Zbadaj szczepionkę przeciwko wirusowi HIV

Transkrypt

1 Zbadaj szczepionkę przeciwko wirusowi HIV Warsztaty doświadczalne Protokół

2 Podsumowanie Instytut Badań nad IDS Irsiaixa opracowuje szczepionkę chroniącą ludzi przed zakażeniem wirusem wywołującym IDS (HIV) i niedawno zidentyfikował kandydata na szczepionkę, który obecnie jest w fazie opracowywania. Jednym z głównych problemów programu opracowywania szczepionek jest ogromna różnorodność typów wirusa w różnych regionach świata. W tej pracowni spróbujesz sprawdzić, czy szczepionka przeciwko HIV, opracowana przez Irsiaixa może zapewnić skuteczną ochronę ludziom na różnych kontynentach. Wprowadzenie Ponad 33 miliony osób na całym świecie są zarażone wirusem HIV wywołującym IDS i co minutę kolejnych sześć osób ulega zakażeniu. Obecnie mamy już leki wydłużające życie i poprawiające jego jakość u osób zakażonych, ale nie znamy kuracji umożliwiającej całkowite wyleczenie i nie mamy szczepionki. Instytut Badań nad IDS Irsiaixa od ponad 15 lat pracuje nad szczepionką i stara się ulepszyć istniejące leki. W międzyczasie najlepszym narzędziem do walki z pandemią pozostaje profilaktyka. 2

3 Szczepionka jest substancją, która uczy układ odpornościowy (immunologiczny), jak rozpoznawać wirusy lub bakterie powodujące choroby i jak się przed nimi bronić. W momencie podania szczepionki nasz układ odpornościowy rozpoznaje składniki szczepionki jako ciała obce i uruchamia odpowiednią odpowiedź organizmu. Dzięki temu, gdy zaatakują nas drobnoustroje, układ immunologiczny będzie gotowy do walki Białko będące kandydatem na szczepionkę stymuluje układ immunologiczny do produkcji skierowanych przeciwko niemu przeciwciał. 2. Jeżeli zaszczepiona osoba zakazi się, będzie już mieć przeciwciała, które zaatakują wirusa HIV. 3. le jeżeli zaszczepiona osoba zakazi się wirusem HIV, który składa się z innego białka, przeciwciała wytworzone przez szczepionkę nie będą pomocne w zwalczaniu tej infekcji. 3

4 rudność w opracowaniu szczepionki przeciwko wirusowi HIV polega na wymyśleniu takiej szczepionki, która potrafi aktywować układ odpornościowy, tak aby całkowicie wyeliminować infekcję wywołaną przez miliony genotypów wirusa HIV, które istnieją na całym świecie. 01 _ E ,3 % 02 _ ,0 % ,1 % B ,1 % ,4 % DE ,6 % F ,9 % ,2 % inne ,4 % razem ,0% Rozkład różnych genotypów wirusa HIV-1 na świecie. (Baza danych sekwencji HIV Los lamos, 4

5 W jaki sposób można uczestniczyć w poszukiwaniu szczepionki przeciwko wirusowi HIV? W ramach naszych warsztatów będzie można zbadać białko wirusa HIV, które instytut Irsiaixa zidentyfikował jako możliwy składnik szczepionki chroniącej ludzi przed wirusem. W laboratorium (czyli w warunkach in vitro ) wykazano, że to białko stymuluje odpowiedź układu immunologicznego. Obecnie instytut Irsiaixa prowadzi dalsze badania in vitro, aby ocenić skuteczność tego białka, a jeżeli wszystko pójdzie dobrze, rozpoczną się bardziej zaawansowane prace rozwojowe, zakończone badaniami z udziałem pacjentów. elem naszych warsztatów będzie określenie, czy kandydat na szczepionkę instytutu Irsiaixa będzie skutecznie chronić ludzi przed mnogością genotypów wirusa HIV w różnych rejonach świata. może będziemy musieli opracować różne szczepionki dla różnych części świata? by to zbadać, należy sprawdzić, czy to białko występuje w genotypach wirusa HIV z fryki, zji i Europy. Jeżeli występuje, szczepionka może skuteczne chronić przed zakażeniem tymi genotypami wirusa HIV przez wywołanie reakcji na nie ze strony układu immunologicznego. aka szczepionka mogłaby skutecznie chronić populacje tych kontynentów. le jeżeli dowolny z tych genotypów nie zawiera białka będącego kandydatem na szczepionkę, to taka szczepionka nie będzie skutecznie zwalczać tego genotypu wirusa HIV i trzeba będzie ją zmodyfikować.??? Wirus afrykański Wirus azjatycki Wirus europejski 5

6 ele Udział w programie opracowywania szczepionki przeciwko IDS przez Irsiaixa zgodnie z etapami metody naukowej. Stosowanie technik laboratoryjnych typowych dla tej dziedziny nauki, takich jak rozdzielanie fragmentów DN metodą elektroforezy czy cięcie DN za pomocą enzymów restrykcyjnych. Zbadanie i poznanie ogromnej różnorodności odmian wirusa powodującego IDS. Sprawdzenie, czy białko rozpoznane przez instytut Irsi- aixa jako kandydat na szczepionkę może skutecznie stymulować układ immunologiczny osób narażonych na większość genotypów wirusa HIV z różnych kontynentów: fryki, zji i Europy. Hipoteza by stać się częścią szczepionki, białkokandydat rozpoznane przez instytut Irsiaixa nie jest modyfikowane w przypadku znacznej większości genotypów wirusa HIV istniejących na świecie. Dlatego szczepionka zawierająca to białko powinna być jednakowo skuteczna w zwalczaniu większości istniejących genotypów wirusa HIV. 6

7 Metodyka Będziemy pracować z próbkami DN pochodzącymi od trzech najbardziej rozpowszechnionych genotypów wirusa HIV występujących na trzech kontynentach: w fryce, zji i Europie. Będziemy mieć także próbkę DN zawierającą informacje potrzebne do wytworzenia białka będącego kandydatem na szczepionkę Irsiaixa. Za pomocą tych próbek zbadasz, czy różne genotypy wirusa HIV zawierają sekwencję DN kandydata. DN DN Białko będące kandydatem Najbardziej popularny genotyp wirusa HIV w Europie DN DN Najbardziej popularny genotyp wirusa HIV w fryce Najbardziej popularny genotyp wirusa HIV w zji 7

8 W celu przeprowadzenia tego badania wykonamy następujące zadania: () ięcie nici DN wirusów pochodzących z trzech kontynentów: Wykorzystamy do tego enzymy restrykcyjne, czyli białka, które są znane badaczom ze względu na zdolność przecinania DN w konkretnych miejscach. Enzym, który zastosujemy, precyzyjnie przecina miejsce, w którym znajduje się gen odpowiedzialny za syntezę białka będącego kandydatem, ale nie przetnie go, jeżeli istnieją jakiekolwiek zmiany w badanym odcinku DN. Dlatego próbki DN zostaną pocięte tylko wtedy, gdy ten gen nie jest zmodyfikowany. (B) Rozdzielenie fragmentów DN: Za pomocą metody o nazwie elektroforeza rozdzielimy fragmenty DN powstałe w trakcie trawienia enzymami. () Wizualizacja fragmentów DN: Uwidocznimy, które próbki DN zostały pocięte, a dzięki temu dowiemy się, które genotypy są odpowiedzialne za syntezę białka-kandydata. B 8

9 Wyniki i wnioski Porównamy sekwencje genetyczne różnych genotypów wirusa HIV, analizując skutki działania enzymu restrykcyjnego, a dzięki temu poznamy różnice w ich DN. Dzięki tym informacjom będziemy mogli zbadać ogromną różnorodność wirusa HIV. Uzyskane wyniki pozwolą nam na określenie, czy białko będące kandydatem Irsiaixa może skutecznie chronić osoby pochodzące z różnych kontynentów, czy też należy opracować różne szczepionki, każdą dostosowaną do sekwencji wirusa obecnego w danym rejonie geograficznym. 9

10 Wymagane instrumenty i materiały Instrumenty i materiały laboratoryjne pipety o pojemności 10 i 20 µl stojaki chłodziarka łaźnia wodna i statyw na probówki komora do elektroforezy zasilacz żel agarozowy minutnik 3 pojemniki (do barwienia i oczyszczania żelu) marker do pisania na szkle 10

11 Materiały jednorazowe rękawice i fartuchy końcówki do pipet probówki 1,5 ml i/lub 0,5 ml Odczynniki i rozpuszczalniki * DN wirusa z różnych próbek enzym restrykcyjny Nhel + bufor (1) marker mas cząsteczkowych (2) bufor E 500 ml 0,5x E (3) bufor obciążający (4) płyn do wybarwiania DN (Stain Fast 100x) woda destylowana: 3 szklane butelki o pojemności 500 ml i jedna probówka 1,5 ml. (1) Bufor jest potrzebny, aby uzyskać odpowiednie podłoże do działania enzymów. (2) Etykieta na markerze informuje, że służy on do pomiaru różnych fragmentów od 100 do 3000 par zasad. (3) by utrzymać ph, zawiera także sole ułatwiające przepływ prądu elektrycznego (w stężeniu 0,5 x do napełnienia komory). (4) Nadaje kolor i gęstość próbkom, dzięki czemu można je łatwiej zlokalizować. *Zamierzając przeprowadzić to doświadczenie w szkole lub muzeum, należy skontaktować się z nami, pisząc pod adres divulgacio@irsicaixa.es w celu uzyskania wymaganych odczynników. 11

12 Procedura ięcie nici DN wirusów pochodzących z trzech kontynentów + Wprowadzenie Potniemy DN trzech genotypów wirusa HIV, wykorzystując enzymy restrykcyjne, czyli białka, które są znane badaczom ze względu na zdolność przecinania DN w konkretnych miejscach. Enzym, który zastosujemy, precyzyjnie przecina gen odpowiedzialny za syntezę białka będącego kandydatem, ale nie przetnie go, jeżeli istnieją jakiekolwiek zmiany w badanym obszarze DN. Dlatego próbki DN będą pocięte tylko wtedy, gdy ten gen nie jest zmodyfikowany. 12

13 Procedura 1 2 Zamykamy probówkę i delikatnie mieszamy jej zawartość, ostukując probówkę palcem. Za pomocą pipety przygotujemy składniki mieszaniny do reakcji trawienia w czterech odpowiednio oznakowanych probówkach 1,5 ml. Do każdej probówki dodamy: Wodę destylowaną 16 µl Bufor w celu zapewnienia prawidłowego działania enzymu restrykcyjnego (zielony) 3 µl Enzym restrykcyjny (zimny) 1 µl Jedną z czterech próbek DN (zawierających jedno białko będące kandydatem i 3 genotypy wirusa HIV) 10 µl 3 Przetrzymujemy (inkubujemy) probówkę w temperaturze 37 przez 5 minut, aby enzym restrykcyjny mógł przeciąć DN. 4 Po 5 minutach wkładamy probówkę do chłodziarki, aby zatrzymać reakcję trawienia. 13

14 B Rozdzielanie pociętych fragmentów DN Wprowadzenie by rozdzielić fragmenty DN, zastosujemy powszechnie stosowaną w laboratoriach metodę o nazwie elektroforeza, która umożliwia rozdzielenie fragmentów DN na podstawie ich długości. W tym celu próbki DN umieszcza się na porowatym żelu przygotowanym na bazie żelatyny z wodorostów. by ułatwić umieszczanie próbek i zobaczyć, jak się przemieszczają, należy dodać buforu obciążającego, który nadaje im gęstość i kolor. Żel zawiera także marker DN, składający się z fragmentów DN o znanej długości, który ułatwi ocenę długości badanych fragmentów próbki. Do żelu zostaje przyłożony prąd elektryczny - ładunek ujemny po jednej stronie, a dodatni po drugiej. Ponieważ fragmenty DN mają naturalnie ładunek ujemny, po umieszczeniu ich z jednej strony żelu są przyciągane przez ładunek dodatni i przemieszczane. Odległość, jaką pokonają w żelu jest proporcjonalna do ich długości: krótsze fragmenty mogą być przemieszczane szybciej niż dłuższe, które wolniej przechodzą przez pory żelu. 14

15 Procedura B 1 2 Umieszczamy żel pośrodku komory do elektroforezy, zagłębieniami od strony ładunku ujemnego. Następnie wypełniamy komorę buforem E 0,5x, wlewając go po bokach, tak aby nie uszkodzić żelu i całkowicie go przykryć. Przygotowujemy próbki DN z buforem obciążającym: nie będzie konieczne dodanie buforu obciążającego do próbek trawionych enzymami restrykcyjnymi, ponieważ bufor enzymatyczny, którego już dodaliśmy, zawiera zielony bufor obciążający. Dlatego bierzemy 3 probówki 0,5 ml i za pomocą pipety dodajemy 2 µl zielonego buforu obciążającego i 20 µl pierwotnej, niepoddanej trawieniu próbki. e próbki będą pełnić rolę kontroli. 3 4 Przykrywamy komorę i podłączamy ją do źródła zasilania 130 V / 200 m na około 20 minut. Wprowadzamy próbki do zagłębień za pomocą pipety, w niniejszej kolejności: pierwsze zagłębienie na (25 µl) markera DN kolejne trzy zagłębienia na próbki DN zawierające niestrawione genotypy (20 µl) i kolejne cztery na próbki po trawieniu (pierwszy na DN kandydata, a następne na próbki 3 genotypów wirusa HIV) (25 µl) 15

16 W trakcie elektroforezy należy przećwiczyć mapę restrykcyjną 1. Rozpoznaj sekwencję(e) docelową(e) enzymu restrykcyjnego Nhel w obrębie pełnej sekwencji DN białka będącego kandydatem. Uzupełnij sekwencję DN kandydata na szczepionkę: par zasad Sekwencja docelowa enzymu restrykcyjnego: 16

17 2. Ile fragmentów DN otrzymamy, jeżeli enzym znajdzie swój cel i przetnie DN? Jakiej wielkości? 3. Ile fragmentów DN otrzymamy, jeżeli enzym NIE znajdzie swojego celu i NIE przetnie DN? Jakiej wielkości? 4. W jaki sposób, według iebie, marker DN pomoże określić wymiary otrzymanych fragmentów? 5. Rozpoznaj sekwencję(e) docelową(e) enzymu restrykcyjnego EcoRV w obrębie pełnej sekwencji DN białka będącego kandydatem: 6. Ile fragmentów DN otrzymalibyśmy, gdybyśmy zastosowali ten inny enzym? Jakiej wielkości? (W doświadczeniu wykorzystaliśmy enzym Nhel, ponieważ miejsce, które przecina, interesuje nas pod względem badawczym, gdyż bardziej skutecznie stymuluje układ immunologiczny) 17

18 Praktyka: zobacz, jak przebiega elektroforeza 7. Dlaczego rozdzielamy fragmenty? Jak się oddziela te fragmenty od żelu agarozowego? 8. Jaki ładunek ma DN? o by się stało w przypadku odwrotnego podłączenia elektrod? 9. o można zobaczyć? Dlaczego został dodany bufor obciążający? 18

19 Wizualizacja fragmentów DN Wprowadzenie Na tym etapie wybarwiamy fragmenty DN, aby móc je zobaczyć i sprawdzić, czy zostały pocięte. ylko te fragmenty, które zostały pocięte, będą mieć gen odpowiedzialny za syntezę białka będącego kandydatem Irsiaixa z oryginalną sekwencją, czyli bez mutacji pz

20 Procedura 1 Wyjmujemy żel ze statywów i zanurzamy w roztworze w celu barwienia (Stain Fast Blast) w pojemniku o odpowiedniej wielkości na około 2 minuty. 2 Przenosimy żel do większego pojemnika, zawierającego 500 ml wody. Ostrożnie poruszamy żelem przez około 10 minut, aby go przepłukać. 3 eraz musimy umyć żel: Przenosimy żel do trzeciego pojemnika, zawierającego 500 ml czystej wody i delikatnie poruszamy żelem co minutę, łącznie przez 5 minut. 4 Przeprowadzamy drugie płukanie zgodnie z opisem w poprzednim rozdziale. 5 Prążki DN powinny się już pojawić na żelu, ale raczej będą zamazane. Jeżeli poczekamy od 5 do 15 minut, staną się bardziej wyraźne. * *by uzyskać lepszy kontrast, należy zastosować dodatkowe kilkukrotne płukanie wodą. 20

21 Wyniki i wnioski 10. Przypatrz się prążkom DN uzyskanym dla każdej próbki każdego genotypu i narysuj wyniki poniżej. Zaznacz także długość segmentów markera DN. 11. Jaki wpływ miały enzymy restrykcyjne na każdy genotyp? Wirus afrykański Wirus europejski Wirus azjatycki 21

22 12. zy istnieje jakiś genotyp wirusa HIV, na który enzym nie zadziałał? 13. Jaki wniosek wynika z woich badań? (Odnieś się do początkowej hipotezy). 22

23 O instytucie Irsiaixa zym jest instytut Irsiaixa? Instytut Badań nad IDS Irsiaixa jest międzynarodowym instytutem referencyjnym, którego celem jest poszerzanie wiedzy, profilaktyka i leczenie zakażenia wirusem HIV i IDS, przy czym celem ostatecznym jest eliminacja epidemii. Instytut Irsiaixa, wspierany przez fundację la aixa i Wydział Zdrowia Rządu Katalonii, został założony w roku 1995 jako prywatna organizacja non-profit przy szpitalu uniwersyteckim ermans rias i Pujol de Badalona. Instytut Irsiaixa, kierowany przez dr Bonaventurę loteta, skupia ponad pięćdziesięciu badaczy, którzy są zaangażowani głównie w badania podstawowe, zmierzające do wyjaśnienia mechanizmów zakażenia wirusem HIV oraz opracowania nowych leków i szczepionek. Jednocześnie instytut Irsiaixa uczestniczy w badaniach klinicznych oceniających nowe strategie terapeutyczne i współpracuje z krajami rozwijającymi się w celu zwalczenia globalnej pandemii. Badania naukowe Instytutu Badań nad IDS Irsiaixa są prowadzone we współpracy z najbardziej znanymi międzynarodowymi ośrodkami naukowymi, a publikacje uzyskują jeden z najwyższych współczynników IF (ang. impact factor) w tej dziedzinie. 23

24 neks Środki zapewniające bezpieczeństwo Odpowiednia wiedza Zobacz, gdzie znajdują się środki zapewniające bezpieczeństwo w laboratorium lub miejscu przeznaczonym do przeprowadzania doświadczeń (gaśnice, prysznice lub łazienki, wyjścia awaryjne itp.). Przed przeprowadzeniem doświadczenia dokładnie przeczytaj instrukcje. Nie zapomnij przeczytać etykiet bezpieczeństwa odczynników i aparatury. Noś odpowiednią odzież Rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne. Ogólne zasady Nie wolno palić, jeść ani pić w laboratorium lub w miejscu przeznaczonym na doświadczenia. Należy pracować systematycznie, starannie i bez pośpiechu. Rozlany produkt należy natychmiast usunąć. Materiały należy zawsze zostawiać czyste i uporządkowane. Nigdy nie należy stosować sprzętu ani urządzenia, jeżeli nie poznano dokładnie sposobu jego działania. Przed opuszczeniem laboratorium należy umyć ręce. Praca ze szkłem W trakcie pracy ze szkłem należy chronić ręce i zwracać uwagę na temperaturę, ponieważ szkło gorące nie różni się wyglądem od zimnego. Nie należy używać elementów szklanych, które są popękane. Związki chemiczne Nie wolno używać żadnych odczynników w butelkach bez etykiety lub z niewłaściwymi etykietami. Związków chemicznych nie wolno wąchać, wdychać, smakować ani dotykać. Nigdy nie należy pipetować ustami. W czasie pracy ze związkami toksycznymi lub żrącymi należy nosić rękawice i często myć ręce. W przypadku kontaktu z oczami należy je natychmiast przemyć wodą. Nie wolno zbliżać pojemników z odczynnikami do płomienia. Nie wolno podgrzewać palnych cieczy. Butelki należy przenosić, trzymając je za dno, a nie za szyjkę. Utylizacja odpadów Odpady w postaci stałej i płynnej wymagające takiego traktowania należy usuwać do specjalnych, odpowiednio oznakowanych pojemników. Wszelkie pytania kieruj do instruktora. Nigdy nie wolno wyrzucać odpadów stałych do zlewu. Pamiętaj W razie wypadku należy niezwłocznie powiadomić instruktora. Szczególne środki ostrożności dotyczące tych warsztatów W czasie tych warsztatów będziesz pracować z odczynnikami chemicznymi, rozpuszczalnikami i instrumentami, które stanowią następujące zagrożenia: Bufor E: Jest toksyczny w przypadku spożycia i może powodować poważne podrażnienie oczu. Należy go utylizować jako odpad niebezpieczny. Żel agarozowy: Należy utylizować jako odpad niebezpieczny. Ponieważ zawiera bufor E, należy postępować zgodnie z powyższymi instrukcjami. DN Stain Fast Blast: oksyczny po spożyciu. Nie ma konieczności utylizacji jako odpadu niebezpiecznego, ale należy rozcieńczyć dużą ilością wody. Elektroforeza: Należy zwracać szczególną uwagę na zagrożenia związane z prądem elektrycznym. 24

25 Kontynuuj swoje badania na Xplore Health! Badacze, którzy pomagali przygotować treść: Marta urriu, badaczka instytutu Irsiaixa. opracowano przez Niniejsza praca została objęta licencją ttribution-nonommercial-noderivs 3.0 Unported reative ommons. Kopię licencji zaprezentowano na stronie licenses/by-nc-nd/3.0/