Recenzja. POLISH ACADEMY OF SCIENCES NENCKI INSTITUTE OF EXPERIMENTAL BIOLOGY EU Centre of Excellence in Neurobiology, BRAINS

Transkrypt

1 POLISH ACADEMY OF SCIENCES NENCKI INSTITUTE OF EXPERIMENTAL BIOLOGY EU Centre of Excellence in Neurobiology, BRAINS Pasteur 3, Warsaw, Poland Phone: (48-22) ; Fax: (48-22) Prof. dr hab. Mariusz R. Więckowski, Warszawa, 27 kwietnia 2018 r. Pracownia Bioenergetyki i Błon Biologicznych Instytut Biologii Doświadczalnej PAN im. M. Nenckiego w Warszawie Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Katarzyny Niedźwieckiej p.t.: "Drożdże jako organizm modelowy do badań dysfunkcji syntazy ATP w miopatiach i nowotworach" wykonanej w Zakładzie Genetyki Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN pod kierunkiem dr hab. Róży Kucharczyk. Celem pracy doktorskiej mgr Katarzyny Niedźwieckiej było poznanie wpływu sześciu mutacji w kodowanym w mitochondrialnym DNA genie ATP6 na mitochondrialną syntazę ATP oraz na funkcjonowanie mitochondriów. Z sześciu wybranych przez doktorantkę mutacji pięć odnaleziono w nowotworach jednak ich wpływ na mitochondria i fizjologię komórek nowotworowych nie został jeszcze opisany. Kolejna z przebadanych mutacji związana jest z fenotypem MLASA (ang. myopatia, lactic acidosis, sideroblastic anemia) lub nefropatii z objawami miopatii. Jak dotąd jej mutagenny charakter nie został udowodniony. Biorąc pod uwagę także najnowsze doniesienia o roli mitochondrialnej syntazy ATP w tworzeniu mitochondrialnego megakanału, zagadnienie, nad którym pracowała doktorantka uważam za niezmiernie ważne, a wyniki przedstawione w opublikowanych przez nią pracach eksperymentalnych za istotne i prowadzące do poznania wpływu mutacji w genie ATP6 na funkcjonowanie i bioenergetykę mitochondriów. 1

2 Formalny opis rozprawy: Na przedstawioną do recenzji pracę doktorską mgr Katarzyny Niedźwieckiej pt. "Drożdże jako organizm modelowy do badań dysfunkcji syntazy ATP w miopatiach i nowotworach", składają się trzy tematycznie spójne publikacje doświadczalne opublikowane w Scientific Reports, Mitochondrion i BBA - Molecular Cell Research. W dwóch publikacjach (prace opublikowane w Mitochondrion i BBA - Molecular Cell Research), mgr Katarzyna Niedźwiecka jest pierwszym autorem. W trzeciej pracy (Scientific Reports) jest drugim autorem jednakże z równo cennym udziałem z pierwszym autorem (equall contribution). Ocenę udziału mgr Katarzyny Niedźwieckiej w powstanie wyżej wymienionych artkułów dodatkowo możliwa była dzięki załączonym oświadczeniom pozostałych współautorów. Jednak już sam fakt, jaką pozycję wśród współautorów doktorantka zajmuje w opublikowanych pracach wchodzących w skład jej pracy doktorskiej świadczy o jej istotnym wkładzie w powstanie wyżej wymienionych publikacji. Mam na myśli nie tylko wkład doktorantki w wykonywanie doświadczeń, ale także w opracowanie koncepcji badań jak również i w przygotowanie tych publikacji do druku. Należy także pamiętać, że wszystkie te prace zostały już ocenione przez międzynarodowej klasy specjalistów występujących w roli recenzentów. Sam fakt, że trzy prace wchodzące w skład rozprawy doktorskiej mgr Katarzyny Niedźwieckiej zostały opublikowane w anglojęzycznych czasopismach z listy filadelfijskiej (Mitochondrion IF = 3.704; Scientific Reports IF = oraz BBA - Molecular Cell Research IF = 4.521) wskazuje na ich bardzo wysoką wartość naukową. Dodatkowo, Doktorantka jest współautorką dwóch innych publikacji opublikowanych w w FEBS Letters i Plos One oraz będącej aktualnie na etapie odpowiedzi recenzentom trzeciej publikacji wysłanej do Scientific Reports. Rozprawa doktorska zawiera streszczenie w języku polskim i w języku angielskim, zwięźle ujęty cel pracy, opis technik stosowanych przez Doktorantkę oraz przedstawione dla każdej pracy osobno wyniki badań wraz z wnioskami. Wszystko to zwieńczone jest podsumowaniem osiągnięć naukowych Doktorantki. Kolejnym elementem pracy doktorskiej jest Bibliografia i lista wszystkich publikacji doktorantki. W formie załączników Doktorantka zamieściła także trzy publikacje będące podstawą jej rozprawy doktorskiej. Dziesięciostronicowe wprowadzenie (podzielone na cztery części) zostało napisane rzeczowo. W pierwszej części streszczenia Doktorantka w sposób bardzo 2

3 syntetyczny opisała budowę i funkcję mitochondriów. W drugiej, opisała budowę mitochondrialnej syntazy ATP, natomiast w trzeciej opisała konsekwencje mutacji w genach kodujących podjednostki syntazy ATP. Czwartą integralną część wprowadzenia doktorantka poświęciła nowotworom, a w szczególności ich bioenergetyce, mutacjom w genomie mitochondrialnym, stresowi oksydacyjnemu, homeostazie wapniowej oraz mitofagii i apoptozie. Dodatkowo, Doktorantka opisała pokrótce najnowsze doniesienia o udziale mitochondrialnej syntazy ATP w tworzeniu mitochondrialnego megakanału. Nie jest dla mnie jasne, dlaczego ten fragment znalazł się w części poświęconej nowotworom. Doktorantka w tej części nie odnosi się ani razu do udziału megakanału w fizjologii komórek nowotworowych. W rozprawie Autorka nie ustrzegła się drobnych błędów. Niektóre z nich dotyczyły np. przyjętego nazewnictwa biochemicznego, czasami wynikały ze zbyt dosłownego tłumaczenia z języka angielskiego na polski. Mimo iż w żaden sposób nie obniżają one waloru ocenianej pracy, czuję się w obowiązku te błędy wymienić. 1) Doktorantka pisze W błonie wewnętrznej zlokalizowane są enzymy łańcucha oddechowego. Wydaje mi się, że bardziej poprawne może być: W błonie wewnętrznej zlokalizowany jest mitochondrialny łańcuch oddechowy. 2) Doktorantka na stronie 7 pisze, że enzymy łańcucha oddechowego transportują elektrony w jednym kierunku. Nie jest to do końca prawda, bowiem istnieje zjawisko odwrotnego transportu elektronów w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym. 3) Doktorantka na stronie 7 pisze także, że transportowi elektronów towarzyszy pompowanie protonów z macierzy mitochondrialnej przez wewnętrzną błonę mitochondrialną do przestrzeni międzybłonowej, gdzie ich stężenie jest wysokie a to tworzy potencjał elektryczny w poprzek błony. Chciałem sprostować, że to wysokie stężenie protonów w przestrzeni międzybłonowej jest właśnie konsekwencją działania łańcucha oddechowego. 4) Na stronie 10 Doktorantka pisze: Mutacje w mitochondrialnym DNA zdarzają się częściej niż w jądrowym DNA, ponieważ mtdna znajduje się blisko błony wewnętrznej mitochondrium i jest w związku z tym narażony na uszkodzenia spowodowane przez reaktywne formy tlenu, które wyciekają z łańcucha oddechowego. W żaden sposób nie mogę zgodzić się ze stwierdzeniem, że reaktywne formy tlenu wyciekają z łańcucha oddechowego. Nie taki jest mechanizm ich powstawania. Mam nadzieję, że Doktorantka 3

4 wyjaśni podczas obrony co miała na myśli używając takiego sformułowania. Co ciekawe, na stronie 14 Doktorantka pisze już że to elektrony wyciekają z łańcucha oddechowego, a nie reaktywne formy tlenu. 5) Także na stronie 10 Doktorantka pisze, że MERRF (padaczka miokloniczna z czerwonymi, poszarpanymi włóknami, ang. Myoclonic Epilepsy with Ragged Red Fibers; nazwa wywodzi się od zlepków defektywnych mitochondriów skupionych pod błoną komórkową miocytu, widocznych w barwieniu Gömöriego). Określenie barwienie Gömöriego nie jest jednoznaczne, bowiem opracował on wiele barwień histologicznych, prawidłowa nazwa barwienia uwidaczniającego włókna RRF brzmi barwienie trichrom w modyfikacji Gömöriego. 6) Strona 14. Nie wiem dlaczego Doktorantka dla jednej z reaktywnych form tlenu używa określenia rodnik O2 -, ma on przecież swoją ogólnie przyjętą nazwę anionorodnik ponadtlenkowy, który jest zapisywany symbolem O2 -. 7) Na stronie 14 Doktorantka pisze Za jego (chodzi o H2O2) detoksykację w komórce odpowiadają peroksyredoksyny, peroksydazy glutationu i katalazy. Czy Doktorantka może mi podać przykłady różnych katalaz np. u człowieka? Ze sformułowania użytego przez Doktorantkę wynika bowiem, że w jednej komórce występują różne katalazy. Nie miałbym takich wątpliwości, gdyby Doktorantka napisała w komórkach organizmów lub komórkach różnych organizmów. 8) Strona 15 (początek strony) co prowadzi do powstania rodnia hydroksylowego powinno być rodnika hydroksylowego 9) Strona 16. Według mnie Doktorantka zbyt bardzo uprościła proces apoptozy zależnej od mitochondriów. Oczywiście nie oczekiwałem opisu apoptozy z detalami, jednakże jeżeli Doktorantka wspomniała o uwalnianiu cytochromu c, zdziwił mnie fakt, że chociaż nie wymieniła białek takich jak: AIF, endog, Smac/DIABLO lub Omi/HtrA2 równie ważnych do inicjacji i przebiegu procesu apoptozy. 10) Strona 16. Wydaje mi się, że mitochondrialny megakanał PTP (ang. permeability transition pore) jest kanałem o wysokim przewodnictwie, a nie kanałem o wysokiej przewodności. Sama Doktorantka już wcześniej na stronie 14 używa innej terminologii w stosunku do megakanału pisze bowiem kanał o wysokiej przepuszczalności. Z kolei na stronie 16 Doktorantka określa megakanał jako kanał o wysokiej przepustowości Brakuje mi konsekwencji w stosowanym nazewnictwie. Dodatkowo, 4

5 należy jednak pamiętać, że w niektórych przypadkach megakanał może także funkcjonować w tak zwanym modzie niskiego przewodnictwa. Doktorantka w swojej rozprawie zamieściła także część poświęconą wykorzystanych przez nią metod badawczych. Do tej części mam następujące pytania: 1) Strona 22. (ii) Doktorantka pisze: NADH i CCCP, który poprzez uszkodzenie błony zewnętrznej mitochondrium doprowadza do spadku potencjału na błonie wewnętrznej. Zatem w tych warunkach mierzona jest maksymalna aktywność łańcucha oddechowego. Niestety nie mogę zgodzić się z tym opisem. Po pierwsze, mechanizm działania CCCP powodujący obniżenie potencjału jest całkowicie inny od opisywanego przez Doktorantkę. Po drugie, po uszkodzeniu zewnętrznej błony mitochondrialnej oczekiwałbym obniżenia szybkości oddychania (nawet w obecności rozprzęgacza, jakim jest CCCP) spowodowanego poprzez a) zerwanie przekazywania elektronów z alternatywnej dehydrogenazy NADH na ubichinon, oraz b) poprzez ew. uwolnienie cyt. c z przestrzeni międzybłonowej i przez to zahamowanie łańcucha oddechowego. Do dzisiaj stosuje się test - dodanie cyt. c do preparatu wyizolowanych mitochondriów, celem sprawdzenia integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej, mierząc zużycie tlenu przez mitochondria. 2) Strona 25. Metoda pomiaru pęcznienia mitochondriów. Doktorantka pisze: Mitochondria pobierają Ca 2+ do macierzy i zaczynają pęcznieć. Wówczas zwiększa się ich średnica i wzrasta intensywność rozpraszania światła. W pewnym momencie pęczniejące mitochondrium pęka, stając się przeźroczyste dla światła 660nm, co wiąże się ze spadkiem natężenia rozpraszanego światła. W opisie pomiaru pęcznienia mitochondriów nasuwają się mi następujące pytania. a) chciałem się upewnić, że pęcznienie na pewno mierzono z wykorzystaniem fluorymetru (tak by wynikało z opisu Ryciny 4 na stronie 26); Jednakże z załączonej przez Doktorantkę jej publikacji w BBA Molecular Cell Research wynika, że pęcznienie mitochondriów mierzono poprzez zmianę absorbancji (Patrz strona 120). W pracy tej napisano: PTP induction caused swelling of mitochondria and decrease in absorbance at 660 nm. Czyli obserwowano spadek absorbancji w przypadku pęcznienia 5

6 mitochondriów. Doktorantka z kolei na Panelu D pokazuje wzrost rozproszenia fali 660nM dla procesu pęcznienia mitochondriów. b) Układ doświadczalny pomiaru pobierania jonów Ca 2+ przez mitochondria i pomiar pęcznienia są bardzo podobne. Jak wynika z Panelu C ryciny 4 dodanie 180 µm Ca 2+ do mitochondriów nie wpływa na ich pęcznienie, bowiem jak zaznaczyła Doktorantka dopiero ostatni dodatek jonów Ca 2+ (stężenie finalne 200 µm) powoduje otwarcie PTP i pęcznienie mitochondriów co wiąże się z uwolnieniem jonów Ca 2+. Z kolei na Panelu C dodatek już 100 µm Ca 2+ powoduje pęcznienie i to bardzo znaczące. Dlaczego więc przy pomiarze zdolności buforowania jonów Ca 2+ doktorantka nie obserwowała zależnego od PTP uwalniania jonów Ca 2+ już po dodaniu 100 µm Ca 2+? Efekt przecież powinien być już wtedy widoczny. Chciałbym poznać opinię Doktorantki na ten temat. Wyniki badań wraz z wnioskami podsumowane zostały wypunktowanymi najważniejszymi wynikami/osiągnięciami wynikającymi z przeprowadzonych przez Doktorantkę badań. Wyręczyła ona po części w ten sposób recenzenta sama wymieniając najważniejsze osiągnięcia swojej pracy badawczej, takie jak: wykazanie patogennego charakteru mutacji punktowej G8969>A w genie MTATP6 z wykorzystaniem trzech modeli badawczych; zbadanie wpływu różnych mutacji w genie MTATP6 na funkcjonowanie systemu fosforylacji oksydacyjnej w komórkach nowotworowych; oraz wykazanie zaburzenia w homeostazie wapniowej, zwiększony stres oksydacyjny oraz zmiany we wrażliwości mitochondrialnego megakanału na jony Ca 2+ w komórkach drożdży z mutacjami w mitochondrialnym genie atp6 współwystępującymi z mutacją w genie OM45. Po wnikliwym zapoznaniu się z załączonymi pracami eksperymentalnymi w pełni zgadzam się z wnioskami przedstawionymi przez Doktorantkę w podsumowaniu streszczenia jej rozprawy doktorskiej. Podsumowując, przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska przedstawia nowe odkrycia badawcze. Uważam, że wnioski wyciągnięte z przeprowadzonych badań zostały przez Doktorantkę właściwie uzasadnione a ponadto wyniki otrzymane przez Doktorantkę zostały opublikowane w czasopismach naukowych o międzynarodowym zasięgu. Przedstawione przeze mnie komentarze oraz uwagi dotyczące rozprawy mgr Katarzyny Niedźwieckiej w większości mają charakter drugorzędny i w żadnym stopniu 6

7 nie obniżają wartości merytorycznej rozprawy doktorskiej. Dlatego też, stwierdzam, że przedstawiona mi do recenzji praca doktorska mgr Katarzyny Niedźwieckiej w pełni spełnia wymagania formalne stawiane rozprawom doktorskim i wnoszę do Rady Naukowej Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk w Warszawie o dopuszczenie pani mgr Katarzyny Niedźwieckiej do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Jednocześnie biorąc pod uwagę wysokie walory merytoryczne przedstawionej mi do recenzji rozprawy doktorskiej, dorobek Doktorantki jak również fakt opublikowania otrzymanych przez nią wyników w prestiżowych czasopismach o międzynarodowym zasięgu zgłaszam wniosek do Rady Naukowej Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk w Warszawie o wyróżnienie rozprawy doktorskiej mgr Katarzyny Niedźwieckiej. Mariusz R. Więckowski 7