PL 215619 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 215619 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 381888 (22) Data zgłoszenia: 02.03.2007 (51) Int.Cl. A61K 38/55 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) C12N 9/50 (2006.01) C12Q 1/37 (2006.01) (54) Zastosowanie inhibitorów cysteinowych peptydaz do oznaczania in vitro rakowych komórek wolnych i wchodzących w skład tkanek nowotworowych (73) Uprawniony z patentu: AKADEMIA MEDYCZNA IM. PIASTÓW ŚLĄSKICH WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: 15.09.2008 BUP 19/08 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.01.2014 WUP 01/14 (72) Twórca(y) wynalazku: MACIEJ SIEWIŃSKI, Wrocław, PL EUGENIUSZ CZECIOR, Zabrze, PL STANISŁAW SZYMANIEC, Wrocław, PL WOJCIECH FORTUNA, Wrocław, PL RYSZARD MIĘDZYBRODZKI, Wrocław, PL ROBERT TARNAWA, Wrocław, PL ANDRZEJ BIENIEK, Wrocław, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Rafał Witek
2 PL 215 619 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie inhibitorów cysteinowych peptydaz do oznaczania in vitro komórek wolnych lub wchodzących w skład tkanek nowotworowych, w badaniach cytologicznych i histopatologicznych. Z powodu chorób nowotworowych umiera w Polsce od 70 do 100 tysięcy chorych rocznie. Największe nadzieje w oparciu o znane sposoby leczenia wiąże się z jak najwcześniejszym w y- kryciem zmian nowotworowych. Wprowadzenie nowoczesnych, dokładnych metod diagnostyc z- nych, pozwoliłoby na wykrycie choroby we wczesnym jej stadium i umożliwiłoby wprowadzenie odpowiedniej metody terapii. Wstępem do każdego postępowania leczniczego jest zebranie, w oparciu o dostępne met o- dy diagnostyczne, jak największej ilości informacji o rozwijającej się chorobie nowotworowej. Diagnozowanie nowotworów jest zadaniem bardzo trudnym ze względu na ich duże zróżn i- cowanie. Niekiedy metody są ogólne - wspólne dla wielu typów nowotworów lub służą identyfikacji poszczególnych rodzajów raka. W przypadku diagnozowania za pomocą obrazowania guzów n o- wotworowych ważne jest jak najwyraźniejsze rozróżnienie komórek prawidłowych od nowotwor o- wych. Znane dotychczas metody diagnostyczne nie są w stanie w sposób jednoznaczny określić granicę pomiędzy nowotworem, a tkanką zdrową. Ocena rozległości nacieku w tkance zdrowej przez nowotwór, zwłaszcza w formie zaawansowanych procesów, sprawia operującym poważne trudności. Znane metody wykrywania guza nowotworowego można podzielić na trzy główne typy: badania laboratoryjne, cytologiczne i diagnostyka obrazowa. Najczęściej w diagnozowaniu nowotworów wykorzystuje się markery krążące w płynach ustrojowych, w tym głównie we krwi. Substancje te są uwalniane do układu krążenia chorego przez komórki i tkanki nowotworowe, a w przypadku wysokiego zaawansowania w ilościach p o- zwalających na ich pomiar, które można oznaczać laboratoryjnie, najczęściej w próbce krwi. Oznaczona wartość jest cechą osobniczo zmienną i zależy od wielu c zynników. Nie można jednoznacznie stwierdzić, że konkretna osoba choruje na nowotwór, biorąc pod uwagę jednokrotne oznaczenie, w którym poziom danego markera jest powyżej normy. Potwierdzono, że bardziej istotne są zmiany miana danego markera mierzone w czasie. Systematyczny ciągły ich wzrost świadczy najprawdopodobniej o rozroście masy nowotworowej. Nagły skok z poziomu normaln e- go, do wysokich wartości przekraczających ustalone normy, niekoniecznie świadczy o procesie nowotworowym, a wręcz może sugerować ostry proces zapalny danego narządu, z którego badane markery zostają uwolnione. W wykrywaniu raka możliwe jest też zastosowanie wysoko specyficznych metod genetyc z- nych. Laboratoryjne testy genetyczne w próbkach krwi umożliwiają znalezienie mutacji w genach mogących spowodować powstanie i rozwój nowotworu. Z informacji tych można wnioskować jedynie o zwiększonym ryzyku wystąpienia nowotworu, gdy jeszcze brak konkretnych objawów, które kwalifikowałyby wprowadzenie rutynowych metod leczenia. W komórkach nowotworowych, już nawet we wczesnych stadiach, obserwuje się zmiany genetyczne, które są możliwe do zide n- tyfikowania. Szczególne znaczenie przy wyborze metody leczenia, rozległości planowanego zabiegu operacyjnego i ich rokowań ma ustalenie typu histopatologicznego nowotworu i stopnia jego złośliwości. W niektórych przypadkach wystarcza tylko stwierdzenie obecności komórek nowotwor o- wych, bez określenia ich typu, ale dla podjęcia dalszych decyzji terapeutycznych potrzebne jest wprowadzanie coraz to doskonalszych metod. Współczesne zasady onkologii zabraniają podejmowania decyzji terapeutycznych bez wcześniejszego rozpoznania histopatologicznego. Ze względu na rodzaj ocenianego materiału badania można podzielić na badania cytol o- giczne i histopatologiczne. Badania cytologiczne polegają głównie na badaniu mikroskopowym materiału komórkowego, w tym przez ocenę rozmazów. Oprócz badań histopatologicznych, które mają decydujące znaczenie w postawieniu ostatecznej diagnozy, w poszukiwaniu niektórych n o- wotworów wykonuje się mikroskopowe badanie pojedynczych komórek w tzw. cytologii. Pozwalają one ocenić cechy pojedynczych komórek znajdujących się w pobranym materiale, np. w płynach puchlinowych i wysiękowych, w próbkach wymazów pobieranych głównie w badaniach ginekol o- gicznych. Przy użyciu mikroskopu bada się zarówno zmiany w cytoplazmie jak i jądrze komórk o- wym. Obserwowane zmiany, szczególnie w jądrze, pozwalają podjąć decyzję o zmianach now o-
PL 215 619 B1 3 tworowych w komórkach. Badania cytologiczne mają charakter wspomagający, w wielu przypadkach skryningowy i nie mogą zastąpić badań histopatologicznych. Rozpoznanie nowotworu stanowi w dużym stopniu podstawę do podjęcia decyzji o wyborze metody leczenia choroby. Bardzo istotne znaczenie ma określenie stopnia zaawansowania now o- tworu. Od uzyskanych wyników badań zależy jaką zastosuje się strategię leczenia. Współczesna klasyfikacja nowotworów uwzględnia parametry anatomiczne, to jest usytuowanie, wielkość guza, główny kierunek naciekania, egzofityczność czy endofityczność i zasięg choroby okre ślany trzema literami TNM, gdzie T - tumor - oznacza guza pierwotnego, N - nodes - obecność lub nieobecność przerzutów w węzłach chłonnych, M - metastases - obecność lub nieobecność przerzutów w odległych anatomicznie od guza pierwotnego narządach. W procesach szeroko pojętego rozwoju nowotworu i powstawania przerzutów ważną rolę odgrywają patogenne endopeptydazy, w tym posiadające w swoim centrum aktywnym resztę c y- steinową, do których zalicza się takie enzymy jak katepsyny B i L lub kalpainę. Enzymy te katalizują inwazyjny rozwój nowotworu oraz powstawanie przerzutów. Aktywność tych enzymów ró w- noważona jest in vivo przez ich specyficzne autogenne białkowe inhibitory. Inhibitory te znajdują się w kręgu zainteresowań wielu zespołów zajmujących się poznaniem zmian nowotworowych - jako białka mogące znaleźć zainteresowanie w poznaniu sposobów kontroli zmian agresywności i ewent u- alnego hamowania choroby nowotworowej. Wysoki poziom aktywnych cysteinowych endopeptydaz jest czynnikiem prognostycznym charakterystycznym dla określenia agresji nowotworu w organizmie konkretnego pacjenta. Aktywność cysteinowych peptydaz określa się jako markery agresji nowotworu, natomiast ich autogenne inhibitory jako w markery obronności organizmu. (Siewiski M. i inni 1996: Cancer Bioth. & Pharm. 11, 169-179). Obecność patogennych cysteinowych peptydaz takich jak katepsyny B i L lub kalpainy oraz ich autogennych inhibitorów występuje nie tylko w płynach ustrojowych, ale również w tkankach i komórkach rakowych. Oznaczanie aktywności tych białek w płynach ustrojowych znalazło zastosowanie w oznaczeniach progn o- stycznych zmian nowotworowych w organizmie pacjenta. Wynalazek dotyczy zastosowania inhibitorów cysteinowych peptydaz do oznaczania komórek wolnych lub wchodzących w skład tkanek nowotworowych, pozyskiwanych z różnych źródeł, w tym z białka jaja kurzego, roślin, łożyska i wód płodowych ludzkich zwierzęcych lub z mikroo r- ganizmów. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie inhibitorów cysteinowych peptydaz do oznacz a- nia in vitro rakowych komórek wolnych i wchodzących w skład tkanek nowotworowych, pozysk i- wanych z różnych źródeł, w tym z białka jaja kurzego, roślin, łożyska i wód płodowych ludzkich i zwierzęcych lub z mikroorganizmów, przy czym zawiesinę komórek z próbek przeznaczonych do badań cytologicznych, z tkanek uzyskiwanych pooperacyjnie lub z bioptatów, rozdrabnia się, umieszcza w buforze używanym do hodowli komórek, najkorzystniej w medium hodowlanym M i- nimum Essential Medium Eagla w modyfikacji alfa (MEM alfa ) z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej (Gibco), 2 mm glutaminy oraz 100 IU/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny, po czym do zawartych w płynie hodowlanym komórek w ilości 0,6-2,5 x 10 6/ ml zawiesiny dodaje się co najmniej 10 μl roztworu cysteinowych peptydaz, o aktywności 20-50 μci/μg białka, znakowanego izotopem promieniotwórczym takim jak Technet, jod lub inny, po czym zawiesinę komórek wraz ze znakowanym inhibitorem inkubuje się przez 20-40 minut w temperaturze 25-40 C i poddaje się przynajmniej jednokrotnemu płukaniu solą fizjologiczną (PBS), a następnie mierzy się radioaktywność badanych komórek przy użyciu licznika scyntylacyjnego i oblicza się ilość inhibitora związ a- nego z komórkami nowotworowymi z bilansu radioaktywności dodanego inhibitora i radioaktywn o- ści komórek po ich przepłukaniu, z uwzględnieniem radioaktywności supernatantów. Korzystnie, w przypadku, gdy komórki przeznacza się do przechowywania, stosuje się m e- dium hodowlane z dodatkiem 10% dwumetylosulfotlenku (DMSO) i zamraża w ciekłym azocie, a przed wykonaniem oznaczania są one rozmrażane. Znakowanie izotopem białkowych inhibitorów cysteinowych peptydaz pozwala na poznanie nowych form białkowych służących do monitorowania rozwoju guza i zastosowania ich w diagn o- styce nowotworowej. W rozwiązaniu według wynalazku proponuje się użycie wysoko oczyszczonych inhibitorów, w tym głównie izolowanych z białka jaja kurzego, związanych z radioaktywnymi pierwiastkami, które z kolei wiążą się wysoko specyficznie z katepsynami B i L, będącymi enzymami występującymi wewnątrz lub w membranach komórek nowotworowych.
4 PL 215 619 B1 Tak opracowany test pozwala w sposób szybki i precyzyjny określić czy oraz w jakiej ilości w badanych preparatach obecne są komórki posiadające cysteinowe peptydazy, czyli nowotw o- rowe. Oznaczenie pozwala określić też ilość zdrowych komórek nie zawierających tych enzymów. Wykorzystanie wysoce specyficznego sposobu wiązania egzogennych inhibitorów cysteinowych peptydaz czyli cystatyn ze znajdującymi się w komórkach rakowych katepsynami B i L pozwala na wykrycie w ten sposób wyłącznie komórek rakowych. Obecność tych enzymów oraz podane zn a- kowane cystatyny umożliwiają rozróżnienie komórek nowotworowych od prawidłowych, co jest nową metodą cytologiczną. Zastosowanie inhibitorów cysteinowych peptydaz do znakowania komórek wolnych i obecnych w tkankach nowotworowych według wynalazku daje możliwość oceny zmian nowotworowych w próbkach tkanek in vitro przy użyciu scyntygrafu. W badaniach tych inkubacja komórek rakowych razem z prawidłowymi ze znakowanym pierwiastkiem radioaktywnym inhibitorem cysteinowych peptydaz, pozwala na określenie ich wybiórczego wiązania się do kom ó- rek nowotworowych. W badaniach nad rakiem krtani potwierdzono, że ilość związanego inhibitora znakowanego np. jodem-125 zależy od czasu inkubacji oraz od ilości komórek rakowych. Dowodem na to, że znakowany inhibitor wiąże się specyficznie z komórkami nowotworowymi było doświadczenie, w którym po preinkubacji z nieznakowanym inhibitorem spowodowano zmniejszenie wiązania znakowanego inhibitora. W badaniach in vivo na zwierzętach doświadczalnych, z wszczepionym ludzkim rakiem krtani, podana dożylnie radioaktywna cystatyna łączyła się z narządami w e- wnętrznymi zaatakowanymi zmianami nowotworowymi, jak i z pojedynczymi komórkami rakowymi. Bardzo istotną okazała się informacja, w której badanie scyntygraficzne uwidoczniło wyraźnie narządy wewnętrzne, jak i obrysy guzów. Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano, że endopeptydaza cysteinowa raka krtani wiąże się z cystatyną znakowaną jodem-125. Po przeszczepieniu histologicznie zróżnicowanego raka płaskonabłonkowego uzyskano jednolity chara k- ter rosnącego guza, radioaktywność znakowanej cystatyny stwierdzono zarówno w tkance now o- tworowej jak i narządach wewnętrznych, a wiązanie radioaktywnej cystatyny przez komórki raka krtani pozwoliło na jego obrazowanie (Czecior E. i inni 2002; Otolaryng. Pol. 2002, LVI, 5, 573-576; Czecior E. i inni Eur. Arch. Oto-Rhino-Iaryngol. 2003, 260, 2 103. Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładzie wykonania. P r z y k ł a d: Zawiesinę komórek z pobranych tkanek uzyskiwanych pooperacyjnie lub z bioptatów, otrzymaną przez rozdrobnienie, poddaje się inkubacji w celu utworzenia hodowli k o- mórek. Do hodowli komórek nowotworowych i prawidłowych stosuje się specjalne medium hodo w- lane o składzie: Minimum Essential Medium Eagla w modyfikacji alfa, według katalogu firmy Sigma (MEM alfa) z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej (Gibco), plus 2 mm glutaminy oraz 100 IU/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. W przypadku, gdy komórki przeznacza się do przechowywania, stosuje się medium hodowlane z dodatkiem 10% dwumetylosulfotlenku (DMSO) i zamraża w ciekłym azocie, a przed wykonaniem oznaczania rozmraża. Przystępując do oznaczania komórek nowotworowych w zawiesinie, w stosunku do liczby komórek zawartych w płynie hodowlanym w ilości 0,6-2,5 x 10 6, dodaje się 10 l roztworu inhibitorów cysteinowych peptydaz, pozyskiwanych z białka jaja kurzego, znakowanych jodem radioa k- tywnym I-125 o aktywności 22 Ci/ g białka. Zawiesinę komórek wraz ze znakowanym inhibitorem inkubuje się przez 30 minut w temperaturze 37 C, po czym poddaje dwukrotnemu przepłukaniu solą fizjologiczną (PBS). Następnie mierzy się radioaktywność badanych komórek na liczniku scyntylacyjnym komórek i eluentów. Ilość inhibitora związanego z komórkami nowotworowymi oblicza się z bilansu radioaktywności dodanego inhibitora, radioaktywności komórek oraz po ich dwukrotnym przepłukaniu, z uwzględnieniem radioaktywności supernatantów. Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie inhibitorów cysteinowych peptydaz do oznaczania in vitro rakowych komórek wolnych i wchodzących w skład tkanek nowotworowych, pozyskiwanych z różnych źródeł, w tym z białka jaja kurzego, roślin, łożyska i wód płodowych ludzkich i zwierzęcych lub z mikroo r- ganizmów, przy czym zawiesinę komórek z próbek przeznaczonych do badań cytologicznych, z tkanek uzyskiwanych pooperacyjnie lub z bioptatów, rozdrabnia się, umieszcza w buforze uż y- wanym do hodowli komórek, najkorzystniej w medium hodowlanym Minimum Essential Medium
PL 215 619 B1 5 Eagla w modyfikacji alfa (MEM alfa) z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej (Gibco), 2 mm glutaminy oraz 100 IU/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny, po czym do zawartych w płynie hodowlanym komórek w ilości 0,6-2,5 x 10 6 /ml zawiesiny dodaje się co najmniej 10 μl roztworu cysteinowych peptydaz, o aktywności 20-50 μci/μg białka, znakowanego izotopem promieniotwórczym takim jak Technet, jod lub inny, po czym zawiesinę komórek wraz ze znakowanym inhibitorem inkubuje się przez 20-40 minut w temperaturze 25-40 C i poddaje się przynajmniej jednokrotnemu płukaniu solą fizjologiczną (PBS), a następnie mierzy się radioaktywność badanych kom ó- rek przy użyciu licznika scyntylacyjnego i oblicza się ilość inhibitora związanego z komórkami nowotworowymi z bilansu radioaktywności dodanego inhibitora i radioaktywności komórek po ich przepłukaniu, z uwzględnieniem radioaktywności supernatantów. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w przypadku, gdy komórki przeznacza się do przechowywania, stosuje się medium hodowlane z dodatkiem 10% dwumetylosulfotlenku (DMSO) i zamraża w ciekłym azocie, a przed wykonaniem oznaczania są one rozmrażane.
6 PL 215 619 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)