Znaczenie reaktywnych form tlenu i azotu w patomechanizmie procesu zapalnego

Transkrypt

1 Znaczenie reaktywnych form tlenu i azotu w patomechanizmie procesu zapalnego 131 Znaczenie reaktywnych form tlenu i azotu w patomechanizmie procesu zapalnego RYSZARD RUTKOWSKI 1, SŁAWOMIR A. PANCEWICZ 2, KRZYSZTOF RUTKOWSKI 3, JOANNA RUTKOWSKA 4 Akademia Medyczna w Białymstoku: 1 Samodzielna Pracownia Diagnostyki Oddechowej i Bronchoskopii, kierownik: dr hab. med. Z. Siergiejko, 2 Klinika Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji, kierownik: dr hab. med. S.A. Pancewicz, 3 Queen Mary s Sidcup NHS Trust, kierownik: A.G. Jariwalla MD, FRCP, 4 Wydział Pielęgniarstwa i Ochrony Środowiska Znaczenie reaktywnych form tlenu i azotu w patomechanizmie procesu zapalnego Rutkowski R. 1, Pancewicz S.A 2, Rutkowski K. 3, Rutkowska J. 4 Akademia Medyczna w Białymstoku: 1 Samodzielna Pracownia Diagnostyki Oddechowej i Bronchoskopii, rutkowski@csk.pl; 2 Klinika Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji; 3 Queen Mary s Sidcup NHS Trust; 4 Wydział Pielęgniarstwa i Ochrony Środowiska Reaktywne formy tlenu ROS powstają w każdej żywej komórce organizmu podczas fizjologicznego procesu oddychania. Do najważniejszych ROS zaliczamy: aniorodnik ponadtlenkowy ( ), rodnik hydroksylowy (OH ), rodnik wodoronatlenkowy (H ), nadtlenek wodoru (H 2 ) oraz tlen singletowy ( 1 ). Reaktywne formy tlenowe reagują z najważniejszymi strukturami i cząsteczkami komórkowymi zmieniając ich biologiczne funkcje. Podobnie, reaktywne formy azotowe RNS (ang. reactive nitrogen species), takie jak: tlenek azotu (NO) czy nadtlenoazotyn (ONOO ) działają na komórki fizjologicznie lub wytwarzają różnorodne produkty toksyczne. ROS i RNS spełniają ważną role w procesie wytwarzania energii, peroksydacji lipidów, utleniania, nitracji, nitrozowania, nitrozylacji białek i DNA oraz w odpowiedzi organizmu na katecholaminy. Reaktywne formy tlenowe oraz reaktywne formy azotu są inaktywowane enzymatycznie lub przez naturalne związki antyoksydacyjne. Nadmierne wytwarzanie ROS i/lub RNS prowadzi do stresu oksydacyjnego lub azotowego, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach patologicznych, typowych dla choroby nowotworowej, schorzeń neurodegeneracyjnych, czy chorób o etiologii wirusowej, toksycznej lub zapalnej. Słowa kluczowe: reaktywne formy tlenu, reaktywne pochodne azotowe, stres oksydacyjny, zmiany patologiczne Pol. Merk. Lek., 2007, XXIII, 134, 131 Reactive oxygen and nitrogen species in inflammatory process Rutkowski R. 1, Pancewicz S.A 2, Rutkowski K. 3, Rutkowska J. 4 Medical University of Bialystok, Poland: 1 Laboratory of Respiratory Diagnostics and Bronchoscopy, rutkowski@csk.pl, 2 Department of Infectious Diseases and Neuroinfections; 3 Queen Mary s Sidcup NHS Trust, United Kingdom; 4 Nursing and Environment Protection Division Reactive oxygen species (ROS ) are generated in every cell during normal oxidation. The most important ROS include: superoxide anion ( ), hydroxyl radical (OH ), hydroperoxyl radical (H ), hydrogen peroxide (H 2 ) and singlet oxygen ( 1 ). Reactive oxygen species can react with key cellular structures and molecules altering their biological function. Similarly reactive nitrogen species (RNS) such as nitric oxide (NO) or peroxinitrite anion (ONOO ) have physiological activity or reacts with different types of molecules to form toxic products. ROS and RNS are important in process of energy generation, lipids peroxidation, protein and DNA oxidation, nitration, nitrosation or nitrosylation and catecholamine response. Reactive oxygen/nitrogen species are neutralized by enzymatic activity or natural antioxidants that stop the initial formation of radicals. Overproduction of ROS or RNS results in oxidative or nitrosative stress which contributes to variety of pathological processes typical for different cancer, neurodegenerative, viral, toxic or inflammatory diseases. Key words: reactive oxygen species, reactive nitrogen species, oxidative stress, pathological changes Pol. Merk. Lek., 2007, XXIII, 134, 131 Reaktywne formy tlenu ROS (ang. reactive oxygen species) są produktami wzbudzenia lub redukcji tlenu cząsteczkowego. Powstają one m.in. w wyniku przyłączenia do cząsteczki tlenu mniejszej niż cztery liczby elektronów (ryc. 1). Do reaktywnych form tlenu należą zarówno rodniki tlenowe, które mają niesparowane elektrony na atomie tlenu, np. rodnik wodorotlenowy, jak i te pochodne tlenowe, które niesparowanych elektronów nie mają, np. nadtlenek wodoru. Związki te są bardziej aktywne niż tlen w stanie podstawowym [6, 19, 33]. WŁAŚCIWOŚCI BIOLOGICZNE REAKTYWNYCH FORM TLENU W organizmie reaktywne formy tlenu (tab. 1) mogą powstawać w wyniku działania zewnętrznych czynników fizycznych, takich jak promieniowanie jonizujące lub nadfioletowe, które mają jednak niewielkie znaczenie biologiczne [10, 12, 19, 20]. Ze względu na ciągłość działania znacznie bardziej istotna jest wewnątrzkomórkowa generacja ROS, wynikająca z jednoelektronowego utleniania zredukowanych form wielu związków zarówno endojak i egzogennych przez tlen cząsteczkowy oraz reakcje enzymatyczne. Źródła powstania ROS w komórce zostały dokładnie poznane. Należą do nich m.in.: aktywowane fagocyty, mitochondrialny i mikrosomalny łańcuch oddechowy, autooksydacja związków endo- i egzogennych, reakcje katalizowane przez oksydazy oraz przez jony metali przejściowych. W większości przemian biologicznych jako pierwszy wytwarzany jest anionorodnik ponadtlenkowy, którego pojawienie się pociąga za sobą powstawanie następnych ROS, np. nadtlenku wodoru czy rodnika hydroksylowego [7, 12, 14, 20]. ANIONORODNIK PONADTLENKOWY ( ) Anionorodnik ponadtlenkowy jest produktem jednoelektronowej redukcji tlenu cząsteczkowego. Powstaje on głównie na skutek przecieku elektronów w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym. Ponadto anionorodnik ponadtlenkowy powstaje w organizmie w reakcji utleniania ksantyny do kwasu moczowego katalizowanej przez oksydazę ksantynową przy udzia-

2 132 R. Rutkowski i wsp. Reaktywne formy tlenu Nadtlenek wodoru (H 2 ), będący produktem dwuelektronowej redukcji tlenu, powstaje w wyniku reakcji dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego lub podczas dwuelektronowej redukcji tlenu cząsteczkowego pod wpływem takich enzymów, jak oksydaza ksantynowa lub oksydaza moczanowa. W obecności jonów metali przejściowych ulega rozpadowi do rodnika wodorotlenowego i anionu wodorotlenowego (reakcja Fentona). H 2 M n / M n+1 OH + OH H Nadtlenek wodoru H 2 H Tlen singletowy 1 Nadtlenek wodoru z łatwością dyfunduje przez błony komórkowe i dlatego może przemieszczać się do komórek znacznie odległych od miejsca swego powstania. Niewykorzystany przez komórkę jest w niej rozkładany przez katalazę oraz peroksydazy [10, 12, 14, 20]. RODNIK HYDROKSYLOWY Anionorodnik ponadlenkowy le reduktazy NADPH i cytochromu P-450 podczas metabolizmu ksenobiotyków w mikrosomach [12, 18, 20, 21]. Anionorodnik ponadtlenkowy jest również wytwarzany przez aktywowane fagocyty. Ze względu na ładunek elektryczny, anionorodnik ponadtlenkowy nie może przenikać przez błony komórkowe dlatego w czasie transportu przez błony ulega on protonacji do rodnika wodoronadtlenkowego, który po przejściu przez błonę dysocjuje tworząć ponownie anionorodnik ponadtlenkowy [12, 14, 18, 20]. NADTLENEK WODORU Rodnik hydroksylowy OH Ryc. 1. Rozmieszczenie elektronów w ROS [19] w modyfikacji własnej Fig. 1. Model of electron position of ROS, modified from [19] Najbardziej reaktywnym z ROS jest rodnik hydroksylowy (OH ), który powstaje w wyniku reakcji Fentona. Nie ma on zdolności przenikania przez błony komórkowe [7, 10, 18, 21]. Anionorodnik ponadtlenkowy i nadtlenek wodoru wykazują długi okres półtrwania, ale są stosunkowo mało reaktywne. W reakcji Habera-Wiessa mogą się przekształcać w bardzo reaktywne rodniki hydroksylowe. Reakcja ta, opisana przez Fentona, zachodzi tylko w obecności jonów związków organicznych zawierających metale. Reakcja Habera-Weissa obejmuje reakcję redukcji jonów Fe 3+ przez i reakcję Fentona: Fe 3+ + Fe 2+ + Fe 2+ + H 2 Fe 3+ + OH + OH Jej sumaryczny zapis jest następujący: Fe 2+ / Fe 3+ + H 2 OH + OH + Rodnik hydroksylowy jest jednym z najbardziej reaktywnych utleniaczy. Może on utleniać praktycznie wszystkie ważne biologicznie związki występujące w organizmie, zależnie jedynie od szybkości dyfuzji [7, 10, 12, 14, 40]. REAKTYWNE FORMY AZOTU Drugą grupą związków o niesparowanych elektronach i/lub charakteryzujących się dużą reaktywnością chemiczną są Tabela 1. Reaktywne formy tlenu [6, 7, 12, 13, 18-21, 31, 33] Table 1. Reactive oxygen species [6, 7, 12, 13, 18-21, 31, 33] Nazwa Rodnik ponadtlenkowy, aniorodnik ponadtlenkowy Superoxide anion Rodnik hydroksylowy, rodnik wodorotlenowy Hydroxyl radical Rodnik wodoronadtlenkowy Hydroperoxyl radical Nadtlenek wodoru Hydrogen peroxide Tlen singletowy Oxygen singlet Symbol OH H H 2 1 Właściwości ROS rodnikowe i nierodnikowe pochodne tlenu Rodnikowe pochodne tlenu Powstaje w wyniku jednoelektronowej redukcji tlenu cząsteczkowego: + e =. Głównym jego źródłem w komórkach jest wyciek elektronów z łańcucha oddechowego Powstaje w wyniku rozpadu wiązania O-O w cząsteczce H 2 pod wpływem wysokiej temperatury, promieniowania jonizującego lub w reakcjach H 2 z metalami, np. żelazem lub miedzią (reakcja Fentona): H 2 + Fe +2 = OH + OH + Fe +3 Może również powstawać w reakcjach i H 2 z jonami żelazawymi Fe 3+ (reakcja Habera-Weissa): + H 2 = + OH + OH Jest jednym z najgroźniejszych czynników utleniających, reaguje z każdą napotkaną cząsteczką organiczną Tlen ze stanu podstawowego poprzez pozyskanie jednego elektronu przekształca się w rodnik ponadtlenkowy + H + = H lub + H 2 O = H Rodnik wodoronadtlenkowy (H ) jest o wiele bardziej reaktywny niż rodnik nadtlenkowy. Może zostać przekształcony w nadtlenek wodoru przez dysmutację Toksyczne formy tlenu nierodnikowe pochodne tlenu Powstaje w wyniku redukcji tlenu cząsteczkowego lub dysmutacji rodnika ponadtlenkowego przez dysmutazę ponadtlenkową SOD: H + e + H = H 2 Przez katalazę redukowany jest do tlenu i wody. Mimo że nie jest wolnym rodnikiem odgrywa ważną role w procesach oksydacyjnych. Może przenikać przez błony komórkowe. Jest głównym substratem reakcji wytwarzających silnie toksyczny rodnik hydroksylowy OH Forma singletowa, czyli forma bez niesparowanych elektronów jest w przypadku tlenu formą wzbudzoną, o wyższej energii. Jest jedną z głównych toksycznych form tlenu w żywych organizmach

3 Znaczenie reaktywnych form tlenu i azotu w patomechanizmie procesu zapalnego 133 reaktywne formy azotu RNS (ang. reactive nitrogen species). Do reaktywnych form azotu należy tlenek azotu (NO) oraz powstające z niego w wyniku przemian metabolicznych: kation nitrozoniowy (NO + ), anion nitroksylowy (NO ) i nadtlenoazotyn (ONOO ) [1, 23, 33, 41]. Synteza tlenku azotu następuje przy udziale specyficznej rodziny enzymów syntaz tlenku azotu (NOS). Obecnie wyróżnia się trzy podstawowe typy syntaz NO: e-nos lub NOS typu 3, występującą konstytutywnie w komórkach śródbłonka i syntetyzującą tlenek azotu potrzebny do regulacji ciśnienia krwi, n-nos lub NOS typu 1, występującą w neuronach i zależną od wapnia i kalmoduliny, i-nos lub NOS typu 2 indukowalną, silnie wiążącą kalmodulinę i niezależną od jonów wapnia, stwierdzaną m.in. w makrofagach, monocytach, neutrofilach, hepatocytach, komórkach nabłonka oddechowego [1, 8, 12, 37]. Wszystkie typy syntazy tlenku azotu są zależne od NADPH. Inhibitorami syntazy NO są różne związki m.in.: glikokortykosteroidy, L-glutamina, cytokiny (TGF-, IL-4, IL-10, IL-13), lecz mechanizmy odpowiedzialne za ich działanie są słabo poznane. Konstytutywny izoenzym NOS pod wpływem działania aktywatorów: acetylocholiny, bradykininy i H 2 wytwarza NO w śródbłonku naczyń krwionośnych, kolagenu w płytkach krwi, glutaminianu w komórkach mózgu. Natomiast inos, pojawia się po indukcji IFN-, IL-1, IL-2, IL-6, czynnikiem martwicy nowotworów TNF- (ang. tumor necrosis factor) czynnikiem hamującym migrację makrofagów, jak również mikroorganizmami lub ich produktami, np. LPS [1, 23, 28, 39]. Indukcja inos w komórkach śródbłonka jest przyczyną uszkodzenia śródbłonka, a w makrofagach i komórkach mięśni gładkich naczyń prowadzi do zahamowania oddychania komórkowego i w konsekwencji do ich dysfunkcji, a następnie śmierci. Natomiast ekspresja inos w komórkach wątroby hamuje toksyczne efekty działania endotoksyn [12, 24, 28, 39]. Tlenek azotu jest związkiem silnie toksycznym, działającym nieswoiście. Charakteryzuje się powinowactwem do metaloprotein i powoduje aktywację czynników transkrypcyjnych. Dokładne poznanie mechanizmów działania NO w komórkach jest trudne ze względu na dużą reaktywność NO i jego metabolitów. Obniżenie za pośrednictwem NO stężenia wewnątrzkomórkowego wapnia prowadzi do relaksacji naczyń i mięśni gładkich, zahamowania agregacji i adherencji płytek krwi, chemotaksji neutrofilii i transdukcji sygnału w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym [12, 23, 39-41]. MECHANIZMY PIERWSZEJ LINII OBRONY ORGANIZMU PRZED ZAKAŻENIEM Pierwszą linią obrony organizmu przed zakażeniem stanowią granulocyty obojętnochłonne i makrofagi [11, 22]. Wykazują one podobne funkcje kontrolujące, takie jak: agregacja, chemotaksja, zdolność do rozpoznania obcych cząsteczek poprzez lektyny i receptory oraz wchłonięcia ich do fagosomów i degradacji, a także wytwarzanie ROS przy udziale kompleksu enzymatycznego (oksydazy NADPH) zlokalizowanego w błonie fagocytów oraz RNS poprzez aktywację inos, co w konsekwencji prowadzi do zabicia i rozkładu pochłoniętych mikroorganizmów w środowisku fagolisozomów [7, 12, 22, 39]. WYBUCH TLENOWY Aktywacja makrofagów i granulocytów obojetnochłonnych prowadzi do wytwarzania dużej ilości anionorodnika ponadtlenkowego i jego pochodnych za pośrednictwem oksydazy NADPH. Nasilone wytwarzanie ROS nazywane wybuchem tlenowym, zostało opisane po raz pierwszy w 1933 r. przez Baldridge a i Gerarda [22]. W procesie tym najistotniejszą rolę odgrywa zwiększenie aktywności kompleksu oksydazy NADPH, którego składowymi są: cytochrom b558 znajdujący się w błonie, a składający się z dwóch podjednostek gp-91 phox (phox-phagocyte oxydase) i p-22 phox oraz trzy składniki obecne w cytozolu p47 phox, p67 phox, p40 phox. Ponadto istnieją dwa niskocząsteczkowe kofaktory Rac-2 obecny w cytozolu i Rap-1A zlokalizowany w błonie plazmatycznej i cytozolu [6, 37, 40, 42]. Kompleks ten po aktywacji katalizuje wytwarzanie anionorodnika ponadtlenkowego w reakcji jednoelekrotnowej redukcji tlenu, w której NADPH jest donorem elektronu: 2 + NADPH 2 + NADP + + H + Anionorodnik ponadtlenkowy podlega następnie dysmutacji do nadtlenku wodoru, który pod wpływem mieloperoksydazy, znajdującej się w ziarnistościach azurochłonnych (pierwotnych), w obecności jonów halogenkowych (np. Cl ) generuje powstawanie bardzo aktywnych, utleniających związków, takich jak kwas chlorowy (I) (HOCl) i inne [12, 14, 22, 42]. HOCl jest jednym z najsilniejszych fizjologicznych, nierodnikowych utleniaczy i jednocześnie związkiem działającym antybakteryjnie [14, 21]. Ponadto w wyniku reakcji kwasu podchlorawego z tauryną powstają chloroaminy, które mogą inaktywować elastazę i inne proteazy granulocytów obojętnochłonnych. Pobudzone granulocyty i makrofagi mogą generować także inne ROS wykazujące aktywność bakteriobójczą m.in.: tlen cząsteczkowy, rodnik hydroksylowy oraz RNS [7, 10, 12, 39]. Jak istotną rolę w obronie organizmu pełni oksydaza NADPH potwierdzają obserwacje wykazujące u myszy pozbawionych składników gp-91 phox lub p47 phox zmniejszoną odporność na zakażenie [12, 16]. Wytwarzanie anionorodnika ponadtlenkowego i rodnika hydroksylowego następuje ponadto w błonach komórkowych. Zawarte w nich nienasycone kwasy tłuszczowe zwiększają ich wrażliwość na działanie ROS [11, 12, 14, 39]. REAKTYWNE FORMY TLENU W PROCESIE FAGOCYTOZY Fizjologiczne stężenia ROS w komórkach fagocytujących mogą także modulować kaskadę przenoszenia sygnałów oraz nasilać immunologiczne funkcje limfocytów [12, 39]. Badania przeprowadzone przez Hamuro i wsp. wykazały, że wytwarzanie przez makrofagi prostaglandyn, cytokin: IL-6 i IL-12 jest zależne od zawartości wewnątrzkomórkowego glutationu. Autorzy uważają, że wewnątrzkomórkowy stan redoks wpływa na funkcje immunologiczne makrofagów [15]. Aktywacja fagocytarnej oksydazy NADPH może być indukowana przez cytokiny: IFN-, IL-1, IL-8, a także przez produkty komórki bakteryjnej głównie lipopolisacharydy czy lipoproteiny [7, 10, 12, 39]. Również wytwarzanie ROS przez niefagocytarną oksydazę NADPH odgrywa ważną rolę w regulacji kaskady przenoszenia sygnału w różnych komórkach niefagocytujących: fibroblastach, komórkach śródbłonka, komórkach mięśni gładkich naczyń, miocytach mięśnia serca [10, 12, 39]. Wykazano, że generacja anionorodnika ponadtlenkowego w komórkach niefagocytujących jest około trzykrotnie mniejsza niż jego wytwarzanie w neutrofilach. Komórki mięśni gładkich naczyń, w przeciwieństwie do granulocytów, komórek śródbłonka czy fibroblastów wytwarzają anionorodnik ponadtlenkowy i nadtlenek wodoru tylko wewnątrzkomórkowo [10, 12, 39]. KONTROLA ADHEZJI KOMÓRKOWEJ W procesach biologicznych ważną rolę odgrywa również kontrola zmian adhezyjnych właściwości komórek [40, 43]. Adhezja leukocytów do komórek śródbłonka w żyłach postkapilarnych jest najwcześniejszym krokiem w kierunku przewle-

4 134 R. Rutkowski i wsp. kłego stanu zapalnego i zależy od ekspresji receptora cząsteczek adhezyjnych na powierzchni komórek. Śródbłonek naczyń jest nie tylko fizjologiczną barierą oddzielająca ścianę naczyniową od strumienia krwi [43]. Ma on własną aktywność metaboliczną i wydzielniczą, ponadto syntetyzuje wiele czynników mogących zwrotnie pobudzać komórki śródbłonka, utrzymując stan przewlekłej ich aktywacji. Wywiera także regulacyjny wpływ na przebieg adhezji leukocytów (granulocytów i monocytów), płytek krwi oraz przepuszczalność naczyń i odpowiedź zapalną. Wyrazem dysfunkcji śródbłonka jest m.in. zwiększenie ekspresji cząsteczek adhezyjnych ICAM-1, VCAM-1, L-selektyny i integryn CD11b/CD18. Ich ekspresję indukują bakteryjne lipopolisacharydy i cytokiny: TNF-, IL-1 i IL-1. Adhezję leukocytów do komórek śródbłonka indukują również ROS, natomiast zmniejszają ją: katalaza, zmiatacze rodnika hydroksylowego, lecz bez udziału SOD, co sugeruje, że tę rolę spełnia nadtlenek wodoru i rodnik wodorotlenowy generowany w komórkach z nadtlenku wodoru [7, 10, 12, 18, 39]. ODDZIAŁYWANIE REAKTYWNYCH FORM TLENU NA LIMFOCYTY Ważnymi czynnikami specyficznej odpowiedzi immunologicznej na działanie czynników chorobotwórczych są limfocyty. Ich odpowiedź immunologiczna jest regulowana przez cytokiny, receptory antygenu i cząsteczki kostymulujące na limfocytach. Jest ona także zależna od stanu redoks w komórce [12, 40]. Aktywacja funkcji limfocytów T jest nasilana przez ROS albo przez zmianę stężenia wewnątrzkomórkowego glutationu. Fizjologiczne stężenie anionorodnika ponadtlenkowego i/albo nadtlenku wodoru powodują zwiększenie wytwarzania IL-2 przez limfocyty T, zaś niskie stężenie nadtlenku wodoru indukuje ekspresję receptora IL-2 [26, 27]. Sugeruje się, że nadtlenek wodoru może zmniejszać próg pobudzenia kaskady przenoszenia sygnału, co może często odgrywać krytyczną rolę w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej [7, 10, 39]. Źródłem generacji ROS w limfocytach jest 5-lipooksygenaza (5-LO). Odgrywa ona istotną rolę w biosyntezie leukotrienów A 4, B 4, C 4 i D 4. Metabolity generowane przez 5-LO zmieniają wewnątrzkomórkowy stan równowagi redoks i w ten sposób indukują transdukcję sygnału i ekspresję genów. 5-LO bierze również udział w wytwarzaniu nadtlenku wodoru w limfocytach T po stymulacji przez IL-1 i równoczesnej aktywacji cząsteczek kostymulujących CD28 [7, 10, 12, 27]. REGULACJA FUNKCJI KOMÓRKOWYCH PRZEZ REAKTYWNE FORMY TLENU Paradoksem jest, że ROS, będące produktami metabolizmu komórkowego, wykazują nie tylko właściwości przyczyniające się do uszkodzenia komórek, ale także spełniają ważną rolę jako cząsteczki zaangażowane w regulowanie funkcji komórki. Rola ta uwarunkowana jest przynajmniej w części stężeniem ROS, np. NO wytwarzany w małych stężeniach przez konstytutywną NOS w komórkach śródbłonka naczyń pełni funkcję cząsteczki sygnalizującej zaangażowanej w regulację napięcia ściany naczyń, natomiast generowany w dużych stężeniach przez inos w makrofagach, wykazuje bardzo silne właściwości niszczące w stosunku do różnych mikroorganizmów [8, 12, 24, 28]. Reaktywne formy tlenu pełniąc rolę cząsteczek sygnalizujących w komórkach wzmagają transdukcję sygnału różnych receptorów błonowych. Indukcja transdukcji sygnału od receptorów błonowych, czynników wzrostu, cytokin lub innych ligandów następuje przy współistniejącej aktywacji oksydazy NADPH. Udział ROS w aktywacji kaskady przenoszenia sygnału z udziałem kinaz JAK, p38 MAPK i czynnika transkrypcyjnego AP-1 powoduje, że proces przenoszenia sygnału w komórce jest bardzo wrażliwy na regulację przez stan komórkowego redoks. W wielu typach komórek czynniki wzrostu i cytokiny powodują wytwarzanie ROS, natomiast antyoksydanty i inhibitory enzymów generujących ROS specyficznie blokują aktywację cząsteczek sygnalizacyjnych przez czynniki wzrostu i/lub cytokiny. Także egzogenne antyoksydanty mogą aktywować zarówno wytwarzanie samych cytokin, jak i/lub czynników wzrostu oraz wpływać na funkcjonowanie dróg przenoszenia sygnału [7, 12, 18, 39]. Reaktywne formy tlenu występują w warunkach fizjologicznych w komórkach i tkankach w małych, ale oznaczalnych stężeniach. Ich ilość zależy od równowagi pomiędzy wytwarzaniem ROS, a ich usuwaniem przez różne enzymy i substancje nieenzymatyczne wykazujące właściwości antyoksydacyjne [12, 31]. Obrona antyoksydacyjna to wiele składników ułożonych w kilka poziomów. Pierwszą linią obrony są związki organiczne zawierające metale (ferrytyna, transferyna, ceruloplasmina, melatotionina) zapobiegające powstawaniu ROS. Drugą linię obrony stanowią antyoksydanty drobnocząsteczkowe ( -tokoferol, -karoten, witamina C i glutation), i enzymy antyoksydacyjne (dysmutaza ponadtlenkowa SOD, peroksydaza glutationowa GSH-Px, katalaza) powodujące inaktywację ROS. Trzecią linią obrony są systemy naprawcze cząsteczek uszkodzonych przez ROS [2, 12, 36, 40]. Także inne związki o względnie małej aktywności antyoksydacyjnej, ale występujące w dużych stężeniach charakteryzują się znaczącą aktywnością antyoksydacyjną. Należą do nich aminokwasy, peptydy i białka [10, 12, 38]. ZNACZENIE STRESU OKSYDACYJNEGO W PATOMECHANIZMIE WYBRANYCH PROCESÓW CHOROBOWYCH Brak równowagi pomiędzy generacją ROS a zdolnościami antyoksydacyjnymi organizmu określany jest jako stres oksydacyjny. Konsekwencją tego jest m.in. peroksydacja lipidów błonowych, oksydacyjne modyfikacje białek i DNA (ryc. 2). Proces peroksydacji lipidów, mający charakter reakcji łańcuchowej, jest przyczyną zmian we właściwościach fizykochemicznych błon komórkowych. Prowadzi to do zaburzeń transportu przez błony, aktywności łańcucha oddechowego, jak również przewodzenia sygnałów. W przebiegu stresu oksydacyjnego dochodzi również do zmiany struktury i funkcji enzymów, czynników transkrypcyjnych, białek cytoszkieletu komórki oraz utleniania głównie zasad DNA [10, 12, 36, 38, 39]. Uważa się, że stres oksydacyjny spełnia istotną rolę w procesie starzenia się organizmów jak również w patogenezie wielu chorób [3]. Zaburzenie równowagi oksydacyjno-redukcyjnej objawiające się obniżeniem stężenia całkowitego glutationu (GSH+GSSG), GSH i/lub obniżeniem stosunku GSH/GSSG obserwuje się w chorobach: neurodegeneracyjnych [4, 5]: choroba Parkinsona, choroba Alzheimera, zakażeniach wirusowych [17, 30, 35]: HIV i HIV/AIDS, wirusowe zapalenie wątroby typu B, zakażenie wirusem grypy, zakażeniach bakteryjnych [29, 34]: posocznica, zakażenie Helicobacter pylori zaburzeniach metabolicznych [13, 30, 37]: cukrzyca, miażdżyca naczyń. Proces niedokrwienia i reperfuzji, w czasie którego dochodzi do wzmożonego wytwarzania ROS, prowadzi do uszkodzenia tkanek i wielu powikłań w przebiegu wstrząsu, udaru mózgu, przewlekłej niewydolności krążenia, nadciśnienia tętniczego, wirusowego lub poalkoholowego uszkodzeniu wątroby [25, 30, 34, 42]. W przebiegu posocznicy nadmierna generacja ROS przez komórki fagocytujące i uwalnianie ich poza komórkę ma istotne znaczenie w rozwoju uszkodzenia tkanek i dysfunkcji wielonarządowej często decydującej o ciężkości przebiegu choroby [9, 34].

5 Znaczenie reaktywnych form tlenu i azotu w patomechanizmie procesu zapalnego 135 Ryc. 2. Zmiany biologiczne wywoływane przez reaktywne formy tlenu [20, 31] w modyfikacji własnej Fig. 2. The biological effects of reactive oxygen species, [20, 31] own modification Reaktywne pochodne tlenowe mają szczególną rolę w rozwoju zapalenia żołądka spowodowanego przez H. pylori, toksycznego poalkoholowego zapalenia wątroby oraz marskości wątroby [25, 29, 35]. Stres oksydacyjny ma także istotne znaczenie w patomechanizmie astmy oskrzelowej i przewlekłej obturacyjnej choroby płuc [2, 8, 18, 31, 33]. Wiele doniesień wskazuje na szczególną rolę stresu oksydacyjnego w patogenezie AIDS. Zarówno u nosicieli HIV, jak i u chorych na AIDS obserwowano nieprawidłowo niskie stężenie cysteiny i glutationu w surowicy, jak również niskie stężenie wewnątrzkomórkowego glutationu w limfocytach krwi obwodowej. Obniżonemu stężeniu GSH towarzyszy zwiększona zawartość GSSG. U zakażonych HIV dochodzi również do zaburzeń enzymatycznego układu antyoksydacyjnego polegających na obniżeniu aktywności SOD i GSH-Px oraz zwiększeniu aktywności katalazy. Może to świadczyć o osłabieniu zdolności do inaktywacji ROS, co w konsekwencji prowadzi do zwiększenia ich stężenia i aktywności u tych chorych [12, 17, 30, 35]. Zaburzenia układu antyoksydacyjnego, aktywności SOD i innych białek antyoksydacyjnych, wykazano u chorych z zakażeniem wirusem Dengue: w gorączce krwotocznej i zespole wstrząsowym [32]. Reaktywne formy tlenu są potencjalnymi czynnikami rakotwórczymi z powodu ich właściwości mutagennych i promujących postęp choroby nowotworowej [12, 30]. Stres oksydacyjny i/lub zaburzenie funkcji mitochodriów mają też decydujące znaczenie w etiologii chorób neurodegeneracyjnych [4, 5]. Uważa się, że gromadzenie w komórkach nerwowych złogów białka -amyloidu może być przyczyną stresu oksydacyjnego. W chorobie Alzheimera u chorych obserwowano również obniżoną aktywność SOD. Wykazano, że zakażone prionami komórki neuronalne są bardzo wrażliwe na stres oksydacyjny, wykazują zwiększenie peroksydacji lipidów i znaczne obniżenie aktywności enzymów antyoksydacyjnych, takich jak: GSH-Px, GSSG-R i Mn-SOD [4, 12]. PODSUMOWANIE Jak wykazaliśmy w naszej z pracy, stres oksydacyjny może być jednym z mechanizmów obronnych, a jednocześnie może przyczyniać się do powstania wielu różnorodnych zmian chorobowych. Szczegółowa znajomość właściwości biologicznych reaktywnych pochodnych tlenu i azotu pozwala przewidzieć potencjalne zagrożenia w określonych stanach chorobowych. Z drugiej strony wykorzystanie naturalnych mechanizmów antyoksydacyjnych oraz wspomaganie ich przez różnorodne substancje farmakologiczne neutralizujące reaktywne pochodne tlenu lub azotu może być skutecznym działaniem terapeutycznym w różnorodnych chorobach zakaźnych, neurodegeneracyjnych, wewnętrznych czy schorzeniach onkologicznych. PIŚMIENNICTWO 1. Alderton W.K., Cooper C.E., Knowles R.G.: Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem. J., 2001, 357, Pt 3, Andreadis A.A., Hazen S.L., Comhair S.A. i wsp.: Oxidative and nitrosative events in asthma. Free Radic. Biol. Med., 2003, 35, Augustyniak A., Skrzydlewska E.: Zdolności antyoksydacyjne w starzejącym się organizmie. Post. Hig. Med. Dośw., 2004, 58, Barnham K.J., Masters C.L., Bush A.I.: Neurodegenerative diseases and oxidative stress. Nat. Rev. Drug Discov., 2004, 3, Behl C.: Alzheimer s disease and oxidative stress: implication for novel therapeutic approaches. Prog. Neurobiol.,1999, 57,

6 136 R. Rutkowski i wsp. 6. Bergendi L., Benes L., Durackova Z. i wsp.: Chemistry, physiology and pathology of free radicals. Life Sci., 1999, 65, Bogdan Ch., Röllinghoff M., Diefenbach A.: Reactive oxygen and reactive nitrogen intermediates in innate and specific immunity. Curr. Opin. Immunol., 2000, 12, Bove P.F., van der Vliet A.: Nitric oxide and reactive nitrogen species in airway epithelial signaling and inflammation. Free Radic. Biol. Med., 2006, 41, Crimi E., Sica V., Williams-Ignarro S. i wsp.: The role of oxidative stress in adult critical cares. Free Radic. Biol. Med., 2006, 40, Cuzzocrea S., Riley D.P., Caputi A.P. i wsp.: Antioxidant therapy: a new pharmacological approach in shock, inflammation, and ischemia/reperfusion injury. Pharmacol. Rev., 2001, 53, Dahlgren C., Karlsson A.: Respiratory burst in human neutrophils. J. Immunol. Meth., 1999, 232, Dröge W.: Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev., 2002, 82, Evans J.L., Goldfine I.D., Maddux B.A. i wsp.: Oxidative stress and stressactivated signaling pathways: a unifying hypothesis of type 2 diabetes. Endocr. Rev., 2002, 23, Hampton M.B., Kettle A.J., Winterbourn Ch.C.: Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase and bacterial killing. Blood, 1998, 92, Hamuro J., Murata Y., Suzuki M. i wsp.: The triggering and healing of tumor stromal inflammatory reactions regulated by oxidative and reductive macrophages. Cancer Res., 1999, 48, Jackson S.H., Gallin J.I., Holland S.M.: The gp91 phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med., 1995, 182, Jaruga P.: Mechanizmy oksydacyjne i antyoksydacyjne u nosicieli HIV wpływ na progresję choroby. Post. Hig. Med. Dośw., 1999, 53, Kehrer J.P.: Free radicals as mediators of tissue injury and disease. Crit, Rev, Toxicol., 1993, 23, Kerr M.E., Bender C.M., Monti E.J.: An introduction to oxygen free radicals. Heart Lung, 1996, 25, Kirkham P., Rahman I.: Oxidative stress in asthma and COPD: antioxidants as a therapeutic strategy. Pharmacol. Ther., 2006, 111, Komosińska K., Olczyk K., Winsz K.: Rola wolnych rodników w etiopatogenezie twardziny układowej. Post. Hig. Med. Dośw., 1997, 51, Labro M.T.: Interference of antibacterial agents with phagocyte functions: immunomodulation or Immuno-Fairy tales? Clin. Microbiol. Rev., 2000, 13, Lirk P., Hoffmann G., Rieder J.: Inducible nitric oxide synthase time for reappraisal. Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy, 2002, 1, Lloyd-Jones D.M., Bloch K.D.: The vascular biology of nitric oxide and its role in atherogenesis. Ann. Rev. Med., 1996, 47, Loguercio C., Federico A.: Oxidative stress in viral and alcoholic hepatitis. Free Radic. Biol. Med., 2003, 34, Los M., Dröge W., Stricker K. i wsp.: Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions. Eur. J. Immunol., 1995, 25, Los M., Schenk H., Hexel K. i wsp.: IL-2 gene expression and NF- B activation through CD28 requires reactive oxygen production by 5-lipoxygenase. EMBO J., 1995, 14, MacMicking J., Xie Q.W., Nathan C.: Nitric oxide and macrophage function. Ann. Rev. Immunol., 1997, 15, Naito Y., Yoshikawa T.: Molecular and cellular mechanisms involved in Helicobacter pylori-induced inflammation and oxidative stress. Free Radic. Biol. Med., 2002, 33, Olinski R., Gackowski D., Foksinski M. i wsp.: Oxidative DNA damage: assessment of the role in carcinogenesis, atherosclerosis, and acquired immunodeficiency syndrome. Free Radic. Biol. Med., 2002, 33, Rahman I., Biswas S.K., Kode A.: Oxidant and antioxidant balance in the airways and airway diseases. Eur. J. Pharmacol., 2006, 533, Ray G., Kumar V., Kapoor AV. i wsp.: Status of antioxidants and other biochemical abnormalities in children with Dengue fever. J. Trop. Pediatr., 1999, 45, Ricciardolo F.L, Di Stefano A., Sabatini F., Folkerts G.: Reactive nitrogen species in the respiratory tract. Eur. J. Pharmacol., 2006, 533, Salvemini D., Cuzzocrea S.: Oxidative stress in septic shock and disseminated intravascular coagulation. Free Radic. Biol. Med., 2002, 33, Schwarz K.B.: Oxidative stress during viral infection: a review. Free Radic. Biol. Med., 1996, 21, Skrzydlewska E., Farbiszewski R.: Interakcje wolnych rodników z białkami. Post. Hig. Med. Dośw., 1995, 49, Stocker R., Keaney J.F. Jr.: Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol. Rev., 2004, 84, Teixeira H.D., Schumacher R.I., Meneghini R.: Lower intracellular hydrogen peroxide levels in cells overexpressing CuZn-superoxide dismutase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1998, 95, Thannickal V.J., Fanburg B.L.: Reactive oxygen species in cell signaling. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 2000, 279, L1005-L Valko M., Leibfritz D., Moncol J.I. wsp.: Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2007, 39, Vallance P., Leiper J.: Blocking NO synthesis: how, where and why? Nat. Rev. Drug Discov., 2002, 1, Wójcicka G., Bełtowski J., Jamroz A.: Stres oksydacyjny w nadciśnieniu tętniczym. Post. Hig. Med. Dośw., 2004, 58, Wu K.K., Thiagarajan P.: Role of endothelium in thrombosis and hemostasis. Annu. Rev. Med., 1996, 47, Otrzymano: 18 marca 2007 r. Adres: Ryszard Rutkowski, Białystok, ul. Starobojarska 20 m 6, tel.: , fax: , rutkowski@csk.pl