Zmodyfikowano na podstawie [32, 37] Fig. 4. The catalytic cycle of NOS. The final product of NO synthesis Fe III -NO complex releases effectively NO with regeneration of NOS molecule. Modified according [32, 37] walnej nie zależy od stężenia wapnia w komórce, jak w przypadku dwóch pozostałych izoform, lecz zależy od związania kalmoduliny. Zwiększenie stężenia wewnątrzkomórkowego wapnia powoduje zwiększenie ilości kalmoduliny, co pociąga za sobą jej wzmożone wiązanie się do izoformy enos oraz nnos enzymu, prowadząc do chwilowego nasilenia syntezy NO. W odróżnieniu od izoformy neuronalnej i endotelialnej, inos jest w stanie wiązać się z kalmoduliną nawet przy małym stężeniu wewnątrzkomórkowego wapnia. Powoduje to aktywność tej izoformy niezależną od zmian stężenia Ca 2+, co prowadzi do dłuższego okresu syntezy tlenku azotu oraz zwiększenia lokalnego stężenia NO w komórce w porównaniu z pozostałymi izoformami [28, 40]. Syntazy tlenku azotu źródło RFT i RFA U ssaków tlenek azotu jest wytwarzany przez syntazy tlenku azotu (NOS). Enzymy te są również pośrednio odpowiedzialne za wytwarzanie nadtlenoazotynu (ONOO) jednego z bardziej cytotoksycznych reaktywnych form azotu. Procesy towarzyszące reaktywności nadtlenoazotynu są bardzo złożone, angażują wiele aktywatorów, z czego najważniejsze są hemoproteiny. Syntazy tlenku azotu, mając unikalną zdolność zarówno do syntezy, jak i aktywacji nadtlenoazotynu, uważa się za główny czynnik regulujący aktywność biologiczną ONOO. Domena oksygenazowa indukowalnej izoformy syntazy tlenku azotu (inosoxy) jest odpowiedzialna za wiązanie nadtlenoazotynu i jego rozkład. Prawdopodobny mechanizm reakcji polega na homolizie związanego przez inosoxy nadtlenoazotynu z jednoczesnym nagromadzeniem utlenowanych form pośrednich i uwolnieniem rodnika N. Kolejne cykle aktywacji nadtlenoazotynu mogą powodować w rezultacie autokatalityczną nitrację i inaktywację domeny oksygenazowej. Zachowanie równowagi między aktywacją ONOO a autoinhibicją domeny inosoxy może odgrywać kluczową rolę w procesie wpływania syntaz tlenku azotu na indukcję w komórkach stresu oksydacyjnego [32, 37, 40]. Bezpośrednio przed uwolnieniem NO wiąże się z hemem. W związku z tym produkt końcowy katalizy nie może być rozpatrywany jako tlenek azotu, lecz jako kompleks hemu z NO: Fe III -NO lub Fe II -NO. Jest to powodem dwóch cykli katalitycznych, wywołujących z jednej strony uwolnienie tlenku azotu z kompleksu Fe III -NO, z drugiej dalsze utlenianie NO z kompleksu Fe II -NO, prowadzące do powstania reaktywnych form azotu (ryc. 5) [32, 38]. Syntazy tlenku azotu są również zdolne do wytwarzania nadtlenoazotynu innymi sposobami. W warunkach rozprzęgających NOS są skłonne wytwarzać anionorodnik ponadtlenkowy, który wchodzi w reakcje z powstającym NO. W jej wyniku powstaje nadtlenoazotyn [36]. Z drugiej strony, w przypadku niewystępowania tetrahydrobiopteryny dochodzi do nagromadzenia kompleksu Fe II -NO, reagującego bezpośrednio z tlenem, co prowadzi do powstania nadtlenoazotynu bądź do uwolnienia nitroksylu (NO ), który reagując z tlenem, utworzy ONOO [1, 23]. W świetle tego panuje przekonanie, że syntazy tlenku azotu, poza swoją fizjologiczną funkcją, są źródłem nadtlenoazotynu cząsteczki uszkadzającej wiele biomolekuł. Ta dwoista ich funkcjonal- Ryc. 5. Cykl katalityczny NOS generujący reaktywne formy azotu. W przypadku nieobecności H 4 B lub redukcji kompleksu Fe III -NO dochodzi do nagromadzenia kompleksu Fe II -NO, który jest w niewielkim stopniu zdolny do uwalniania NO. Jest on utleniany do postaci natywnej z jednoczesnym wytwarzaniem reaktywnych form azotu (RFA). Zmodyfikowano na podstawie [27, 37, 38, 40] Fig. 5. The catalytic cycle of NOS generates reactive nitro gen species. There is accumulation of Fe II -NO complex in case of absence of H 4 B or reduction of Fe III -NO complex. Fe II -NO can slightly release NO, which is oxidized to its native form with simultaneous production of reactive nitrogen species (RNS). Modified according [27, 37, 38, 40] ność może tłumaczyć duży obszar ich fizjologicznego oddziaływania. Nadtlenoazotyn wykazuje wszechstronne działanie od jedno- i dwuelektronowych utlenień do nitracji i nitrozylacji wielu cząsteczek [33, 34]. Jego reaktywność zależy od warunków środowiskowych i wymaga obecności akceptorów pary elektronowej (kwasów Lewisa), takich jak C, metale i protony [17, 24]. Oddziaływanie centrów katalitycznych niektórych metaloprotein [9], hemorotein [18 22], peroksydaz [10] i cytochromów P450 [8, 9, 10, 18, 28] z nadtlenoazotynem powodowało jego rozkład. Reaktywność nadtlenoazotynu różni się w zależności od rodzaju hemoproteiny. Wykazano, że nadtlenoazotyn może zostać unieszkodliwiony w wyniku izomeryzacji do azotanu przez mioglobinę [19]. Z drugiej zaś strony, oddziaływanie z białkami typu cytochrom P450 powoduje ich uszkodzenie na skutek nitrozylacji określonych reszt tyrozyn [10]. PODSUMOWANIE Reaktywne formy tlenu (RFT) i azotu (RFA) powstają w każdej żywej komórce organizmu podczas fizjologicznego procesu oddychania. RFT wchodzą w reakcje z najważniejszymi strukturami i cząsteczkami komórkowymi, modyfikując ich biologiczne funkcje. Podobnie RFA oddziałują na komórki fizjologicznie lub wytwarzają różnorodne produkty, które mogą być toksyczne. RFT i RFA pełnią ważną rolę w procesie wytwarzania energii, utleniania, peroksydacji lipidów, nitracji, nitrozowania, nitrozylacji białek i DNA. Reaktywne formy tle-

Reaktywne formy tlenu i azotu 317 nu oraz reaktywne formy azotu są inaktywowane enzymatycznie lub przez naturalne związki antyoksydacyjne. Nadmierne wytwarzanie RFT i (lub) RFA może doprowadzić do zjawiska stresu oksydacyjnego lub azotowego, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach patologicznych, leżących u podłoża wielu chorób o etiologii wirusowej, toksycznej lub zapalnej. PIŚMIENNICTWO 1. Adak S., Wang Q., and Stuehr D.J.: Arginine conversion to nitroxide by tetrahydrobiopterin-free neuronal nitric-oxide synthase. Implications for mechanism. J. Biol. Chem., 2000; 275; 33554-33561. 2. Arnal J.F., Dinh-Xuanb A.T., Pueyoc M., Darbladea B., Ramia J.: Endothelium-derived nitric oxide and vascular physiology and pathology. Cell. Mol. Life Sci., 1999; 55; 1078-1087. 3. Aulak K.S., Miyagi M., West K.A. et al.: Proteomic method identifies proteins nitrated in vivo during inflammatory challenge., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001; 98; 12056-12061. 4. Bailey S.M., Landar A., Darley-Usmar V.: Mitochondrial proteomics in free radical research. Free Radic. Biol. Med., 2005; 38; 175-188. 5. Bogdan C.: Nitric oxide and the immune response. Nat. Immunol., 2001; 2; 907-916. 6. Bredt D.S. Nitric oxide signaling specificity the heart of the problem. J. Cell Sci., 2003; 116; 9-15. 7. Brown G.C.: Nitric oxide and mitochondrial respiration. Biochim. Biophys. Acta., 1999; 1411; 351-369. 8. Daiber A., Ullrich V.: Peroxynitrite reactions with heme and heme-thiolate (P450) proteins. Methods Enzymol., 2002; 359; 379-389. 9. Daiber A., Bachschmid M., Beckman J.S., Munzel T., Ullrich V.: The impact of metal catalysis on protein tyrosine nitration by peroxynitrite. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004; 317; 873-881. 10. Daiber A., Herold S., Schoneich C. et al.: Nitration and inactivation of cytochrome P450BM-3 by peroxynitrite. Stopped-flow measurements prove ferryl intermediates. Eur. J. Biochem., 2000; 267; 6729-6739. 11. Dalle-Donne I., Scaloni A., Giustarini D. et al.: Proteins as biomarkers of oxidative/nitrosative stress in diseases: the contribution of redox proteomics. Mass Spectrom. Rev., 2005; 24; 55-99. 12. Dash P.R., Cartwright J.E., Baker P.N., Johnstone A.P., Whitley G.St.J.: Nitric oxide protects human extravillous trophoblast cells from apoptosis by cyclic GMP dependent mechanisms and independently of caspase-3 nitrosylation. Exp. Cell. Res., 2003; 2872; 314-324. 13. Denisov I. G., Makris T.M., Sligar S.G., Schlichting I.: Structure and Chemistry of Cytochrome P450. Chem. Rev., 2005; 105; 2253-2277. 14. Fischmann T.O., Hruza A., Niu X. D. et al.: Structural characterization of nitric oxide synthase isoforms reveals striking active-site conservation. Nat. Struct. Biol., 1999; 6; 233-242. 15. Garcin E.D., Bruns, C.M., Lloyd S.J. et al.: Structural Basis for Isozymespecific Regulation of Electron Transfer in Nitric-oxide Synthase. J. Biol. Chem., 2004; 279; 37918-37927. 16. Ghezzi P., Bonetto V.: Redox proteomics: identification of oxidatively modified proteins. Proteomics, 2003; 3; 1145-1153. 17. Goldstein S., Lind J., Merenyi G.: Chemistry of peroxynitrites as compared to peroxynitrates. Chem. Rev., 2005; 105; 2457-2470. 18. Herold S., Fago A.: Reactions of peroxynitrite with globin proteins and their possible physiological role. Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol., 2005;142; 124-129. 19. Herold S., Shivashankar K.: Metmyoglobin and methemoglobin catalyze the isomerization of peroxynitrite to nitrate. Biochem., 2003; 42; 14036-14046. 20. Herold S., Matsui T., Watanabe Y.: Peroxynitrite Isomerization Catalyzed by His64 Myoglobin Mutants. J. Am. Chem. Soc., 2001; 123; 4085-4086. 21. Herold S., Shivashankar K., Mehl M.: Myoglobin scavenges peroxynitrite without being significantly nitrated. Biochem., 2002; 41; 13460-13472. 22. Ignarro L.J., Nitric Oxide: Biology and Pathobiology. Academic Press, San Diego 2000. 23. IshimuraY., Gao Y. T., Panda S. P. et al.: Detection of nitrous oxide in the neuronal nitric oxide synthase reaction by gas chromatography - mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005; 338; 543-549. 24. Koppenol W.H.: 100 years of peroxynitrite chemistry and 11 years of peroxynitrite biochemistry. Redox Rep., 2001; 6; 339-341. 25. Korolainen M.A., Goldsteins G., Alafuzoff I., Koistinaho J., Pirttila T.: Proteomic analysis of protein oxidation in Alzheimer s disease brain. Electrophoresis., 2002; 23; 3428-3433. 26. Lowenstein C.J., Padalko E.: inos NOS2 at a Glance. J. Cell Sci., 2004; 117; 2865-2867. 27. Maréchal A., Mattioli T. A., Stuehr D. J., Santolini J.: Activation of peroxynitrite by inducible nitric-oxide synthase. A direct source of nitrative Stress., J. Biol. Chem., 2007; 282 (19); 14101-14112. 28. Mehl M., Daiber A., Herold S., Shoun H., Ullrich V.: Peroxynitrite reaction with heme proteins. Nitric Oxide., 1999; 3 (2); 142-152. 29. Meunier B., de Visser S.P., Shaik S.: Mechanism of Oxidation Reactions Catalyzed by Cytochrome P450 Enzymes. Chem. Rev., 2004; 104; 3947-3980. 30. Mungrue I.N., Bredt D.S.: nnos at a glance: implications for brain and brawn. J. Cell Sci., 2004; 117; 2627-2629. 31. Nakamura A., Goto S.: Analysis of protein carbonyls with 2,4-dinitrophenyl hydrazine and its antibodies by immunoblot in twodimensional gel electrophoresis. J. Biochem., 1996; 119; 768-774. 32. Negrerie M., Berka V., Vos M.H. et al.: Geminate recombination of nitric oxide to endothelial nitric oxide-synthase and mechanistic implications. J. Biol. Chem., 1999; 274; 24694-24702. 33. Pfeiffer S., Lass. A, Schmidt K., Mayer B.: Protein tyrosine nitration in mouse peritoneal macrophages activated in vitro and in vivo: evidence against an essential role of peroxynitrite. FASEB J., 2001; 15; 2355-2364. 34. Radi R., Peluffo G., Alvarez M.N., Naviliat M., Cayota A.: Unraveling peroxynitrite formation in biological systems. Free Radic. Biol. Med., 2001; 30; 463-488. 35. Roman L.J., Martasek P., Masters B.S.: Intrinsic and Extrinsic Modulation of Nitric Oxide Synthase Activity. Chem. Rev., 2002; 102; 1179-1190. 36. Rosen G.M., Tsai P., Pou S.: Mechanism of free-radical generation by nitric oxide synthase. Chem. Rev., 2002; 102; 1191-1200. 37. Santolini J., Adak S., Curran C.M., Stuehr D.J.: A kinetic simulation model that describes catalysis and regulation in nitric-oxide synthase. J. Biol. Chem., 2001; 276; 1233-1243. 38. Santolini J., Meade A.L., Stuehr D.J.: Differences in three kinetic parameters underpin the unique catalytic profiles of nitric-oxide synthases I, II, and III. J. Biol. Chem., 2001; 276; 48887-48898. 39. Sessa W.C.: enos at a glance. J. Cell Sci., 2004; 117; 2427-2429. 40. Stuehr D.J., Santolini J., Wang Z.Q., Wei C.C., Adak S.: Update on mechanism and catalytic regulation in the NO synthases. J. Biol. Chem., 2004; 279; 36167-36170. 41. Tripathi P., Hildeman D.: Sensitization of T cells to apoptosis a role for ROS? Apoptosis., 2004; 9; 515-523. 42. Alderton W.K., Cooper C.E., Knowles R.G.: Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem. J., 2001; 357; 593-615. Adres: dr inż. Julita Kulbacka, Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Akademia Medyczna, 50-368 Wrocław, ul. Chałubińskiego 10, tel. 71 784 13 75, faks 71 784 00 85, e-mail: jkulbacka@gmail.com