Receptory nukleotydowe a dynamika cytoszkieletu aktynowego

Receptory nukleotydowe a dynamika cytoszkieletu aktynowego STRESZCZENIE Receptory nukleotydowe poprzez aktywację podjednostek α heterotrimerycznych białek G q, G o, G 12 kontrolują procesy zależne od dynamiki cytoszkieletu aktynowego, jak: endo- i egzocytozę, cytokinezę, transport wewnątrzkomórkowy, adhezję i migrację. Reorganizacja filamentów aktynowych: polimeryzacja i depolimeryzacja, formowanie i degradacja sieci oraz wiązek filamentów, a także zmiany kurczliwości systemu aktomiozynowego regulowane są przez kaskady sygnałowe, w których istotną rolę odgrywają białka z podrodziny Rho; RhoA, Rac1 i Cdc42 oraz fosfoinozytole, przede wszystkim PIP 2, który wiąże się bezpośrednio z różnymi białkami regulującymi aktynę (m.in. profiliną, kofiliną, α-aktyniną, winkuliną, spektryną) i moduluje ich funkcje. Receptor P2Y 2 (P2Y 2 R) jest jednym z receptorów nukleotydowych, który w różnych typach komórek reguluje, za pośrednictwem szlaków sygnałowych związanych z białkami Rho, procesy odpowiedzialne za migrację komórek. Związanie receptora P2Y 2 z G q indukuje hydrolizę PIP 2 i generuje reakcję wapniową. Połączenie receptora P2Y 2 z białkami G o lub G 12 powoduje aktywację szlaków sygnałowych związanych z białkami z rodziny Rho. Dla aktywacji właściwych szlaków sygnałowych, niezbędne jest oddziaływanie pomiędzy receptorem a integrynami. WPROWADZENIE Funkcjonalna i morfologiczna odpowiedź komórki na różnorodne bodźce związana jest z dynamicznymi zmianami w organizacji cytoszkieletu aktynowego i zależy od aktywności białek wiążących aktynę. Reorganizacja cytoszkieletu zazwyczaj rozpoczyna się w odpowiedzi na stymulację związkami dyfundującymi w zewnątrzkomórkowym środowisku (np. nukleotydami, czynnikami wzrostu, cytokinami, hormonami), sygnałami odbieranymi z podłoża lub przekazywanymi przez komórki sąsiadujące, jak również w efekcie mechanicznego pobudzenia komórki (jej rozciągania bądź zgniatania). Czynniki te w większości stymulują receptory transbłonowe na powierzchni komórki, m.in.: receptory posiadające aktywność kinaz tyrozynowych, receptory związane z heterotrimerycznymi białkami G, w tym receptory nukleotydowe oraz cząsteczki adhezyjne takie jak: integryny, kadheryny czy białka z rodziny immunoglobulin [1]. Receptory te aktywują następnie rozmaite ścieżki sygnałowe, z których, w regulacji cytoszkieletu aktynowego, największą rolę odgrywają szlaki związane z białkami z podrodziny Rho [2,3], współdziałające synergistycznie lub antagonistycznie z wtórnymi przekaźnikami informacji, takimi jak jony wapnia czy fosfatydyloinozytole: fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan (PIP 2 ), fosfatydyloinozytolo-3,4,5- -trisfosforan (PIP 3 ) [4,5]. Efektorami szlaków regulujących organizację cytoszkieletu aktynowego są białka wiążące aktynę (ABP, ang. actin binding proteins) [6-8]. Białka te mogą przyłączać się do F-aktyny, G-aktyny lub do obu tych form aktyny. Jednymi z białek kontrolujących organizację cytoszkieletu aktynowego, których aktywność regulują szlaki sygnałowe indukowane przez receptory P2Y są ADF/kofilina oraz miozyna II. Kofilina posiada zdolność depolimeryzacji oraz fragmentacji filamentów aktynowych, a konsekwencją interakcji aktyny z miozyną II jest kurczliwość systemu aktomiozynowego. Właściwe zmiany w organizacji cytoszkieletu aktynowego, indukowane stymulacją receptorów nukleotydowych, promują rozmaite zjawiska związane z ruchliwością komórek niemięśniowych, m. in. chemotaksję czy endocytozę, o czym traktuje zamieszczony w niniejszym zeszycie artykuł pt. Receptory nukleotydowe i ruch komórki, którego autorem jest Paweł Pomorski. RECEPTORY NUKLEOTYDOWE AKTYWUJĄCE BIAŁKA Rho Sygnalizacja nukleotydowa jest jednym z najstarszych i najbardziej rozpowszechnionych pozakomórkowych systemów sygnalizacji. Ma ona wpływ na ogromną liczbę procesów wewnątrzkomórkowych i odgrywa istotną rolę w funkcjonowaniu m.in. układu nerwowego [9,10]. Syntezę aktywnych funkcjo- Wanda Kłopocka Jarosław Korczyński Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, Warszawa Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa; tel.: (22) 58 92 300, e-mail: w.klopocka@nencki. gov.pl Artykuł otrzymano 10 października 2014 r. Artykuł zaakceptowano 14 października 2014 r. Słowa kluczowe: receptory P2Y, białka Rho, cytoszkielet aktynowy, szlaki sygnałowe Wykaz skrótów: ABP (ang. actin binding proteins) białka wiążące aktynę; CaM kalmodulina; DAG diacyloglicerol; EGF (ang. epidermal growth factor) naskórkowy czynnik wzrostu; EGFR receptor EGF; ERM (ang. ezrin-radixin-moesin) rodzina białek, które biorą udział w wiązaniu filamentów aktynowych do błony plazmatycznej; GAP (ang. GTPase-activating protein) rodzina regulatorowych białek, które wiążą małe białka G, stymulując ich GTPazową aktywność; GDI (ang. guanine nucleotide dissociation inhibitors) białka wiążące się z monomeryczną GTPazą w formie związanej z GDP; GEF (ang. guanine nucleotide exchange factors) białka aktywujące monomeryczne GTPazy np. Rho lub Rab; GPCR (ang. G-protein-coupled-receptors) receptory metabotropowe sprzężone z białkiem G; IP 3 inozytolo-1,4,5-trisfosforan; LIMK kinaza LIM; MHC (ang. myosin heavy chains) ciężkie łańcuchy miozyny II; MLC (ang. myosin light chains) lekkie łańcuchy miozyny II; MLCK (ang. myosin light chains kinase) kinaza lekkich łańcuchów miozyny II; MLCP (ang. myosin light chains phosphatase) fosfataza lekkich łańcuchów miozyny II; PAK (ang. p21-activated kinase) kinaza wiążąca się z domeną p21 białka Rac1; PIP fosfatydyloinozytolo-4-fosforan; PIP 2 fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan; PIP 3 fosfatydyloinozytolo-3,4,5-trisfosforan; PKC białkowa kinaza C; PLC fosfolipaza C; SOCE (ang. store-operated calcium entry) pojemnościowy napływ jonów wapnia; SOC (ang. store-operated channel) kanał wapniowy aktywowany w wyniku opróżnienia wewnątrzkomórkowych magazynów wapnia; SSH fosfataza Slingshot; VASP (ang. vasodilator-stimulated phosphoprotein) białko biorące udział w wydłużaniu filamentów aktynowych Postępy Biochemii 60 (4) 2014 447

nalnie receptorów nukleotydowych stwierdzono w rozmaitych komórkach, w tym we wszystkich typach komórek glejowych zarówno obwodowego (komórki Schwanna), jak i centralnego układu nerwowego (astrocyty, oligodendrocyty, mikroglej) [11]. Pełnią one ważną rolę w międzykomórkowej komunikacji pomiędzy astrocytami i neuronami [12]. Receptory nukleotydowe mają bezpośredni związek praktycznie z każdą formą neuropatologii, włączając w to nowotworzenie [9]. Aktywując szlaki sygnałowe związane z białkami Rho kontrolują niemal wszystkie procesy i zjawiska, u podstaw których leży reorganizacja cytoszkieletu aktynowego. Badania prowadzone na neuronach korowych pokazały, że UTP (selektywny agonista receptora P2Y 2 ) powoduje wzrost neurytu, a jego ekspansja związana jest z indukcją ścieżki aktywującej białko Rho i w konsekwencji fosforylacją (dezaktywacją) kofiliny [13]. Poznanie mechanizmów regulacji wzrostu neurytów jest niezwykle istotne dla działań neuroprotekcyjnych. Ruchliwość komórek mikrogleju w centralnym układzie nerwowym, przejawiająca się w postaci chemotaksji i fagocytozy, zjawisk niezbędnych dla funkcji jakie pełni mikroglej, jest ściśle związana z sygnalizacją purinergiczną. Stymulacja receptora P2Y 6 przez UDP indukuje fagocytozę [14,15], aktywując białko Rac, które fosforyluje białko VASP (ang. vasodilator-stimulated phosphoprotein), biorące udział w wydłużaniu filamentów aktynowych, zlokalizowane w filopodiach oraz lamellipodiach migrujących komórek [16]. ATP i ADP, agoniści receptora P2Y 12, także za pośrednictwem szlaku związanego z małym białkiem G, indukują zjawisko zwane falowaniem błony i migrację mikrogleju w kierunku uszkodzonych neuronów [17]. W ludzkich hepatocytach receptor P2Y 13 stymuluje endocytozę, aktywując ścieżkę sygnałową RhoA/kinaza zależna od Rho (ROCK) [18]. Stymulacja receptorów P2Y oraz receptorów jonotropowych P2X w systemie naczyń wieńcowych może powodować ich rozszerzanie, zaciskanie czy też proliferację mięśni gładkich ściany naczynia. Zjawiska te związane są z reorganizacją cytoszkieletu aktynowego zależną od aktywacji białka RhoA przez następujące podtypy receptorów nukleotydowych P2Y 1, P2Y 2, P2Y 4 i P2Y 6 [19]. Z kolei aktywacja receptora P2Y 2 kompensuje blokadę szlaku sygnałowego RhoA/ROCK w komórkach glejaka C6, które od lat stanowią doświadczalny model do badań astrocytów oraz komórek neoplastycznych [20,21]. Uruchamiane przez UTP szlaki sygnałowe powodują reorganizację cytoszkieletu aktynowego i zmiany w morfologii prowadzące do odzyskania przez badane komórki fenotypu kontrolnego oraz zdolności do migracji [21,22]. Opisane przykłady reakcji komórek na zewnątrzkomórkowe nukleotydy dotyczą wybranych zjawisk zależnych od reorganizacji cytoszkieletu aktynowego regulowanej przez białka Rho. Są to reakcje zależne od szybkich procesów, takich jak formowanie bądź zanik włókien naprężeniowych, polimeryzacja i depolimeryzacja aktyny, relaksacja sieci aktomiozynowej bądź jej skurcz. Precyzyjna kontrola tych procesów umożliwia komórkom adhezję, polaryzację, migrację, prawidłowy przebieg endocytozy czy cytokinezy. Indukowana nukleotydami aktywacja małych białek G, odpowiedzialna jest również za reakcje długotrwałe, np. proliferację. Stymulowana P2Y 12 proliferacja komórek glejaka C6 wymaga zależnej od białka RhoA aktywacji ERK oraz ROCK [23]. Wiele receptorów P2Y aktywuje białko RhoA, jednak szlaki sygnałowe indukowane przez to białko oraz fizjologiczne konsekwencje ich uruchamiania determinowane są przez mechanizmy zależne od typu komórki. Receptory nukleotydowe P2Y kontrolują aktywność białek wiążących aktynę także za pośrednictwem reakcji wapniowej oraz fosfolipidów. Strukturalna różnorodność domen w części wewnątrzkomórkowej umożliwia bowiem oddziaływanie poszczególnych podtypów receptorów z różnymi białkami G [24]. Dodatkowo receptory P2Y mogą pośredniczyć w aktywacji białek Rho modulując działanie receptorów o aktywności kinaz tyrozynowych. Na przykład, stymulacja UTP aktywuje kinazę Src, czego efektem jest utworzenie kompleksu receptorów dla EGF (ang. epidermal growth factor) i P2Y 2. To oddziaływanie receptorów umożliwia fosforylację EGFR przez Src [25]. Receptor P2Y 2 (P2Y 2 R) jest jednym z receptorów nukleotydowych, który w różnych typach komórek reguluje, za pośrednictwem szlaków sygnałowych związanych z białkami Rho, procesy odpowiedzialne za migrację komórek: polaryzację, formowanie i wysuwanie struktur lokomotorycznych: filopodiów, lamellipodiów, adhezję oraz kurczliwość umożliwiającą komórce przemieszczenie się w kierunku migracji. Inicjowana przez ten receptor sygnalizacja będzie w niniejszym artykule stanowiła przykład odpowiedzi komórki na bodziec z udziałem białek z rodziny Rho. ROLA RECEPTORA P2Y 2 W AKTYWACJI BIAŁEK Rho Dynamiczna reorganizacja filamentów aktynowych: polimeryzacja i depolimeryzacja, formowanie i degradacja sieci oraz wiązek filamentów regulowana jest przez kaskady sygnałowe, w których istotną rolę odgrywają białka Rho: RhoA, Rac1 i Cdc42 [26,27] oraz fosfoinozytole, przede wszystkim PIP 2, który wiąże się bezpośrednio z różnymi białkami regulującymi aktynę (m.in. profiliną, kofiliną, α-aktyniną, winkuliną, spektryną) i moduluje ich funkcje [28,29]. Oznacza to, że zmiany poziomu PIP 2 wpływają na organizację cytoszkieletu aktynowego. P2Y 2 R poprzez aktywację podjednostek α białek G q, G o, G 12 kontroluje procesy zależne od dynamiki cytoszkieletu aktynowego jak: endo- i egzocytozę, cytokinezę, transport wewnątrzkomórkowy, adhezję i migrację [30]. Łączenie się receptora P2Y 2 z poszczególnymi rodzajami białka G zależy od typu komórek, jak również od aktualnej aktywności innych ścieżek sygnałowych. Związany z G q receptor aktywuje fosfolipazę C (PLC), która hydrolizuje PIP 2 do inozytolo-1,4,5-trisfosforanu (IP 3 ) i diacyloglicerolu (DAG). Powstają dwa wtórne przekaźniki sygnału, z których pierwszy generuje reakcję wapniową, uwalniając Ca 2+ z siateczki endoplazmatycznej, a drugi (DAG) aktywuje białkową kinazę C (PKC). Połączenie receptora P2Y 2 z białkami G o lub G 12 powoduje aktywację szlaków sygnałowych związanych z białkami z rodziny Rho, odpowiednio: ścieżki Rac1/PAK oraz RhoA/ROCK [22,31]. Aby doszło do połączenia receptora P2Y 2 z białkiem G o czy białkiem G 12 i aktywacji właściwych szlaków sygnałowych, niezbędne jest oddziaływanie pomiędzy tym receptorem a integrynami. Domena odpowiedzialna za oddziaływanie receptorów z integrynami znajduje się na pierwszej zewnątrzkomórkowej pętli łańcucha białkowego receptora 448 www.postepybiochemii.pl

i posiada sekwencję arginina, glicyna, kwas asparaginowy (domena RGD) [32,33]. Domena ta umożliwia selektywne wiązanie przez receptor integryn α v β 5 lub α v β 3 [34]. Oddziaływanie receptora z integrynami α v β 3 jest wymagane dla aktywacji białka Rac1 za pośrednictwem białka G o [35], natomiast związanie integryn α v β 5 jest niezbędne dla połączenia P2Y 2 R z heterotrimerycznym białkiem G 12 i aktywacji białka RhoA [30]. Wykazano, że aktywacja receptora P2Y 2 z udziałem integryn jest konieczna dla migracji komórek, a synteza integryn α v wymagana jest dla indukcji migracji, za pośrednictwem P2Y 2 R w wielu typach komórek [35,36]. Białka Rho to małe białka G, które poprzez regulację organizacji cytoszkieletu aktynowego i aktywności miozyn, kontrolują morfologię komórek i ważne dla ich życia zjawiska jak migracja, podział komórki czy ekspresja genów [37-40]. Kluczową rolę białek Rho w kontroli dynamiki cytoszkieletu aktynowego obserwowano w wielu typach komórek: fibroblastach, makrofagach, komórkach epitelialnych, komórkach śródbłonka, astrocytach, neuronach, komórkach nowotworowych, a także limfocytach, komórkach tucznych oraz płytkach krwi [41-44]. Kontrola migracji i morfologii astrocytów ma istotne znaczenie dla interakcji tych komórek z neuronami [45,46]. Białka Rho wpływają na organizację cytoszkieletu aktynowego za pośrednictwem efektorów, których substratami są białka wiążące aktynę. Biorą udział w regulacji organizacji cytoszkieletu aktynowego również pośrednio, stymulując syntezę PIP 2. Kinaza fosforylująca fosfatydyloinozytolo-4-fosforan (PIP) jest aktywowana bezpośrednio przez wiązanie się z aktywną postacią białka Rho (Rho-GTP) [33]. Białka Rho, podobnie jak heterotrimeryczne białka G, są aktywowane przez związanie z GTP, przy czym kontrola ich aktywności wymaga udziału dodatkowych białek regulujących. Pomocnicze białka GEF (ang. guanine nucleotide exchange factors), aktywowane przez receptory stymulują wymianę GDP na GTP aktywując białka Rho. GEF zawierają dwie charakterystyczne domeny: DH (ang. 1-Db1 homology), odpowiedzialną za wymianę nukleotydów oraz domenę PH (ang. pleckstrin homology), dzięki której mogą się wiązać z fosfolipidami błony cytoplazmatycznej [47]. Aktywność Rac podczas wysuwania lamellipodium regulowana jest także przez fosforany fosfatydyloinozytolu, które wiążą i aktywują czynnik regulujący GEFs [48]. Białka regulatorowe GEF odpowiedzialne są za swoistość szlaków sygnałowych związanych z małymi białkami G, wyznaczając ścieżkę przekazywania informacji [47]. Wymiana GDP na GTP umożliwia białkom Rho oddziaływanie i aktywację ich efektorów, a tym samym transmisję sygnału [46]. Białka GAP (ang. GTPase-activating proteins) natomiast aktywują hydrolizę GTP do GDP, a więc przyśpieszają przejście białek Rho w stan nieaktywny. Z kolei białka GDI (ang. guanine nucleotide dissociation inhibitors) mogą tworzyć duże kompleksy z białkami Rho i zapobiegać ich dyfuzji w cytoplazmie, co pozwala na ich przestrzenną kontrolę i właściwą dystrybucję w komórce [3,48-50]. Aktywacja białek Rho zależy od czasowo-przestrzennej regulacji obecności białek RhoGEF i RhoGAP, więc lokalny poziom aktywności białek Rho jest wynikiem równowagi pomiędzy ilością ich regulatorów. Aktywność białek Rho kontrolowana jest przez wiele receptorów, które regulują aktywność białek pomocniczych. Są wśród nich receptory o aktywności kinaz tyrozynowych oraz receptory związane z heterotrimerycznymi białkami G (GPCRs, ang. G-protein coupled receptors), przede wszystkim receptory nukleotydowe, które indukują szlaki sygnałowe za pośrednictwem białek G 12, G o oraz G q. Aktywacja białka Rac zarówno przez kinazy tyrozynowe jaki i receptory nukleotydowe zależna jest od aktywności fosfatydyloinozytolo 3-kinazy (PI3K) [51]. SZLAKI SYGNAŁOWE ZWIĄZANE Z BIAŁKAMI Rho REGULACJA DYNAMIKI CYTOSZKIELETU AKTYNOWEGO Jednymi z najlepiej poznanych u ssaków przedstawicieli rodziny białek Rho są białka: RhoA, Rac1 i Cdc42, po raz pierwszy opisane pod koniec ubiegłego wieku [51]. W komórkach migrujących kontrolują one polaryzację, wysuwanie strefy frontalnej, adhezję oraz obkurczanie i wycofywanie strefy tylnej [2,3,52]. W neuronach białka te regulują polaryzację, wzrost i regenerację aksonu, wzrost dendrytów i formowanie kolców dendrytycznych [53-55]. Efektorami białek Rho w szlakach sygnałowych kontrolujących organizację aktomiozynowego czytoszkieletu są kinazy białkowe, aktywatory kompleksu Arp2/3, a także bezpośrednio niektóre białka wiążące aktynę, na przykład lekkie łańcuchy miozyny II, czy też białka z rodziny ERM (ang. ezrin-radixin- -moesin), stabilizujące filamenty aktynowe [56,52]. Oddziaływanie białek ERM z transbłonowymi białkami CD44 i filamentami aktynowymi jest regulowane przez Rho [57-60]. ŚCIEŻKI SYGNAŁOWE INDUKOWANE PRZEZ BIAŁKO RhoA Wśród efektorów białka RhoA pośredniczących w przekazywaniu sygnałów regulujących dynamikę aktomiozynowego cytoszkieletu jest rodzina kinaz serynowo-treoninowych (ROCKs) [3,61]. Za pośrednictwem tych kinaz RhoA kontroluje zarówno aktywność białek regulujących polimeryzację aktyny m. in. kofiliny czy forminy mdia, jak też ATPazową aktywność miozyny II, wpływając na kurczliwość sieci aktynowej [56,50]. Izoformy kinazy zależnej od Rho wykazują specyficzność tkankową: ROCK1, występująca głównie w komórkach wątroby, płuc i jąder oraz ROCK2, której wyższy poziom obserwuje się w komórkach tkanki nerwowej i mięśniowej [62]. Kinazy zależne od Rho fosforylują liczne substraty, wśród których są lekkie łańcuchy miozyny II (MLC), wiążąca miozynę podjednostka fosfatazy lekkich łańcuchów miozyny (MLCP) oraz kinaza LIM (LIMK) fosforylująca kofilinę. W procesie regulacji aktywności kofiliny przez białko RhoA biorą udział dwie kinazy LIM1 i LIM2 [63,64] oraz kinazy TES1 i TES2 [65], które aktywowane przez ROCK fosforylują kofilinę w pozycji seryny 3, inaktywując białko [66,67]. Fosforylacja hamuje zdolność kofiliny do wiązania F-aktyny i w konsekwencji cięcia oraz depolimeryzacji filamentów aktynowych [68,69]. Za defosforylację kofiliny Postępy Biochemii 60 (4) 2014 449

odpowiadają fosfatazy SSH (ang. slingshot) [70,71] oraz CIN (ang. chronophin) [72]. W zależności od miejsca przyłączenia kofiliny, następuje odłączanie monomerów aktyny od końca minus filamentu lub jego cięcie na mniejsze fragmenty [69]. Aktywacja kofiliny promuje polimeryzację aktyny [69,73,74]. Aktywność depolimeryzacyjna kofiliny zapewnia pulę monomerów aktynowych dostępnych dla polimeryzacji [75]. Cięcie filamentów aktynowych powoduje natomiast wzrost liczby miejsc wiązania monomerów aktynowych. Badania pokazują, że przy takich nowo powstałych końcach plus przyłącza się też częściej kompleks białek Arp2/3 odpowiedzialny za tworzenie rozgałęzień filamentów [76]. W ten sposób kofilina inicjuje powstawanie sieci aktynowej tworzącej lamellipodium na froncie komórki oraz przyśpiesza jej reorganizację podczas wysuwania strefy frontalnej [77]. Z kolei hamowanie aktywności tego białka w tylnej części komórki sprzyja stabilizacji filamentów aktynowych tworzących włókna naprężeniowe [78]. Przestrzenna regulacja obu tych procesów umożliwia uzyskanie polaryzacji, przez rozpoczynającą migrację komórkę. Zahamowanie aktywności kofiliny w nowotworowych komórkach raka tarczycy [79], jak i w komórkach prawidłowych (fibroblasty) [80] powoduje stabilizację filamentów aktynowych w lamellipodium, a co za tym idzie zmniejszenie prędkości migracji i mniejszą wrażliwość komórek na czynniki chemotaktyczne (udział receptorów nukleotydowych w chemotaksji został opisany w rozdziale Receptory nukleotydowe a ruch komórki ). Znaczący wpływ kofiliny na zmiany kierunku ruchu komórek podczas chemotaksji potwierdzają również badania zespołu Ghosha [81]. Wprowadzali oni do nowotworowych komórek z linii MTLn3 (komórki raka piersi) zmodyfikowaną, fotoaktywowaną kofilinę. Jej lokalna aktywacja, za pomocą silnego impulsu światła UV, powodowała w danym miejscu przyśpieszoną polimeryzację aktyny i tworzenie lamellipodium nadającego nowy kierunek ruchu migrującej komórce [81]. Doświadczenia te pokazują nie tylko istotną rolę kofiliny w przebiegu migracji kierunkowej, ale również wskazują na konieczność precyzyjnej czasowo- -przestrzennej regulacji tego białka, określanego jako kierownica komórki [69]. Za pośrednictwem forminy mdia1 białko RhoA kontroluje dynamikę zarówno mikrofilamentów jak i mikrotubul. mdia1 indukuje polimeryzację aktyny na obrzeżach komórki w sposób niezależny od kompleksu Arp2/3, powodując powstawanie długich, nierozgałęzionych filamentów [82]. Z kolei przyłączając się do mikrotubuli, formina ta spowalnia wymianę podjednostek tubuliny na ich końcach plus [83]. Przyśpieszając powstawanie mikrofilamentów i stabilizując mikrotubule mdia1 może odgrywać ważną rolę w migracji komórek [84]. W komórkach migrujących szlaki sygnałowe związane z opisanymi efektorami białka RhoA są regulowane przestrzennie. Aktywna formina mdia1 zlokalizowana jest głównie na obrzeżach komórek, natomiast ROCK działa w środkowej i tylnej strefie komórek [61]. RhoA pełni ważną rolę w generowaniu zależnej od miozyny siły kurczliwej niezbędnej dla organizacji włókien naprężeniowych [85], kontaktów adhezyjnych [86], jak również wycofywania strefy tylnej komórki podczas migracji [44]. Szlak sygnałowy RhoA/ROCK reguluje kurczliwość systemu aktomiozynowego poprzez fosforylację reszt treoniny w pozycji 853 (Thr853) i 696 (Thr696) i hamowanie wiążącej miozynę podjednostki fosfatazy lekkich łańcuchów miozyny (MLCP) [87-90]. ATPazowa aktywność miozyny II wzrasta również w wyniku bezpośredniej fosforylacji reszty seryny 19 MLC przez ROCK [62,91-93]. Inaktywacja miozyny II może zachodzić w wyniku jej defosforylacji przez fosfatazę MLC, stąd wzrost aktywności miozyny II w komórce można uzyskać poprzez hamowanie działania tej fosfatazy, za co odpowiada ROCK, a także białkowa kinaza C (PKC) aktywowana przez diacyloglicerol (DAG) [4]. Badacze oceniają, że blokada fosfatazy MLC ma duże znaczenie w utrzymaniu aktywności miozyny II i podtrzymaniu skurczu włókien naprężeniowych w komórkach niemięśniowych in vivo. Takie oddziaływanie miozyny II z aktyną umożliwia skurcz, zarówno izotoniczny (zmiany kształtu komórki, skurcz w obrębie tylnej strefy komórki i przesuwanie jej w kierunku migracji), jak i izometryczny, który odpowiedzialny jest m.in. za formowanie włókien naprężeniowych [94]. Formowanie włókien naprężeniowych wymaga także polimeryzacji aktyny i stabilizacji filamentów. Każdy z tych procesów jest także kontrolowany przez białko RhoA. Polimeryzacja aktyny indukowana jest przez efektor mdia1 [95]. Stabilizację filamentów zapewnia natomiast zahamowana w środkowej i tylnej strefie komórki depolimeryzacja F-aktyny na skutek inaktywacji kofiliny przez aktywną ROCK (Ryc. 1). Działanie ścieżki sygnałowej RhoA/ROCK jest niezależne od reakcji wapniowej [89]. Stymulacja receptorów nukleotydowych indukuje nie tylko szlaki sygnałowe związane z białkami z rodziny Rho, ale także za pośrednictwem białka G q mobilizację wewnątrzkomórkowego wapnia, który aktywuje zależną od kalmoduliny kinazę lekkich łańcuchów miozyny (MLCK). Fosforyluje ona lekkie łańcuchy miozyny w pozycjach reszt seryny 19 oraz treoniny 18 [97,98]. MLCK jest odpowiedzialna za regulację fosforylacji MLC w obszarach peryferycznych komórki [98] Obie kinazy pełnią ważną rolę w przestrzennej regulacji aktywności miozyny II. Rycina 1. Schemat szlaków sygnałowych indukowanych przez receptor P2Y 2, regulujących cytoszkielet aktynowy za pośrednictwem białek Rho. 450 www.postepybiochemii.pl

RhoA-GTP poza kontrolą migracji i endocytozy bierze udział również w regulacji mitozy. Zaokrąglanie się komórek podczas mitozy jest wynikiem reorganizacji cytoszkieletu aktynowego. Zmiany te w wielu typach komórek wymagają aktywacji białek RhoA i Rac1 [99,100]. Kończąca mitozę cytokineza w komórkach zwierzęcych zachodzi dzięki formowaniu pierścienia kurczliwego i bruzdy podziałowej przez aktomiozynowy system. Proces ten wymaga aktywacji RhoA i jego dwóch efektorów, ROCK i kinazy citron [101-104]. Obie kinazy akumulują się w bruździe podziałowej różnych komórek ssaków [105,106]. Rolę wymienionych ścieżek sygnałowych w komórkach zarówno prawidłowych jak i transformowanych, bada się za pomocą inhibitorów białka RhoA (transferaza C3 z bakterii Clostridium botulinum powodująca ADP-rybozylację białka) oraz kinazy zależnej od Rho (np. inhibitor Y-27632, blokujący obie izoformy ROCK w miejscu wiązania ATP), bądź też transfekując komórki za pomocą cdna kodującym aktywne lub nieaktywne formy tych białek. Redukcja aktywności białka RhoA albo zależnej od niego kinazy zaburza morfologię, ruchliwość, a także inwazyjność wszystkich typów komórek badanych do tej pory. Oznacza to, że białko RhoA jest jednym z kluczowych pośredników uczestniczących w reorganizacji cytoszkieletu aktynowego w komórkach eukariotycznych. UDZIAŁ Rac1 I Cdc42 W REORGANIZACJI CYTOSZKIELETU AKTYNOWEGO Ścieżki przekazywania sygnału dla reorganizacji cytoszkieletu aktynowego w strefie frontu migrującej komórki wymagają aktywacji białka Rac1 i Cdc42. Białko Rac1 może podobnie jak RhoA, kontrolować aktywność kluczowego białka dla polimeryzacji aktyny, kofiliny [66,67,75,107,108]. Kaskada sygnałowa prowadząca do inaktywacji kofiliny to: receptor, np. P2Y 2, specyficzne białko pomocnicze GEF, Rac1, kinaza PAK (ang. p21-activated kinase) i kinaza LIM [109]. Aktywna forma białka Rac1 (Rac- -GTP) może również aktywować PIP5-kinazę (kinaza 5 fosfatydyloinozytolo-4-fosforanu) odpowiedzialną za syntezę PIP 2 [110], który wiążąc kofilinę także blokuje jej aktywność [111]. Ścieżka sygnałowa Rac1/PAK wpływa również na aktywność miozyny II, odwrotnie jednak niż szlak związany z białkiem RhoA. Kinaza PAK może fosforylować kinazę MLC i hamować jej aktywność, co przekłada się na zmniejszenie aktywności miozyny II. Poprzez aktywację kinazy PAK, Rac może regulować także fosforylację ciężkich łańcuchów miozyny (MHC) [112]. Białko Rac indukuje również, zależną od kompleksu Arp2/3 polimeryzację aktyny w lamellipodium. Pośredniczy w tej kaskadzie sygnałowej białko z rodziny WAVE [113]. Aktywny Rac oddziałuje z białkiem p53, substratem tyrozynowej kinazy receptora insulinowego (IRSp53) [114], który z kolei wiąże i aktywuje białko WAVE. Wiąże ono i aktywuje kompleks Arp2/3, tworzący wraz z innymi białkami kompleks promujący nukleację aktyny [115,116]. W komórkach spolaryzowanych obecność białka Rac ograniczona jest do strefy frontalnej. Badania z zastosowaniem techniki FRET (ang. fluorescence resonance energy transfer) wykazały, że poziom aktywnych cząsteczek białka Rac jest najwyższy w przedniej krawędzi migrującej komórki [117]. Szlaki sygnałowe zależne od białka Rac1 właśnie w tym rejonie zmniejszają aktywność kurczliwą cytoszkieletu oraz kontrolują wiązanie aktyny z kofiliną. Efektem jest tworzenie lamellipodium i kierunkowa progresja frontu komórki [31,118,119]. Wyjątkową formą kierunkowej migracji komórkowej jest również migracja aksonu w rozwijających się komórkach nerwowych; choć ciało takiej komórki pozostaje w tym samym miejscu, koniec jej aksonu aktywnie przemieszcza się, kierowany sygnałami oddziałującymi na niego w przestrzeni międzykomórkowej [67]. O ile jednak aktywacja białek Cdc42 oraz Rac promuje migrację stożka wzrostu aksonu, o tyle aktywne białko RhoA hamuje ten wzrost [120]. Podobny antagonizm występuje podczas tworzenia kolców dendrytycznych na wypustkach komórek nerwowych; aktywacja Rac indukuje ten proces, a białko Rho hamuje [121]. W obu tych procesach kluczową rolę odgrywa polimeryzacja filamentów aktynowych w strefie przybłonowej komórki, co prowadzi do uformowania się lamellipodium i powstawania filopodiów na krawędzi wiodącej. Badania prowadzone przez Luo dowiodły, że aktywacja białek Rac i Cdc42 promuje powstawanie takich struktur w komórkach neuroblastoma [120]. Polimeryzacja i depolimeryzacja włókien aktyny w strefie podbłonowej komórki może także być wykorzystywana do tworzenia lokalnych zmian w strukturze błony komórkowej, niezbędnych w procesach pinocytozy i fagocytozy (regulacja tych zjawisk została opisana w rozdziale Receptory nukleotydowe a ruch komórki w tym zeszycie). Tą ostatnią regulują dwie odrębne ścieżki sygnałowe. Jeśli fagocytoza jest wywołana przez stymulację receptorów immunoglobulinowych, aktywowane są białka Cdc42 i Rac, z kolei fagocytoza indukowana przez receptory układu dopełniacza wymaga aktywacji białka Rho [122]. SZLAKI SYGNAŁOWE ZWIĄZANE Z PIP 2 I REAKCJĄ WAPNIOWĄ Fosfatydyloinozytole, do których należy PIP 2 (fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan), stanowią około 10% wszystkich lipidów budujących błonę komórkową i pełnią głównie funkcje regulatorowe w komórce [123]. PIP 2 powstaje przez fosforylację monofosforanu fosfatydyloinozytolu przez PIP5- -kinazę, a proces ten może być kontrolowany przez białko Rac [111]. Fosfolipid ten z kolei reguluje dynamikę cytoszkieletu aktynowego na kilka sposobów, przy czym zwykle jego wysokie stężenie wspomaga polimeryzację filamentów aktynowych, podczas gdy niskie stężenie hamuje rozbudowę filamentów i przyśpiesza ich rozpad [124]. Wiąże on niefosforylowaną kofilinę blokując depolimeryzację mikrofilamentów [125]. Jednocześnie PIP 2 hamuje działanie profiliny, sekwestrującej G aktynę oraz aktywność białka CapZ, zakrywającego końce filamentów aktynowych. W ten sposób uwolnione zostają związane z profiliną monomery aktynowe, które mogą być dołączane do odblokowanych końców plus mikrofilamentów [123]. Związanie PIP 2 z α-aktyniną powoduje wzrost aktywności tego białka łączącego filamenty w wiązki [126]. Fosfolipid ten uczestniczy więc także w budowie stabilnej sieci cytoszkieletu aktynowego pod błoną komórkową. Rozpad PIP 2 w wybranych obszarach komórki uwalnia związane przez niego białka i prowadzi do lokalnej Postępy Biochemii 60 (4) 2014 451

Rycina 2. Regulacja cytoszkieletu aktynowego za pośrednictwem PIP 2 i reakcji wapniowej reorganizacji cytoszkieletu aktynowego niezbędnej np. podczas kierunkowej migracji [69]. Hydrolizę PIP 2 przeprowadza fosfolipaza C (PLC), która może być aktywowana przez stymulację receptora P2Y 2 związanego z heterotrimerycznym białkiem G q [127]. Produktami tego rozpadu są dwie wtórne cząsteczki sygnałowe: DAG oraz IP 3. DAG pozostaje przy błonie komórkowej i aktywuje białkową kinazę C. IP 3 dyfunduje natomiast do cytoplazmy, gdzie łącząc się z receptorami IP 3 na błonie siateczki śródplazmatycznej otwiera kanał wapniowy i powoduje wypływ jonów Ca 2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów do cytoplazmy. W komórkach niepobudliwych, wypływ wapnia z wewnątrzkomórkowych magazynów prowadzi do aktywacji niezależnych od napięcia wapniowych kanałów SOCs (ang. store-operated channels) w błonie komórkowej, które są odpowiedzialne za drugi etap odpowiedzi wapniowej, pojemnościowy napływ jonów Ca 2+ z przestrzeni pozakomórkowej (SOCE, ang. store- -operated calcium entry) [128]. Jony wapnia w cytoplazmie są wiązane przez kalmodulinę (CaM), która w tej postaci może aktywować wiele enzymów w komórce, w tym kinazę MLC fosforylującą miozynę II [96]. W ten sposób sygnalizacja wapniowa może prowadzić do skurczu układu aktomiozynowego w komórkach niemięśniowych (Ryc. 2). W wyniku rozpadu PIP 2 uwolnione zostają cząsteczki kofiliny. Jest to jeden z mechanizmów kontroli aktywności tego białka w komórce. Pozostałe to fosforylacja i defosforylacja, regulowane przez białka RhoA i Rac1 oraz oddziaływanie z innymi białkami [67,125]. Defosforylowana (aktywna) kofilina może albo przyłączyć się do aktyny, albo zostać związana przy błonie komórkowej przez PIP 2, co ponownie uniemożliwia jej oddziaływanie z filamentami aktyny [129]. Stymulacja receptora P2Y 2 prowadzi więc do lokalnej aktywacji kofiliny umożliwiając miejscową przebudowę filamentów aktynowych i tworzenie nowych wypustek nadających kierunek migracji [69]. PODSUMOWANIE Aktywacja heterotrimerycznych białek G q, G o, G 12 uruchamia liczne szlaki przekazywania sygnałów, które regulują procesy odpowiedzialne za organizację i dezorganizację sieci aktynowej, skurcz i relaksację systemu aktomiozynowego. Receptory nukleotydowe związane z tymi białkami kontrolują więc wszystkie zjawiska związane z ruchliwością komórek. Wykazano także, że stymulacja receptora P2Y 2 w komórkach glejaka C6 kompensuje zmiany w organizacji cytoszkieletu aktynowego, kształcie komórki i parametrach migracji wywołane blokadą jednej ze ścieżek sygnałowych, RhoA/ROCK na poziomie kinazy Rho. Powrót komórek do stanu obserwowanego w grupie kontrolnej wymaga aktywacji ścieżek sygnałowych za pośrednictwem heterotrimerycznych białek G q i G o [21,22]. Indukcja tych ścieżek stymuluje kinazę MLC, fosfatazę PLC (hydrolizę PIP 2 ) oraz białko Rac1. W konsekwencji wzrasta aktywność miozyny II i zmienia się poziom aktywności kofiliny. Zapewnienie równowagi pomiędzy ilością fosforylowanej i niefosforylowanej kofiliny, a także aktywacja miozyny II wydają się w komórkach glejaka C6 niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania cytoszkieletu aktynowego. Warunki te nie są spełnione w sytuacji, gdy zaburzona jest adhezja komórek glejaka C6. Oddziaływanie z integrynami niezbędne jest bowiem dla aktywacji podjednostek α białek G o oraz G 12. To ostatnie aktywuje RhoA i uruchamia szlak dla polimeryzacji aktyny za pośrednictwem forminy mdia. Reorganizacja aktyny, którą stymulują te dwie alternatywne ścieżki zmienia morfologię komórek, przestrzenny rozkład miejsc adhezji, umożliwia migrację. Alternatywne szlaki sygnałowe mogące kompensować niekorzystne zmiany z jednej strony umożliwiają komórkom przetrwanie w niesprzyjających warunkach, z drugiej mogą stanowić problem podczas terapii, której celem jest blokada konkretnej ścieżki sygnałowej albo jednej z molekuł pośredniczących w transdukcji sygnału. PIŚMIENNICTWO 1. Schwartz M (2004) Rho signalling at a glance. J Cell Sci 117: 5457-5458 2. Ridley AJ (2001) Rho GTPases and cell migration. J Cell Sci 114: 2713-2722 3. Schmitz AA, Govek EE, Bottner B, Van Aelst L (2000) Rho GTPases: signaling, migration, and invasion. Exp Cell Res 261: 1-12 4. Somlyo AP, Somlyo AV (2000) Signal transduction by G-proteins, rho-kinase and protein phosphatase to smooth muscle and non-muscle myosin II. J Physiol 522: 177-185 5. Kolen KV, Slegers H (2006) Integration of P2Y receptor-activated signal transduction pathways in G protein-dependent signaling network. Purin Signal 2: 451-469 6. Winder SJ, Ayscough KR (2005) Actin-binding proteins. J Cell Sci 118: 651-654 7. dos Remedios CG, Chhabra D, Kekic M, Dedova IV, Tsubakihara M, Berry DA, Nosworthy NJ (2003) Actin binding proteins: regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiol Rev 83: 433-473 8. McGough A (1998) F-actin-binding proteins. Curr Opin Struct Biol 8: 166-176 9. Verkhratsky A, Krishtal OA, Burnstock G (2009) Purinoceptors on neuroglia. Mol Neurobiol 39: 190-208 10. Zimmermann H (2006) Nucleotide signaling in nervous system development. Pflugers Arch 452: 573-588 11. Burnstock G, Knight GE (2004) Cellular distribution and functions of P2 receptor subtypes in different systems. Int Rev Cytol 240: 31-304 12. Bezzi P, Volterra A (2001) A neuron-glia signalling network in the active brain. Curr Opin Neurobiol 11: 387-394 452 www.postepybiochemii.pl

13. Peterson TS, Camden JM, Wang Y, Seye CI, Wood WG, Sun GY, Erb L, Petris MJ, Weisman GA (2010) P2Y 2 nucleotide receptor-mediated responses in brain cells. Mol Neurobiol 41: 356-366 14. Koizumi S, Shigemoto-Mogami Y, Nasu-Tada K, Shinozaki Y, Ohsawa K, Tsuda M, Joshi BV, Jacobson KA, Kohsaka S, Inoue K (2007) UDP acting at P2Y 6 receptors is a mediator of microglial phagocytosis. Nature 446: 1091-1095 15. Kataoka A, Koga Y, Uesugi A, Tozaki-Saitoh H, Tsuda M, Inoue K (2011) Involvement of vasodilator-stimulated phosphoprotein in UDP-induced microglial actin aggregation via PKC- and Rho-dependent pathways. Purinergic Signal 7: 403-411 16. Bear JE, Gertler FB (2009) Ena/VASP: towards resolving a pointed controversy at the barbed end. J Cell Sci 122: 1947-1953 17. Honda S, Sasaki Y, Ohsawa K, Imai Y, Nakamura Y, Inoue K, Kohsaka S (2001) Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through G i/o -coupled P2Y receptors. J Neurosci 21: 1975-1982 18. Malaval C, Laffargue M, Barbaras R, Rolland C, Peres Ch, Champagne E, Perret B, Terce F, Collet X, Martinez LO (2009) RhoA/ROCK I signaling downstream of the P2Y 13 ADP-receptor controls HDL endocytosis in human hepatocytes. Cell Signal 21: 120-127 19. Sauzeau V, Le Jeune H, Cario-Toumaniantz Ch, Vaillant N, Gadeau A-P, Desgranges C, Scalbert E, Chardin P, Pacaud P, Loirand G (2000) P2Y 1, P2Y 2, P2Y 4, and P2Y 6 receptors are coupled to Rho and Rho kinase activation in vascular myocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol 278: H1751-H1761 20. Wypych D, Barańska J (2013) Cross-talk in nucleotide signaling in glioma C6 cells. Adv Exp Med Biol 986: 31-59 21. Korczyński J, Sobierajska K, Krzemiński P, Wasik A, Wypych D, Pomorski P, Kłopocka W (2011) Is the MLC phosphorylation essential for the recovery from ROCK inhibition in glioma C6 cells? Acta Biochim Polon 58: 125-130 22. Kłopocka W, Korczyński J, Pomorski P (2013) Cytoskeleton and nucleotide signaling in glioma C6 cells. Adv Exp Med Biol 986: 103-119 23. Grobben B, De Deyn PP, Slegers H (2002) Rat C6 glioma as experimental model system for the study of glioblastoma growth and invasion. Cell Tissue Res 310: 257-270 24. Ralevic V, Burnstock G (1998) Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol Rev 50: 413-492 25. Liu J, Liao Z, Camden J, Griffin KD, Garrad RC, Santiago-Pérez LI, Gonzáles FA, Seye CI, Weisman GA, Erb L (2004) Src homology 3 binding sites in the P2Y 2 nucleotide receptor interact with Src and regulate activities of Src, proline-rich tyrosine kinase 2, and growth factor receptors. J Biol Chem 279: 8212-8218 26. Bishop AL, Hall A (2000) Rho GTPases and their effector proteins. Biochem J 348: 241-255 27. Hall A (1998) Rho GTPases and the actin cytoskeleton. Science 279: 509-514 28. Sechi AS, Wehland J (2000) The actin cytoskeleton and plasma membrane connection: PtdIns(4,5)P 2 influences cytoskeletal protein activity at the plasma membrane. J Cell Sci 113: 3685-3695 29. Takenawa T, Itoh T (2001) Phosphoinositides, key molecules for regulation of actin cytoskeletal organization and membrane traffic from the plasma membrane. Biochim Biophys Acta 1533: 190-206 30. Liao Z, Seye CI, Weisman GA, Erb L (2007) The P2Y 2 nucleotide receptor requires interaction with αv integrins to access and activate G 12. J Cell Sci 120: 1654-1662 31. Burridge K, Wennerberg K (2004) Rho and Rac take center stage. Cell 116: 167-179 32. Lustig KD, Weisman GA, Turner JT, Garrad R, Shiau AK, Erb L (1996) P2U purinoreceptors: cdna cloning, signal transduction mechanisms and structure-function analysis. W: Chadwick DJ, Goode JA (red) P2 purinoceptors: localization, function and transduction mechanisms. Wiley, New York, str. 193-204 33. van Rhee AM, Jacobson KA, Garrad R, Weisman GA, Erb L (1998) P2 receptor modeling and identification of ligand binding sites. W: Turner JT, Weisman GA, Fedan JS (red) P2 nucleotide receptors. Humana Press, Totowa, str. 135-166 34. Erb L, Liu J, Ockerhausen J, Kong Q, Garrad RC, Griffin K, Neal C, Krugh B, Santiago-Pérez LI, González FA, Gresham HD, Turner JT, Weisman GA (2001) An RGD sequence in the P2Y 2 receptor interacts with α v β 3 ntegrins and is required for Go-mediated signal transduction. J Cell Biol 153: 491-501 35. Bagchi S, Liao Z, Gonzales FA, Chorna NE, Seye CI, Weisman GA, Erb L (2005) The P2Y 2 nucleotide receptor interacts with alpha integrins to activate Go and induce cell migration. J Biol Chem 280: 39050-39057 36. Wang M, Kong Q, Gonzalez FA, Sun G, Erb L, Seye C, Weisman GA (2005) P2Y 2 nucleotide receptor interaction with α V integrin mediates astrocyte migration. J Neurochem 95: 630-640 37. Wennerberg K, Rossman KL, Der CJ (2005) The Ras superfamily at a glance. J Cell Sci 118: 843-846 38. Etienne-Manneville S, Hall A (2002) Rho GTPases in cell biology. Nature 420: 629-635 39. Ridley AJ (2001) Rho family proteins: coordinating cell responses. Trends Cell Biol 11: 471-477 40. Takai Y, Sasaki T, Matozaki T (2001) Small GTP-binding proteins. Physiol Rev 81: 153-208 41. Allen WE, Zicha D, Ridley AJ, Jones GE (1998) A role for Cdc42 in macrophage chemotaxis. J Cell Biol 141: 1147-1157 42. Hartwig JH, Yin HL (1988) The organization and regulation of the macrophage actin skeleton. Cell Motil Cytoskel 10: 117-126 43. Ridley AJ, Comoglio PM, Hall A (1995) Regulation of scatter factor/ hepatocyte growth factor responses by Ras, Rac, and Rho in MDCK cells. Mol Cell Biol 15: 1110-1122 44. Worthylake RA, Lemoine S, Watson JM, Burridge K (2001) RhoA is required for monocyte tail retraction during transendothelial migration. J Cell Biol 154: 147-160 45. Höltje M, Hoffmann A, Hofmann F, Mucke C, Grosse G, Van Rooijen N, Kettenmann H, Just I, Ahnert-Hilger G (2005) Role of Rho GTPase in astrocyte morphology and migratory response during in vitro wound healing. J Neurochem 95: 1237-1248 46. Chen CJ, Ou YC, Lin SY, Liao SL, Huang YS, Chiang AN (2006) L-glutamate activates RhoA GTPase leading to suppression of astrocyte stellation. Eur J Neurosci 23: 1977-1987 47. Hornstein I, Alcover A, Katzav S (2004) Vav proteins, masters of the world cytoskeleton organization. Cell Signal 16: 1-11 48. Kaibuchi K, Kuroda S, Amano M (1999) Regulation of the cytoskeleton and cell adhesion by the Rho family GTPases in mammalian cells. Annu Rev Biochem 68: 459-486 49. Hall A (1998) Rho GTPases and the actin cytoskeleton. Science 279: 509-514 50. Van Aelst L, D Souza-Schoray C (1997) Rho GTPases and signaling network. Gens Dev 11: 2295-2322 51. Ridley AJ, Hall A (1992) The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell 70: 389-399 52. Kłopocka W, Barańska J (2005) Rola białek z rodziny Rho w kontroli migracji komórek pełzających. Postepy Biochem 51: 36-43 53. Linseman DA, Loucks FA (2008) Diverse roles of Rho family GTPases in neuronal development, survival, and death. Front Biosci 13: 657-676 54. Govek EE, Newey SE, Van Aelst L (2005) The role of the Rho GTPases in neuronal development. Genes Dev 19: 1-49 55. Nikolic M (2002) The role of Rho GTPases and associated kinases in regulating neurite outgrowth. Int J Biochem Cell Biol 34: 731-745 56. Amano M, Nakayama M, Kaibuchi K (2010) Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton (Hoboken) 67: 545-554 57. Fukata Y, Kimura K, Oshiro N, Saya H, Matsumura Y, Kaibuchi K (1998) Association of the myosin-binding subunit of myosin phosphatase and moesin: dual regulation of moesin phosphorylation by Rho-associated kinase and myosin phosphatase. J Cell Biol 141: 409-418 58. Hirao M, Sato N, Kondo T, Yonemura S, Monden M, Sasaki T, Takai Y, Tsukita Sh, Tsukita Sa (1996) Regulation mechanism of ERM (ez- Postępy Biochemii 60 (4) 2014 453

rin/redixin/moesin) protein/plasma membrane association: possible involvement of phosphatidylinositol turnover and Rho-dependent signaling pathway. J Cell Biol 135: 37-51 59. Mackay DJ, Esch F, Furthmayr H, Hall A (1997) Rho- and rac-dependent assembly of focal adhesion complexes and actin filaments in permeabilized fibroblasts: an essential role for ezrin/radixin/moesin proteins. J Cell Biol 138: 927-938 60. Matsui T, Maeda M, Doi Y, Yonemura S, Amano M, Kaibuchi K, Tsukita Sa, Tsukita Sh (1998) Rho-kinase phosphorylates COOH-terminal threonines of ezrin/radixin/moesin (ERM) proteins and regulates their head-to-tail association. J Cell Biol 140: 647-657 61. Tsuji T, Ishizaki T, Okamoto M, Higashida C, Kimura K, Furuyashiki T, Arakawa Y, Birge RB, Nakamoto T, Hirai H, Narumiya S (2002) ROCK and mdia1 antagonize in Rho-dependent Rac activation in Swiss 3T3 fibroblasts. J Cell Biol 157: 819-830 62. Riento K, Ridley AJ (2003) Rocks: multifunctional kinases in cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol 4: 446-456 63. Arber S, Barbayannis FA, Hanser H, Schneider C, Stanyon CA, Bernard O, Caroni P (1998) Regulation of actin dynamics through phosphorylation of cofilin by LIM-kinase. Nature 393: 805-809 64. Bernard O (2007) Lim kinases, regulators of actin dynamics. Int J Biochem Cell Biol 39: 1071-1076 65. Toshima J, Toshima JY, Takeuchi K, Mori R, Mizuno K (2001) Cofilin phosphorylation and actin reorganization activities of testicular protein kinase 2 and its predominant expression in testicular Sertoli cells. J Biol Chem 276: 31449-31458 66. Maekawa M, Ishizaki T, Boku S, Watanabe N, Fujita A, Iwamatsu A, Obinata T, Ohashi K, Mizuno K, Narumiya S (1999) Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science 285: 895-898 67. Pak CW, Flynn KC, Bamburg JR (2008) Actin-binding proteins take the reins in growth cones. Nat Rev Neurosci 9: 136-147 68. Bamburg JR, McGough A, Ono S (1999) Putting a new twist on actin: ADF/cofilin modulate actin dynamics. Trends Cell Biol 9: 364-370 69. DesMarais V, Ghosh M, Eddy R, Condeelis J (2005) Cofilin takes the lead. J Cell Sci 118: 19-26 70. Jovceva E, Larsen MR, Waterfield MD, Baum B, Timms JF (2007) Dynamic cofilin phosphorylation in the control of lamellipodial actin homeostasis. J Cell Sci 11: 1888-1897 71. Niwa R, Nagata-Ohashi K, Takeichi M, Mizuno K, Uemura T (2002) Control of actin reorganization by slingshot, a family of phosphatases that dephosphorylate ADF/cofilin. Cell 108: 233-246 72. Gohla A, Birkenfeld J, Bokoch GM (2005) Chronophin, a novel HADtype serine protein phosphatase, regulates cofilin-dependent actin dynamics. Nat Cell Biol 7: 21-29 73. Vardouli L, Moustakas A, Stournaras C (2005) LIM-kinase 2 and cofilin phosphorylation mediate actin cytoskeleton reorganization induced by transforming growth factor-beta. J Biol Chem 280: 11448-11457 74. Southwick FS (2000) Gelsolin and ADF/cofilin enhance the actin dynamics of motile cells. Proc Natl Acad Sci USA 97: 6936-6938 75. van Rheenen J, Condeelis J, Glogauer MA (2009) A common cofilin activity cycle in invasive tumor cells and inflammatory cells. J Cell Sci 122: 305-311 76. Ichetovkin I, Grant W, Condeelis J (2002) Cofilin produces newly polymerized actin filaments that are preferred for dendritic nucleation by the Arp2/3 complex. Curr Biol 12: 79-84 77. Delorme V, Machacek M, DerMardirossian C, Anderson KL, Wittmann T, Hanein D, Waterman-Storer C, Danuser G, Bokoch GM (2007) Cofilin activity downstream of Pak1 regulates cell protrusion efficiency by organizing lamellipodium and lamella actin networks. Dev Cell 13: 646-662 78. Pritchard CA, Hayes L, Wojnowski L, Zimmer A, Marais RM, Norman JC (2004) B-Raf acts via the ROCKII/LIMK/cofilin pathway to maintain actin stress fibers in fibroblasts. Mol Cell Biol 24: 5937-5952 79. Sidani M, Wessels D, Mouneimne G, Ghosh M, Goswami S, Sarmiento C, Wang W, Kuhl S, El-Sibai M, Backer JM, Eddy R, Soll D, Condeelis J (2007) Cofilin determines the migration behavior and turning frequency of metastatic cancer cells. J Cell Biol 179: 777-791 80. Dawe HR, Minamide LS, Bamburg JR, Cramer LP (2003) ADF/cofilin controls cell polarity during fibroblast migration. Curr Biol 13: 252-257 81. Ghosh M, Song X, Mouneimne G, Sidani M, Lawrence DS, Condeelis JS (2004) Cofilin promotes actin polymerization and defines the direction of cell motility. Science 304: 743-746 82. Watanabe N, Madaule P, Reid T, Ishizaki T, Watanabe G, Kakizuka A, Saito Y, Nakao K, Jockusch BM, Narumiya S (1997) p140mdia, a mammalian homolog of Drosophila diaphanous, is a target protein for Rho small GTPase and is a ligand for profilin. EMBO J 16: 3044-3056 83. Chesarone MA, DuPage AG, Goode BL (2010) Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons. Nat Rev Mol Cell Biol 11: 62-74 84. Yamana N, Arakawa Y, Nishino T, Kurokawa K, Tanji Masahiro, Itoh RE, Monypenny J, Ishizaki T, Bito H, Nozaki K, Hashimoto N, Matsuda M, Narumiyah S (2006) The Rho-mDia1 pathway regulates cell polarity and focal adhesion turnover in migrating cells through mobilizing Apc and c-src. Mol Cell Biol 26: 6844-6858 85. Fukata Y, Amano M, Kaibuchi K (2001) Rho-Rho-kinase pathway in smooth muscle contraction and cytoskeletal reorganization of non- -muscle cells. Trends Pharmacol 22: 32-39 86. Ridley AJ, Schwartz MA, Burridge K, Firtel RA, Ginsberg MH, Borisy G, Parsons JT, Horwitz AR (2003) Cell migration: integrating signals from front to back. Science 302: 1704-1709 87. Hartshorne DL, Ito M, Erdodi F (1998) Myosin light chain phosphatase: subunit composition, interactions and regulation. J Muscle Res Cell Motil 19: 325-341 88. Kawano Y, Fukata Y, Oshiro N, Amano M, Nakamura T, Ito M, Matsumura F, Inagaki M, Kaibuchi K (1999) Phosphorylation of myosin- -binding subunit (MBS) of myosin phosphatase by Rho-kinase in vivo. J Biol Cell 147: 1023-1038 89. Kimura K, Ito M, Amano M, Chihara K, Fukata Y, Nakafuku M, Yamamori B, Feng J, Nakano T, Okawa K, Iwamatsu A, Kaibuchi K (1996) Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science 273: 245-248 90. Ramachandran C, Patil RV, Combrink K, Sharif NA, Srinivas SP (2011) Rho-Rho kinase pathway in the actomyosin contraction and cell-matrix adhesion in immortalized human trabecular meshwork. Mol Vis 17: 1877-1890 91. Amano M, Ito M, Kimura K, Fukata Y, Chihara K, Nakano T, Matsuura Y, Kaibuchi K (1996) Pohsphorylation and activation of myosin by Rho-associated kinase (Rho-kinase). J Biol Chem 271: 20246-20249 92. Matsumura F (2005) Regulation of myosin II during cytokinesis in higher eukaryotes. Trends Cell Biol 15: 371-377 93. Moussavi RS, Kelley CA, Adelstein RS (1993) Phosphorylation of vertebrate nonmuscle and smooth muscle myosin heavy chains and light chains. Mol Cell Biochem 127-128: 219-227 94. Matsumura F, Ono S, Yamakita Y, Totsukawa G, Yamashiro S (1998) Specific localization of serine 19 phosphorylated myosin II during cell locomotion and mitosis of cultured cells. J Cell Biol 140: 119-129 95. Watanabe N, Kato T, Fujita A, Ishizaki T, Narumiya S (1999) Cooperation between mdia1 and ROCK in Rho-induced actin reorganization. Nat Cell Biol 1: 136-143 96. Katoh K, Kano Y, Amano M, Onishi H, Kaibuchi K, Fujiwara K (2001) Rho-kinase-mediated contraction of isolated stress fibers. J Cell Biol 153: 569-584 97. Somlyo AP, Somlyo AV (2003) Ca 2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase. Physiol Rev 83: 1325-1358 98. Totsukawa G, Yamakita Y, Yamashiro S, Hartshorne DJ, Sasaki Y, Matsumura F (2000) Distinct roles of ROCK (Rho-kinase) and MLCK in Spatial regulation of mlc phosphorylation for assembly of stress fibers and focal adhesion in 3T3 fibroblasts. J Cell Biol 150: 797-806 99. Glotzer M (2001) Animal cell cytokinesis. Annu Rev Cell Dev Biol 17: 351-386 454 www.postepybiochemii.pl