Weź udział w poszukiwaniu leku na chorobę Alzheimera. Zbadaj peptydy i białka! Warsztaty doświadczalne PROTOKÓŁ
Wprowadzenie Białka i peptydy to cząsteczki syntetyzowane przez organizmy żywe. Są odpowiedzialne za wiele procesów i należą do materiałów budulcowych naszych ciał. Ich cząsteczki są zbudowane z kilku aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi. Białko Peptyd Aminokwas Białko: więcej niż 100 aminokwasów Peptyd: mniej niż 100 aminokwasów Dzięki postępom w badaniach z zakresu biotechnologii istotnie wzrosło wykorzystanie peptydów i białek w zastosowaniach biomedycznych, a także w kosmetyce. Obecnie na rynku jest wiele peptydów terapeutycznych, w tym: insulina stosowana w leczeniu cukrzycy, DNaza I wykorzystywana do zwalczania mukowiscydozy, oraz T20, produkt, który blokuje cykl replikacji ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), powodującego AIDS. Inną chorobą, przeciwko której opracowywane są peptydy terapeutyczne, jest choroba Alzheimera. Jednym z najnowszych trendów badań biomedycznych jest wykorzystywanie peptydów jako potencjalnych środków terapeutycznych. Peptydy są zbudowane z aminokwasów obecnych w naszych organizmach i dlatego ich wykorzystanie jako produktów leczniczych bardzo zbliżonych do cząsteczek stworzonych przez naturę wydaje się być dobrą strategią zwalczania chorób. Ogólnie rzecz biorąc, leki peptydowe są lepiej ukierunkowane na cel terapii i powodują mniej skutków ubocznych niż tradycyjne leki. 2
Czym jest choroba Alzheimera? Choroba Alzheimera jest chorobą neurodegeneracyjną, która niekorzystnie wpływa na zdolności umysłowe człowieka i powoduje jego ostateczne przejście w stan wegetatywny i śmierć. Pacjent doświadcza postępującej utraty pamięci, a w końcu nie jest w stanie wykonać nawet najbardziej podstawowych czynności, takich jak dbanie o higienę osobistą, ubieranie się czy jedzenie. W końcowym etapie choroby pacjent jest w pełni zależny od innych i przykuty do łóżka. Nie ma obecnie sposobu na wyleczenie tej choroby. Liczba osób cierpiących na chorobę Alzheimera szybko rośnie po przekroczeniu 65. roku życia i szacuje się, że dotyka ona około połowy osób, które przekroczyły 85 rok życia. Ze względu na postępujące starzenie się światowej populacji szacuje się, że liczba osób z tą chorobą będzie rosła wykładniczo w przeciągu kilku kolejnych lat. Co odpowiada za rozwój choroby Alzheimera? W mózgach osób chorych na chorobę Alzheimera gromadzi się peptyd o nazwie beta-amyloid (Aß), który składa się z części hydrofilowej i hydrofobowej. Właściwości tego peptydu powodują powstawanie agregatów, tzw. blaszek amyloidowych, które odkładają się na zewnątrz neuronów. Uważa się, że Aß jest jednym z czynników odpowiedzialnych za powstanie choroby i bezpośrednio odpowiada za neurodegenerację oraz deficyty poznawcze występujące w przebiegu choroby Alzheimera. beta-amyloid Skupiska beta-amyloidu Agregacja beta-amyloidu Monomer LMW Oligomer Oligomery Protofibryle Włókna amyloidowe Blaszki amyloidowe 3
Badania dotyczące choroby Alzheimera w Instytucie Badań Biomedycznych (IRB Barcelona) Niektórzy naukowcy z Instytutu Badań Biomedycznych (IRB Barcelona) badają zaburzenia, które mają wpływ na neurony i związane z nimi procesy biochemiczne, zachodzące w trakcie rozwoju choroby. Koncentrują się oni na molekularnym aspekcie choroby: analizują białko beta-amyloidu. Między innymi badają in vivo wpływ opracowanej przez siebie cząsteczki, która hamuje agregację beta-amyloidu. Wyniki uzyskane podczas badań in vitro są bardzo obiecujące. Badania są kontynuowane, ponieważ ten inhibitor mógłby prawdopodobnie umożliwić opracowanie sposobów leczenia, które będą spowalniać, zatrzymywać, a nawet odwracać przebieg choroby. Tworzenie blaszek amyloidowych Hamowanie agregacji beta-amyloidu Monomer LMW Oligomer Oligomery Protofibryle Włókna amyloidowe Blaszki amyloidowe 4
Cel Celem tego protokołu jest wykonanie ostatniego etapu syntezy peptydu-inhibitora, który jest przeprowadzany w Instytucie IRB w Barcelonie. Wynikiem doświadczenia ma być uzyskanie swoistego fluorescencyjnego peptydu, który hamuje agregację beta-amyloidu odpowiedzialnego za chorobę Alzheimera. Ten etap jest niezbędny w laboratorium, aby móc przeprowadzić inne doświadczenia związane z tym peptydem. Metodologia A. Przyłączyć znacznik fluorescencyjny do peptydu-inhibitora beta-amyloidu. Należy wykorzystać wcześniej zsyntetyzowany peptyd hamujący beta-amyloid. Jako nośnik w procesie syntezy są stosowane ziarna żywicy. Peptyd zwiększa swoją długość dzięki przyleganiu pojedynczych aminokwasów do tych ziaren aż do uzyskania żądanej sekwencji. Gdy cały peptyd zostanie zsyntetyzowany, należy go przyłączyć do znacznika fluorescencyjnego i oddzielić od żywicy. W trakcie doświadczenia należy spowodować związanie cząsteczki fluorescencyjnej z N-końcowym fragmentem peptydu w fazie stałej, który wciąż przylega do ziaren żywicy. Dzięki temu peptyd będzie fluorescencyjny. Za pomocą mikroskopu optycznego można zaobserwować różnicę między ziarnami żywicy, na których znajduje się wyznakowany peptyd i tymi, na których go nie ma. A Znacznik fluorescencyjny Peptyd-inhibitor beta-amyloidu B Wyznakowany peptyd-inhibitor B. Oddzielić wyznakowany peptyd od żywicy i uzyskać go w roztworze. Po związaniu peptydu z cząsteczką fluorescencyjną należy go oddzielić od żywicy i wprowadzić wyznakowany peptyd do roztworu, który jest gotowy do przeprowadzenia oznaczeń laboratoryjnych. Peptyd w roztworze C. Sprawdzić, czy uzyskano wyznakowany peptyd. Na końcu należy przeprowadzić analizę, aby sprawdzić, czy w uzyskanym roztworze znajdują się peptydy. C 5
Wymagane wyposażenie i materiały Instrumenty i przybory laboratoryjne Zlewka Mikropipeta o pojemności 200µl Waga Stojak Stoper Zacisk i statyw na biurety Mikroskop (powiększenie 10 x) 6
Materiały jednorazowe Szalka Petriego Probówki Falcon 15 ml i 50 ml Końcówki do pipet Probówki 1,5 ml Pipety Pasteura Filtr Zawór Pręcik teflonowy* Szpatułka Strzykawka z zaworem i filtrem *Można także zastosować strzykawkę o pojemności 1 ml bez tłoka. 7
Odczynniki i rozpuszczalniki (przygotowanie roztworów w załączniku II) Roztwór karboksyfluoresceiny i inne odczynniki Żywica z peptydeminhibitorem beta-amyloidu Odczynnik Bradforda 2% kwas trifluorooctowy (TFA) w DCM Roztwór buforu do neutralizacji kwasu Roztwór mleka w proszku albo mleko Roztwór organiczny do reakcji Zawiera 50% dichlorometanu (DCM) i 50% dimetyloformamidu (DMF) Woda destylowana 8
Procedury A Przyłączyć znacznik fluorescencyjny do peptydu będącego inhibitorem beta-amyloidu Należy wykorzystać peptyd-inhibitor beta-amyloidu przyczepiony do ziaren żywicy stanowiących nośnik. Na powierzchni każdego ziarna żywicy rosną tysiące łańcuchów peptydowych. Należy dodać końcowy znacznik fluorescencyjny, który umożliwi naukowcom zobaczenie peptydu w trakcie doświadczeń. Aby dodać cząsteczkę fluorescencyjną, należy zastosować strzykawkę wyposażoną w filtr i zawór. Zaletą tych ziaren jest to, że są na tyle duże, że nie przechodzą przez filtr, dzięki czemu można usunąć pozostałości produktu i rozpuszczalników, które zostały dodane. Znacznik fluorescencyjny Peptyd-inhibitor beta-amyloidu Wyznakowany peptyd-inhibitor 1 Przygotować materiał potrzebny do doświadczenia zgodnie z opisem na rysunku. 2 Zważyć żywicę z peptydem Umieścić strzykawkę z filtrem w zlewce. Odważyć 62,5 mg ziaren żywicy z peptydem do strzykawki, jak pokazano na rysunku. 9
3 4 Dodać roztwór organiczny do strzykawki, aby wszedł w reakcję ze znacznikiem fluorescencyjnym Za pomocą pipety Pasteura o pojemności 2 ml dodać organiczny roztwór dichlorometanu (DCM) i dimetyloformamidu (DMF), aby wprowadzić do roztworu peptydy przylegające do żywicy. Ten roztwór umożliwi także zwiększenie rozpuszczalności odczynników i znacznika fluorescencyjnego, które zostaną później dodane w celu przeprowadzenia reakcji. Mieszać mieszaninę pręcikiem teflonowym od czasu do czasu przez 3 minuty. 6 Dodać znacznik fluorescencyjny. 5 Usunąć roztwór organiczny. Następnie otworzyć zawór strzykawki i przelać dichlorometan przez filtr, aby usunąć rozpuszczalnik z żywicy. Za pomocą pipety Pasteura i przy zamkniętym zaworze strzykawki dodać 2 ml roztworu zawierającego karboksyfluoresceinę i inne odczynniki. 10
7 Mieszać od czasu do czasu przez 5 minut. 8 Odfiltrować nadmiar niezwiązanej karboksyfluoresceiny. Otworzyć zawór, aby usunąć karboksyfluoresceinę. 9 Powtórzyć ten proces z inną probówką, uzyskując trzy frakcje w trzech różnych probówkach. Sprawdzać, jak kolor robi się coraz jaśniejszy - peptyd z żywicą ma teraz kolor pomarańczowy: oznacza to, że karboksyfluoresceina została odpowiednio związana. Dodać dużo wody do strzykawki przy zamkniętym zaworze. Dobrze wymieszać i ponownie otworzyć zawór. Zebrać całą zawartość w probówce 50 ml. 10 Pod mikroskopem ocenić peptyd związany z żywicą ze znacznikiem fluorescencyjnym i bez niego. Pobrać niewielką próbkę dwóch typów żywicy: zważonej wcześniej w strzykawce i obecnej w strzykawce, związanej z karboksyfluoresceiną. Nałożyć je na tę samą szalkę Petriego i zaobserwować różnicę pod mikroskopem. 11
B Oddzielić wyznakowany peptyd od żywicy i uzyskać go w roztworze. 1 Potrzebny jest bardzo silny kwas do oddzielenia peptydu związanego z cząsteczką fluorescencyjną od ziarna żywicy: kwas trifluorooctowy (TFA). Dlatego bardzo ostrożnie instruktor doda 3 ml przygotowanej mieszaniny 2% TFA do strzykawki za pomocą pipety Pasteura. 2 Chwilę mieszać i odczekać 1 minutę. 12
3 4 Wziąć probówkę 50 ml zawierającą roztwór buforu w celu neutralizacji kwasu. Umieścić ją pod strzykawką i otworzyć zawór, aby usunąć roztwór. Zwrócić uwagę, że roztwór wprowadzany do probówki ma kolor pomarańczowożółty, a żywica jest teraz jaśniejsza. Wyznakowany peptyd został usunięty z żywicy i znajduje się teraz w roztworze w probówce, w której można zaobserwować dwie fazy. 13
C Sprawdzić, czy uzyskano wyznakowany peptyd. Na końcu należy wykonać analizę, aby sprawdzić, czy w uzyskanym roztworze znajdują się peptydy. Należy skorzystać z bardzo typowej metody laboratoryjnej, metody Bradforda. 1 Za pomocą mikropipety pobrać 200 µl każdej z dwóch faz i umieścić je w dwóch probówkach o pojemności 1,5 ml. 2 Jednocześnie wykonać jedną kontrolę pozytywną i jedną negatywną. Do kontroli pozytywnej wziąć 200 µl próbki mleka w proszku (wiemy, że zawiera białka) i dodać do probówki. Do kontroli negatywnej wziąć 200 µl wody dejonizowanej (wiemy, że nie zawiera białek) i dodać do innej probówki. 3 Po napełnieniu 4 probówek dodać 50 µl odczynnika Bradforda do każdej z nich - ten odczynnik wiąże się swoiście z białkami i powoduje widoczną zmianę koloru. Dobrze wymieszać i zaobserwować różnice kolorów. 14
Wyniki i wnioski 1. Dlaczego stosujemy odczynnik Bradforda? Należy zanotować kolory widoczne w każdej probówce i stwierdzić, w której z nich są obecne peptydy. 2. Po oddzieleniu wyznakowanego peptydu od żywicy i zebraniu go w roztworze neutralizującym uzyskano roztwór o dwóch fazach. Która faza zawiera peptyd? 3. Co rozumiesz pod pojęciem kontrola pozytywna i kontrola negatywna w doświadczeniu? Czy są one konieczne? 4. Dlaczego przeprowadzamy płukanie po przyłączeniu znacznika fluorescencyjnego do peptydu przylegającego do żywicy? 15
5. Jakie wizualne różnice zaobserwowałeś pod mikroskopem między ziarnami suchej żywicy bez znacznika a ziarnami po przyłączeniu do nich znacznika fluorescencyjnego? 6. Dlaczego stosujemy kwas trifluorooctowy (TFA)? 7. Dlaczego znakowanie peptydu cząsteczką fluorescencyjną jest przydatne? 16
Załącznik I Środki ostrożności związane z bezpieczeństwem Odpowiednia wiedza Należy wiedzieć, gdzie znajdują się elementy bezpieczeństwa i miejsce wykonywania doświadczeń (gaśnice, prysznice lub łazienka, wyjścia itp.). Przed przeprowadzeniem doświadczenia dokładnie przeczytaj instrukcje. Nie zapomnij przeczytać etykiet bezpieczeństwa odczynników i aparatury. Noś odpowiednią odzież Rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary. Ogólne zasady Nie wolno palić, jeść ani pić w laboratorium ani w miejscu przeznaczonym na doświadczenia. Nie należy pracować w pośpiechu i należy utrzymywać czystość. Rozlany produkt należy natychmiast usunąć. Materiały należy zawsze zostawiać czyste i uporządkowane. Nie wolno używać sprzętu ani urządzenia, jeżeli nie poznano dokładnie sposobu jego działania. Przed opuszczeniem laboratorium należy umyć ręce. Praca ze szkłem W czasie pracy ze szkłem należy chronić ręce. Należy pamiętać, że nie ma możliwości odróżnienia gorącego szkła od zimnego i dlatego należy zawsze sprawdzać temperaturę szkła przed dotknięciem. Nie należy używać elementów szklanych, które są popękane. Związki chemiczne Nie wolno używać żadnych odczynników w butelkach bez etykiety i z niewłaściwymi etykietami. Związków chemicznych nie wolno wąchać, wdychać, kosztować ani dotykać. Nigdy nie należy pipetować ustami. W czasie pracy ze związkami toksycznymi lub żrącymi należy nosić rękawice i często myć ręce. W przypadku kontaktu produktu z oczami należy niezwłocznie przemyć oczy dużą ilością wody. Nie wolno zbliżać pojemników z odczynnikami do płomienia. Nie wolno podgrzewać palnych cieczy. Butelki należy przenosić, trzymając je za dno, a nie za szyjkę. Utylizacja odpadów Odpady w postaci stałej i płynnej wymagające takiego traktowania należy usuwać do specjalnych i odpowiednio oznakowanych pojemników. W przypadku wątpliwości zapytaj instruktora. Nie wolno wyrzucać odpadów stałych do zlewu. Pamiętaj W razie wypadku należy niezwłocznie powiadomić instruktora. SZCZEGÓLNE ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE TYCH WARSZTATÓW Rozpuszczalniki organiczne: - dimetyloformamid (DMF) - dichlorometan (DCM) - 2% kwas trifluorooctowy (TFA) Łatwopalne Toksyczny po połknięciu, wniknięciu do dróg oddechowych i w kontakcie ze skórą. Roztwór karboksyfluoresceiny z N-etylodiizopropyloaminą (DIEA): Roztwór neutralizujący: Toksyczny po połknięciu, wniknięciu do dróg oddechowych i w kontakcie ze skórą. Powoduje zabarwienie skóry. Toksyczny po połknięciu, wniknięciu do dróg oddechowych i w kontakcie ze skórą. 17
Załącznik II Numery referencyjne do zakupu odczynników i niektórych niezbędnych materiałów NAZWA REFERENCYJNEGO sprzedawcy dimetyloformamid (DMF) P0343521 odczynniki Carlo Erba dichlorometan (DCM) P02905E58N odczynniki Carlo Erba kwas trifluorooctowy (TFA) T6508-25ML Sigma-Aldrich karboksyfluoresceina 21877-5G-F Sigma-Aldrich N-etylodiizopropyloamina (DIEA) 550043-100ML Sigma-Aldrich Roztwór buforu (PBS) * P4417-50TAB Sigma-Aldrich Ziarna żywicy* BR-1065 Iris Biotech GmbH Odczynnik Bradforda B6916-500ML Sigma-Aldrich Białko BSA A7906-10G Sigma-Aldrich Strzykawka z filtrem (materiał jednorazowy) 12131016 Agilent Technologies Zawór do strzykawki (wielorazowy) 070.110.190 Ryan Herco Flow 18
Załącznik III Protokoły przygotowania roztworów przez instruktorów: 1. Roztwór organiczny do reakcji (zawiera 50% dichlorometanu [DCM] \ i 50% dimetyloformamidu [DMF]) Wymieszać 20 ml każdego rozpuszczalnika w probówce skalowanej Falcon. 2. Roztwór karboksyfluoresceiny i inne odczynniki: 23 mg karboksyfluoresceiny 85 µl N-etylodiizopropyloaminy (DIEA) 1 ml organicznego roztworu dimetyloformamidu (DMF) i dichlorometanu (DCM) (50/50) 3. 2% kwas trifluorooctowy (TFA) w DCM 4. Roztwór buforu do neutralizacji kwasu (PBS) 30 ml przygotowanego roztworu PBS 100 mg białka BSA Instruktor musi mieć przygotowane wcześniej zsyntetyzowane peptydy na ziarnach żywicy. Doświadczenie można także przeprowadzić z ziarnami żywicy bez peptydu. W takim przypadku białka należy dodać do roztworu neutralizującego, aby zagwarantować dodatni wynik w metodzie Bradforda. Można dodać łyżkę białka BSA. 19
Kontynuuj badania w Xplore Health! Badacze, którzy pomagali przygotować treść: Miguel Moreno Raja, Irene Martín Badajoz, Anna Guimerais, Muriel Arimón Bedós, badacze w Instytucie Nauk Biomedycznych (IRB Barcelona). Opracowano przez Finansowanie Niniejsza praca została objęta licencją Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported Creative Commons. Kopię licencji przedstawiono na stronie http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3. 0/.