ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP) Amplified DNA Assay

ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP) Amplified DNA Assay U.S. Patent Nos. 5,27,184; 5,547,861; 5,648,211; 5,712,124; 5,744,311; 5,846,726; 5,851,767; 5,866,336; 5,919,63; 5,928,869; 5,958,7; 6,54,279; 6,9,552; 6,117,635; 6,277,582; 6,316,2; 6,656,68; 6,743,582. 81961 26/4 Polski Þr. informacinio lapelio pabaigoje pateikiamà simboliø glosarijø. PRZEZNACZENIE Test BD ProbeTec ET oparty na amplifikacji DNA (Amplified DNA Assay), wykrywaj¹cy bakterie Mycoplasma pneumoniae (MP), przeznaczony do u ytku wraz z Systemem BD ProbeTec ET, wykorzystuje technologiê amplifikacji z przesuniêciem ³añcucha (Strand Displacement Amplification, SDA) w celu bezpoœredniego, jakoœciowego wykrywania DNA bakterii Mycoplasma pneumoniae. Niniejszy test s³u y do badania wymazów z gard³a (z pod³o em transportowym i bez niego) pochodz¹cych od pacjentów z klinicznymi objawami i innymi oznakami diagnostycznymi zapalenia p³uc. Test mo na stosowaæ pomocniczo w celu postawienia wstêpnej diagnozy zapalenia p³uc wywo³anego bakteriami Mycoplasma pneumoniae. STRESZCZENIE I OBJAŒNIENIE Mycoplasma pneumoniae jest mikroorganizmem komórkowym, pozbawionym œciany komórkowej, wywo³uj¹cym atypowe zapalenie p³uc. Wykorzystuj¹c zjawisko adhezji, wi¹ e siê z komórkami nab³onkowymi uk³adu oddechowego i jest przyczyn¹ od oko³o 15 do 2% przypadków pozaszpitalnego zapalenia p³uc (community-acquired pneumonia CAP). Objawy kliniczne zaka enia M. pneumoniae nie ró ni¹ siê znacz¹co od zaka eñ wywo³anych innymi patogenami uk³adu oddechowego, jak np. Chlamydophila pneumoniae, st¹d rozpoznanie opiera siê przede wszystkim na badaniach laboratoryjnych. 1 Zaka enia wywo³ane przez M. pneumoniae wystêpuj¹ we wszystkich grupach wiekowych i, mimo e uznawane s¹ przed wszystkim za g³ówn¹ przyczynê pozaszpitalnego zapalenia p³uc u m³odych doros³ych, wykazano, e czêstoœæ wystêpowania mykoplazmatycznego zapalenia p³uc wzrasta z wiekiem, co podkreœla znaczenie tego patogenu u pacjentów w podesz³ym wieku. 2 Do przeniesienia bakterii z jednej osoby na drug¹ dochodzi drog¹ kropelkow¹ a objawami choroby s¹ gor¹czka, dreszcze, kaszel, ból w klatce piersiowej, ból gard³a i powiêkszenie wêz³ów ch³onnych. Objawy kliniczne mykoplazmatycznego zapalenia p³uc s¹ zazwyczaj miernie wyra one i maj¹ tendencjê do samoistnego ograniczania siê. W przebiegu zaka enia mog¹ jednak wystêpowaæ powa ne powik³ania p³ucne, takie jak: wysiêk op³ucnowy, pneumatocele, ropieñ p³uca, odma op³ucnowa, rozstrzenie oskrzeli, przewlek³e w³óknienie œródmi¹ szowe czy zespó³ niewydolnoœci oddechowej (respiratory distress syndrome, RDS). Czêstym, ale rzadko rozpoznawanym powik³aniem jest zarostowe zapalenie oskrzelików, które mo e prowadziæ do niewydolnoœci oddechowej. 2 Zdarzaj¹ siê tak e ciê kie zaka enia wymagaj¹ce hospitalizacji, szczególnie u osób w œrednim i podesz³ym wieku. 3 Koniecznoœæ postawienia diagnozy i okreœlenia etiologii zapalenia p³uc staje siê bardziej istotna w œwietle zagadnienia nadu ywania antybiotyków. Wed³ug wytycznych Infectious Diseases Society of America aden z dostêpnych testów diagnostycznych nie wykrywa jednak zaka enia bakteri¹ M. pneumoniae 4 z dostateczn¹ wiarygodnoœci¹ i szybkoœci¹. Wymagana jest wiêc inkubacja przez okres 2 3 tygodni i uzyskanie wzrostu bakterii w warunkach in vitro przy zastosowaniu specjalnych bezkomórkowych pod³o y hodowlanych. Badania serologiczne pozwalaj¹ na retrospektywne rozpoznanie zaka enia bakteriami z rodzaju Mycoplasma. Metoda ta cechuje siê jednak zmienn¹ czu³oœci¹ i swoistoœci¹. Ró ni¹ siê tak e wymagania dotycz¹ce pobierania surowicy osób, które wyzdrowia³y, co ma wp³yw na prawid³ow¹ interpretacjê wyników. 2 Szybkie techniki diagnostyczne, wykorzystuj¹ce amplifikacjê kwasów nukleinowych, mog¹ okazaæ siê pomocne w postawieniu diagnozy, pozwalaj¹c w ten sposób na zastosowanie w odpowiednim czasie w³aœciwego celowanego leczenia. ZASADY PROCEDURY W teœcie BD ProbeTec ET wykrywaj¹cym Mycoplasma pneumoniae (MP) wykorzystuj¹cym amplifikacjê DNA u yto jednoczesnej amplifikacji i detekcji docelowego DNA przy u yciu primerów i sondy detekcyjnej znakowanej zwi¹zkiem fluorescencyjnym. Odczynniki SDA liofilizuje siê w dwóch oddzielnych jednorazowych mikrostudzienkach. Przygotowan¹ próbkê dodaje siê do mikrostudzienki Priming Microwell zawieraj¹cej primery amplifikacyjne, znakowane fluorescencyjnie sondy detekcyjne i inne odczynniki niezbêdne w procesie amplifikacji. Primery zosta³y zaprojektowane w celu amplifikacji z³o onego z 73 par zasad regionu konserwatywnego genu P1 M. pneumoniae. Po zakoñczeniu inkubacji mieszaninê reakcyjn¹ przenosi siê do mikrostudzienki Amplification Microwell, zawieraj¹cej dwa enzymy (polimerazê DNA i endonukleazê restrykcyjn¹), konieczne do przeprowadzenia testu SDA. W celu unikniêcia zanieczyszczenia mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji s¹ uszczelniane, a nastêpnie inkubowane w sterowanym termicznie czytniku fluorescencyjnym, monitoruj¹cym ka d¹ reakcjê pod wzglêdem wytwarzania produktów amplifikacji. W przebiegu ka dej reakcji nastêpuje koamplifikacja i detekcja wewnêtrznej kontroli amplifikacji (IAC), której celem jest sprawdzanie, czy s¹ spe³nione wymagane warunki amplifikacji oraz zmniejszenie ryzyka uzyskania fa³szywie ujemnych wyników spowodowanych obecnoœci¹ inhibitorów testu. Obecnoœæ lub brak DNA w³aœciwego dla M. pneumoniae oznacza siê przez obliczenie dla próbki punktacji PAT (Passes After

Threshold), opartej na znanych wartoœciach progowych. Urz¹dzenie automatycznie przedstawi zarówno wyniki pozytywne, negatywne, jak i nieokreœlone. ODCZYNNIKI I MATERIA Y Ka de opakowanie odczynników testu BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP) Amplified DNA Assay zawiera nastêpuj¹ce elementy: Mikrostudzienki Mycoplasma pneumoniae (MP) do zalewania cieczy, (1 x 24) 6 Oligonukleotydy 7,5 pmol, dntp 15,2 nmol, 2 sondy detektorowe 22,5 pmol, Syntetyczny oligonukleotyd 6 kopii Mikrostudzienki Mycoplasma pneumoniae (MP) przeznaczone do amplifikacji, (1 x 24) Enzym restrykcyjny: 33 jednostki, Polimeraza DNA 14 jednostek 1 pokrywy Priming Cover, 16 uszczelek Amplification Sealers (1/2), 8 torebek na odpady BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (Rozcieñczalnik do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o a i zestaw kontrolny) (CF*/LP**/MP): Zawiera: Rozcieñczalnik do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o a: Bicine, fosforan potasu, wodorotlenek potasu, dimetylosulfotlenek (DMSO) oraz Proclin; 1 kontroli pozytywnych (CF/LP/MP): 15 ng DNA nasienia ³ososia, 47,3 μg Tris, 9, μg EDTA, 36 kopii plazmidu CF, 48 kopii plazmidu LP, 54 kopii plazmidu MP; 1 kontroli negatywnych (CF/LP/MP): 15 ng DNA nasienia ³ososia, 47,3 μg Tris, 9, μg EDTA; 1 probówek o pojemnoœci 2 ml z przykrywk¹ zatrzaskow¹ * Zob. test BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay ** Zob. test BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay BD ProbeTec ET Swab Diluent and Control Kit (Rozcieñczalnik do wymazów i zestaw kontrolny) (tcf/tmp)*: Zawiera: Rozcieñczalnik do wymazów: Bicine, fosforan potasu, wodorotlenek potasu, dimetylosulfotlenek (DMSO) oraz Proclin; 1 kontroli pozytywnych (tcf/tmp): 175 ng DNA nasienia ³ososia, 78,8 μg Tris, 15, μg EDTA, 6 kopii plazmidu CF, 8 kopii plazmidu LP, 9 kopii plazmidu MP; 1 kontroli negatywnych (tcf/tmp): 175 ng DNA nasienia ³ososia, 78,8 μg Tris, 15, μg EDTA * Oznaczenie t odnosi siê do odczynników zaprojektowanych do u ycia jedynie z wymazami z gard³a (bez pod³o a transportowego). Aparatura, wyposa enie i zaopatrzenie: Aparat BD ProbeTec ET z p³yt¹, blok grzewczy BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater, cieplarka lizuj¹ca BD ProbeTec ET, statyw lityczny BD ProbeTec ET, pipetor BD ProbeTec ET, podstawka oraz zasilacz, zestaw akcesoriów BD ProbeTec ET, probówki BD ProbeTec ET o pojemnoœci 2 ml i 4 ml wraz z nakrêtkami, koñcówki pipet BD ProbeTec ET. Materia³y wymagane, ale niedostarczane: Komora bezpieczeñstwa biologicznego (Biological Safety Cabinet, BSC) klasy II, mieszad³o, ch³odziarka niskotemperaturowa -2 C i/lub -7 C (lub poni ej) nontemperature cycling, mikrowirówka osi¹gaj¹ca 16 x g, ³aŸnie wodne, termometr cyfrowy, stojak ³aŸni wodnej z przykrêcan¹ pokryw¹, stojak na probówki o pojemnoœci 2 ml i inne odpowiednie stojaki na probówki, wymazówki BBL CultureSwab EZ, rêkawiczki jednorazowe, mikropipety o pojemnoœci od 2 do 1 μl, pipety z koñcówkami z barier¹ dla aerozolu, woda destylowana, woda czysta do celów biologii molekularnej, podchloryn sodu o stê eniu 1% (v/v) z preparatem Alconox* * Rozpuœciæ 7,5 g preparatu Alconox w 1 L 1% roztworu podchlorynu sodu (v/v) i wymieszaæ. Codziennie przygotowywaæ œwie ¹ mieszaninê. Warunki przechowywania i u ytkowania: Opakowania odczynników BD ProbeTec ET MP mog¹ byæ przechowywane w temperaturze od 2 do 33 C. Nie stosowaæ nieotwartych zestawów odczynników po up³ywie daty wa noœci. Po otwarciu opakowania, mikrostudzienki, o ile s¹ w³aœciwie uszczelnione, zachowuj¹ stabilnoœæ przez okres 8 tygodni lub do daty wa noœci (w zale noœci od tego, który termin up³ywa wczeœniej). Nie zamra aæ. Rozcieñczalnik do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o a oraz zestaw kontrolny (CF/LP/MP) BD ProbeTec ET mog¹ byæ przechowywane w temperaturze od 2 do 33 C. Nie stosowaæ odczynników po up³ywie daty wa noœci. Nie zamra aæ. Rozcieñczalnik do wymazów i zestaw kontrolny (tcf/tmp) BD ProbeTec ET mo e byæ przechowywany w temperaturze od 2 do 33 C. Nie stosowaæ odczynników po up³ywie daty wa noœci. Nie zamra aæ. 2

Ostrze enia i œrodki ostro noœci Do stosowania w diagnostyce in vitro. 1. W próbkach klinicznych mog¹ byæ obecne drobnoustroje chorobotwórcze, takie jak wirusy zapalenia w¹troby i ludzki wirus upoœledzenia odpornoœci (Human Immunodeficiency Virus, HIV). Podczas pracy z wszelkimi materia³ami zanieczyszczonymi krwi¹ i innymi p³ynami ustrojowymi nale y stosowaæ Standardowe œrodki ostro noœci 5-8 oraz przestrzegaæ wytycznych obowi¹zuj¹cych w danym laboratorium. 2. Rozcieñczalnik BD ProbeTec ET do wymazów i próbek z uk³adu oddechowego i pod³o a zawiera dimetylosulfotlenek (DMSO). DMSO jest szkodliwy dla zdrowia wdychanie, kontakt ze skór¹ lub po³kniêcie mo e byæ niebezpieczne. Nale y unikaæ kontaktu z oczami i podczas pracy zawsze u ywaæ rêkawiczek. W razie dostania siê do oczu, przep³ukaæ natychmiast oczy du ¹ iloœci¹ wody i zg³osiæ siê do lekarza. Je eli dojdzie do kontaktu ze skór¹, natychmiast sp³ukaæ du ¹ iloœci¹ wody. 3. System BD ProbeTec ET zaprojektowano tak, by zmniejszyæ do minimum mo liwoœæ zanieczyszczenia amplikonów i do pracy z systemem BD ProbeTec ET nie s¹ konieczne specjalne miejsca pracy. Niemniej jednak nale y stosowaæ inne œrodki ostro noœci maj¹ce na celu zapobieganie zanieczyszczeniu, zw³aszcza zanieczyszczeniu hodowli w czasie przygotowywania. 4. Otwarte opakowania z odczynnikami zawieraj¹ce niewykorzystane mikrostudzienki do zalewania cieczy i mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji MUSZ byæ ponownie starannie uszczelnione. Przed ponownym uszczelnieniem nale y siê upewniæ, e w opakowaniu z odczynnikami znajduje siê œrodek osuszaj¹cy. 5. Przed przeniesieniem p³ytki zawieraj¹cej mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji z bloku grzewczego BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater do aparatu BD ProbeTec ET, NALE Y j¹ starannie zakleiæ uszczelk¹ przeznaczon¹ do mikrostudzienek przeznaczonych do amplifikacji. Uszczelnienie zapewnia zamkniêt¹ reakcjê amplifikacji i detekcji oraz jest konieczne do unikniêcia zanieczyszczenia aparatu i miejsca pracy produktami amplifikacji. W adnym wypadku nie wolno usuwaæ z mikrostudzienek materia³u uszczelniaj¹cego. 6. Mikrostudzienki do zalewania cieczy z pozosta³ym p³ynem (po przeniesieniu p³ynu z mikrostudzienek do zalewania cieczy do mikrostudzienek przeznaczonych do amplifikacji) mog¹ stanowiæ Ÿród³o zanieczyszczenia. Przed wyrzuceniem mikrostudzienek do zalewania cieczy nale y je starannie uszczelniæ. 7. Aby unikn¹æ zanieczyszczenia œrodowiska pracy produktami amplifikacji, w celu usuniêcia zu ytych mikrostudzienek przeznaczonych do amplifikacji nale y stosowaæ torebki na odpady dostarczone wraz z zestawem odczynników. Przed usuniêciem nale y upewniæ siê, e torebki na odpady zosta³y prawid³owo zamkniête. 8. W celu unikniêcia krzy owego zanieczyszczenia próbek w trakcie poszczególnych etapów przetwarzania próbki i procedury testowej nale y ZMIENIAÆ RÊKAWICZKI. W przypadku kontaktu rêkawiczek z próbk¹ nale y je natychmiast zmieniæ, aby unikn¹æ zanieczyszczenia pozosta³ych próbek. 9. W przypadku zanieczyszczenia miejsca pracy lub aparatury z próbkami lub próbkami kontrolnymi nale y starannie przemyæ strefê zanieczyszczenia 1% (v/v) roztworem podchlorynu sodu z preparatem Alconox i sp³ukaæ dok³adnie wod¹. Przed przyst¹pieniem do dalszych etapów testu nale y odczekaæ, a powierzchnia bêdzie ca³kowicie sucha. 1. Do przenoszenia przetworzonych próbek do mikrostudzienek do zalewania cieczy i przenoszenia próbek z mikrostudzienek do zalewania cieczy do mikrostudzienek przeznaczonych do amplifikacji u ywaæ wy³¹cznie pipetora BD ProbeTec ET i koñcówek BD ProbeTec ET. 11. Przestrzegaæ przyjêtych praktyk laboratoryjnych dotycz¹cych usuwania zu ytych koñcówek pipet, probówek na próbki, mikrostudzienek do zalewania cieczy i innych odpadów. Ostro nie wyrzucaæ produkty jednorazowego u ytku. Pojemniki na odpady nale y uszczelniæ i wyrzuciæ, gdy zostan¹ wype³nione w ¾ swojej pojemnoœci lub codziennie (w zale noœci od tego, co bêdzie pierwsze). 12. Nie zamieniaæ i nie mieszaæ mikrostudzienek, próbek kontrolnych ani odczynników do przetwarzania próbek pochodz¹cych z zestawów o ró nych numerach seryjnych. 13. W przypadku wyst¹pienia niecodziennych sytuacji, takich jak wylanie siê p³ynu do wnêtrza aparatu BD ProbeTec ET lub zanieczyszczenie DNA, którego nie mo na usun¹æ myciem, nale y siê skontaktowaæ z obs³ug¹ techniczn¹. 33

POBIERANIE I TRANSPORT PRÓBEK 1. Pobieranie próbki Wszystkie próbki nale y pobieraæ zgodnie z zaleceniami zawartymi w podrêczniku Clinical Microbiology Procedures Handbook 9 lub z podrêcznikiem procedur laboratoryjnych, obowi¹zuj¹cym w laboratorium U ytkownika. Wymazówka BBL CultureSwab EZ (BD nr kat. 22144) powinna byæ u ywana do pobierania wymazów z gard³a, przechowywanych bez pod³o a transportowego. 2. Przechowywanie i transport próbek Wymazy z gard³a (bez pod³o a transportowego): Próbki mog¹ byæ przechowywane/transportowane w temperaturze od 18 do 33 C nie d³u ej ni przez 2 dni. Próbki mog¹ byæ przechowywane w lodówce, w temperaturze od 2 do 8 C nie d³u ej ni przez 3 dni. Próbki mog¹ byæ przechowywane w temperaturze -2 C lub ni szej nie d³u ej ni przez 14 tygodni. Wymazy z gard³a na pod³o u 2SP Medium: 9 Próbki powinny bezzw³ocznie zostaæ sch³odzone do temperatury od 2 do 8 C. Transportowaæ w mokrym lodzie lub w sch³odzonym opakowaniu, jeœli transport trwa d³u ej ni kilka minut. Próbki powinny byæ przechowywane w temperaturze od 2 do 8 C nie d³u ej ni przez 2 dni. Próbki wymagaj¹ce przechowywania przez d³u szy czas powinny zostaæ umieszczone w temperaturze -7 C. PROCEDURA TESTOWA Aby uzyskaæ szczegó³owe instrukcje dotycz¹ce u ytkowania i obs³ugi sk³adników systemu, nale y zapoznaæ siê z podrêcznikiem u ytkownika systemu BD ProbeTec ET. A. Przygotowanie aparatu: 1. Przed rozpoczêciem testu w³¹czyæ aparat i odczekaæ, a osi¹gnie temperaturê robocz¹. a. Nale y przeznaczyæ oko³o 9 minut na osi¹gniêcie temperatury roboczej i stabilizacjê cieplarki lizuj¹cej i bloku grzewczego Priming and Warming Heater. Cieplarka lizuj¹ca zosta³a ustawiona na temperaturê 114 C. Wartoœæ nastawcza sk³adowej (Priming) bloku grzewczego Priming and Warming Heater wynosi 72,5 C. Wartoœæ nastawcza sk³adowej (Warming) bloku grzewczego Priming and Warming Heater wynosi 54 C. b. Aparat BD ProbeTec ET jest sterowany programowo; czas osi¹gniêcia temperatury roboczej wynosi oko³o 3 minut. 2. Przed rozpoczêciem testu nale y sprawdziæ temperatury podgrzewacza. Zapisaæ temperatury w systemie BD ProbeTec ET System Maintenance Log. a. Cieplarka lizuj¹ca Zdj¹æ plastikow¹ pokrywê i odczekaæ 15 minut do wyrównania temperatury. Termometr powinien wskazywaæ temperaturê od 112 do 116 C. b. Blok grzewczy Priming and Warming Heater Termometr bloku grzewczego Priming Heater powinien wskazywaæ temperaturê od 72 do 73 C. Termometr bloku grzewczego Warming Heater powinien wskazywaæ temperaturê od 53,5 do 54,5 C. 3. Sprawdziæ temperaturê wyœwietlan¹ na ekranie aparatu BD ProbeTec ET. Powinna ona wynosiæ od 47,5 do 55, C. Zapisaæ temperatury w systemie BD ProbeTec ET System Maintenance Log. B. Pipetor: Aby uzyskaæ szczegó³owe wyjaœnienia funkcji klawiatury pipetora BD ProbeTec ET, nale y zapoznaæ siê z podrêcznikiem u ytkownika systemu BD ProbeTec ET. Dodatkowo, pipetor BD ProbeTec ET powinien byæ czyszczony po ka dym u yciu. W celu uzyskania wskazówek na temat prawid³owego czyszczenia i obs³ugi pipetora BD ProbeTec ET nale y skontaktowaæ siê z przedstawicielem obs³ugi technicznej. Do wykonania testu BD ProbeTec ET MP Assay wymagane s¹ nastêpuj¹ce programy. Program 1 s³u y do przenoszenia p³ynu z przetworzonych próbek do mikrostudzienek MP do zalewania cieczy. Program 5 s³u y do przenoszenia p³ynu z mikrostudzienek MP do zalewania cieczy do mikrostudzienek MP przeznaczonych do amplifikacji. Pipetor nale y zaprogramowaæ w nastêpuj¹cy sposób: Program 1: 1. W CZYÆ pipetor. Pipetor emituje pojedynczy sygna³ dÿwiêkowy, przez chwilê jest wyœwietlane ZERO i Software Version # (wersja oprogramowania), a nastêpnie jest emitowany kolejny sygna³ dÿwiêkowy. 2. Wcisn¹æ niebieski przycisk Prog (program). Aby wybraæ program 1, nale y wcisn¹æ i przytrzymaæ przycisk Vol (objêtoœæ), a wyœwietli siê 1. Wcisn¹æ przycisk Enter. 3. Aby przejœæ do trybu programowania, nale y wcisn¹æ i przytrzymaæ przycisk Prog. Przytrzymuj¹c wciœniêty przycisk Prog, u ywaj¹c koñcówki pipety lub spinacza do papieru, wcisn¹æ specjalny przycisk funkcyjny (Special Function Key). 4

4. Wcisn¹æ przycisk Fill. Wcisn¹æ przycisk strza³ki w górê, a zostanie wyœwietlone 2. Wcisn¹æ przycisk Enter. 5. Wcisn¹æ przycisk Disp (dozowanie). Wcisn¹æ przycisk strza³ki w górê, a zostanie wyœwietlone 15. Wcisn¹æ przycisk Enter. 6. W celu zapisania danych i zakoñczenia programu ponownie wcisn¹æ przycisk Enter. Pipetor powinien emitowaæ sygna³ dÿwiêkowy potwierdzaj¹cy zakoñczenie programowania. 7. Zweryfikowaæ program wcisn¹æ przycisk spustowy, by przejrzeæ wszystkie etapy. Po zakoñczeniu poszczególnych etapów nale y ustawiæ szybkoœæ pobierania/dozowania za pomoc¹ przycisku Vol (objêtoœæ). Na ka dym etapie jest wyœwietlany wskaÿnik szybkoœci. Stosuj¹c przycisk Vol, nastawiæ wskaÿnik szybkoœci tak, aby wyœwietla³ 2 kwadraty dla kroków Fill (nape³nianie) i Disp (dozowanie). Program 5 1. Wcisn¹æ przycisk Prog (program). Aby wybraæ program 5, nale y wcisn¹æ i przytrzymaæ przycisk Vol, a wyœwietli siê 5. Wcisn¹æ przycisk Enter. 2. Aby przejœæ do trybu programowania, nale y wcisn¹æ i przytrzymaæ przycisk Prog. Przytrzymuj¹c wciœniêty przycisk Prog, u ywaj¹c koñcówki pipety lub spinacza do papieru, wcisn¹æ specjalny przycisk funkcyjny (Special Function Key). 3. Wcisn¹æ przycisk Fill. Wcisn¹æ przycisk strza³ki w górê, a zostanie wyœwietlone 1. Wcisn¹æ przycisk Enter. 4. Wcisn¹æ przycisk Disp. Wcisn¹æ przycisk strza³ki w górê, a zostanie wyœwietlone 1. Wcisn¹æ przycisk Enter. 5. Wcisn¹æ przycisk Mix. (mieszanie). Wcisn¹æ przycisk strza³ki w górê, a zostanie wyœwietlone 5. Wcisn¹æ przycisk Enter. 6. W celu zapisania danych i zakoñczenia programu ponownie wcisn¹æ przycisk Enter. Pipetor powinien emitowaæ sygna³ dÿwiêkowy potwierdzaj¹cy zakoñczenie programowania. 7. Zweryfikowaæ program wcisn¹æ przycisk spustowy, by przejrzeæ wszystkie etapy. Po zakoñczeniu poszczególnych kroków nale y ustawiæ prêdkoœæ pobierania/dozowania/mieszania za pomoc¹ przycisku Vol (objêtoœæ). Na ka dym etapie jest wyœwietlany wskaÿnik szybkoœci. Stosuj¹c przycisk Vol, nastawiæ wskaÿnik szybkoœci tak, aby wyœwietla³ 2 kwadraty dla etapów pobierania i dozowania. Stosuj¹c przycisk Vol, nastawiæ wskaÿnik szybkoœci tak, by wyœwietla³ 3 kwadraty. Przegl¹d programów Przed rozpoczêciem procedury nale y dokonaæ przegl¹du programów. W celu dokonania przegl¹du programów nale y W CZYÆ pipetor. Wcisn¹æ niebieski przycisk Prog (program). Wcisn¹æ i przytrzymaæ przycisk Vol (objêtoœæ), a zostanie wyœwietlony numer w³aœciwego programu (1 lub 5). Wcisn¹æ przycisk Enter. Aby przejrzeæ program krok po kroku, nale y u ywaæ przycisku spustowego pipetora. Program 1: Program obejmuje pobranie 2 μl i dozowanie 15 μl do mikrostudzienki MP. Na wyœwietlaczu pipetora powinny byæ wyœwietlane nastêpuj¹ce dane: Fill 2 μl S Dispense 15 μl S Program 5: Program obejmuje pobranie 1 μl, dozowanie 1 μl i trzykrotne mieszanie 5 μl. Na wyœwietlaczu pipetora powinny byæ wyœwietlane nastêpuj¹ce dane: Fill 1 μl S Dispense 1 μl S Mix 5 μl S Zero (wyœwietlane pulsacyjnie) C. Uk³ad p³ytki: Po wprowadzeniu do systemu rodzaju testu, danych identyfikacyjnych próbek, numerów seryjnych kontroli i numerów seryjnych zestawu aparat BD ProbeTec ET wyœwietla Raport o uk³adzie p³ytki. Raport o uk³adzie p³ytki przedstawia przestrzenne rozmieszczenie próbek badanych i kontrolnych na ka dej testowanej p³ytce. Rozmieszczenie ma zastosowanie zarówno dla p³ytki Priming Microwell, jak i p³ytki Amplification Microwell. Mikrostudzienki do zalewania cieczy przeznaczone do oznaczenia MP maj¹ jednolity rdzawoczerwony kolor. Mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji maj¹ rdzawoczerwone paski. D. Przetwarzanie próbek wymazów z gard³a (bez pod³o a transportowego): UWAGI: Przed u yciem nale y odczekaæ, a Rozcieñczalnik BD ProbeTec ET do wymazów (tcf/tmp) osi¹gnie temperaturê pokojow¹, a nastêpnie wymieszaæ delikatnie go odwracaj¹c. 5

W czystym pojemniku umieœciæ odpowiedni¹ iloœæ Rozcieñczalnika BD ProbeTec ET do wymazów (tcf/tmp). Aby oszacowaæ wymagan¹ iloœæ, nale y u yæ 1 ml do ka dej próbki, a nastêpnie dodaæ kolejne 1 2 ml dla u³atwienia pipetowania. Aby unikn¹æ zanieczyszczenia rozcieñczalnika, nie nale y wlewaæ jego pozosta³oœci z powrotem do butelki. 1. Oznakowaæ probówkê o pojemnoœci 4 ml ka dego przetwarzanego wymazu z gard³a. 2. Nale y pozostawiæ fiolki do uzyskania temperatury pokojowej. 3. Do ka dej probówki odmierzyæ pipet¹ 1 ml rozcieñczalnika do wymazów (tcf/tmp). 4. W³o yæ wymazówkê. Obracaj¹c probówk¹ przez 5 1 sekund, mieszaæ zawartoœæ probówki z rozcieñczalnikiem. 5. Wycisn¹æ wymazówkê o œciankê probówki tak, aby p³yn sp³yn¹³ na dno probówki. 6. Ostro nie wyj¹æ wymazówkê, aby nie rozlaæ zawartoœci. UWAGA: Spadaj¹ce krople mog¹ zanieczyœciæ miejsce pracy. 7. Umieœciæ wymazówkê z powrotem w probówce transportowej, a nastêpnie wyrzuciæ. 8. Szczelnie zatkaæ probówkê. 9. Mieszaæ zawartoœæ probówki przez 5 sekund. 1. Powtórzyæ kroki 3 9 dla dodatkowych wymazów. 11. Przygotowaæ próbki kontrolne. Zob. Przygotowanie próbek kontrolnych pochodz¹cych z gard³a (Rozdzia³ F). 12. Przy u yciu Raportu o uk³adzie p³ytki umieœciæ próbki badane i kontrolne w statywie litycznym wed³ug wskazanego porz¹dku. 13. Zamkn¹æ próbki w odpowiednich miejscach statywu litycznego BD ProbeTec ET. 14. W³o yæ statyw lityczny BD ProbeTec ET do cieplarki lizuj¹cej BD ProbeTec ET. 15. Podgrzewaæ próbki przez 1 minut. 16. Po 1 minutach wyj¹æ statyw lityczny BD ProbeTec ET z cieplarki lizuj¹cej BD ProbeTec ET i poczekaæ na sch³odzenie 15 minut. Delikatnie uderzaæ stojakiem o blat sto³u tak, aby zebraæ mo liwie du o kondensatu na dnie probówki. UWAGA: Po lizie próbek: a. Mo na je przechowywaæ w temperaturze od 18 do 33 C nie d³u ej ni 6 godzin i mog¹ zostaæ poddane testowi bez ponownej lizy. b. Mog¹ byæ przechowywane w temperaturze od 2 do 8 C nie d³u ej ni 3 dni. Przed wykonaniem testu próbki musz¹ zostaæ poddane wirowaniu i ponownej lizie. c. Mog¹ byæ przechowywane w temperaturze -2 C nie d³u ej ni 14 tyg. Przed wykonaniem testu próbki musz¹ zostaæ rozmro one w temperaturze pokojowej, poddane wirowaniu i ponownej lizie. 17. Próbki s¹ gotowe do wykonania procedury testowej BD ProbeTec ET MP Assay (Rozdzia³ G). E. Przetwarzanie próbek wymazów z gard³a (na pod³o u 2SP) Uwagi odnoœnie do procedury: Miêdzy przenoszeniem wszystkich p³ynów nale y zmieniaæ koñcówki pipety. Zaleca siê u ywanie koñcówek z barier¹ dla aerozolu. Przed u yciem nale y odczekaæ, a Rozcieñczalnik BD ProbeTec ET do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o a (CF/LP/MP) osi¹gnie temperaturê pokojow¹, a nastêpnie wymieszaæ, delikatnie go odwracaj¹c. W czystym pojemniku umieœciæ odpowiedni¹ iloœæ Rozcieñczalnika BD ProbeTec ET do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o a (CF/LP/MP). Aby oszacowaæ wymagan¹ iloœæ, nale y u yæ,4 ml do ka dej próbki, a nastêpnie dodaæ kolejne 1 2 ml dla u³atwienia pipetowania. Aby unikn¹æ zanieczyszczenia rozcieñczalnika, nie nale y wlewaæ jego pozosta³oœci z powrotem do butelki. 1. Nale y pozostawiæ fiolki do uzyskania temperatury pokojowej. 2. Oznakowaæ zakrêcane probówki o pojemnoœci 2 ml ka dej badanej próbki. 3. Do ka dej zakrêcanej probówki przenieœæ 4 μl Rozcieñczalnika do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o a (CF/LP/MP). Opisane poni ej kroki 4 6 powinny byæ wykonywane w komorze bezpieczeñstwa biologicznego (BSC): 4. W celu pe³nego wymieszania próbek obracaæ nimi miarowo przez 5 15 sekund. 5. Za pomoc¹ pipety przenieœæ 2 μl próbki do oznakowanej probówki. UWAGA: Je eli objêtoœæ próbki nie przekracza 2 μl (objêtoœæ próbki musi wynosiæ co najmniej 1 μl), nale y uzupe³niæ objêtoœæ do 2 μl za pomoc¹ czystej wody do celów biologii molekularnej. 6. Po dodaniu próbek nale y zmieniæ rêkawiczki. UWAGA: Przed przyst¹pieniem do kroku 7 nape³niæ ³aŸniê wodn¹ wod¹ destylowan¹ i doprowadziæ j¹ do wrzenia. 7. Obracaæ miarowo przez 5 sekund. 6

8. Przygotowaæ próbki kontrolne. Zob. Przygotowanie pod³o a kontrolnego 2SP (Rozdzia³ F). 9. Przenieœæ próbki badane i kontrolne do stojaka do gotowania. 1. Umieœciæ stojak do gotowania we wrz¹cej wodzie i pozostawiæ na 1 minut. 11. Po up³ywie 1 minut nale y wyj¹æ stojak do gotowania i odczekaæ 15 minut, a probówki osi¹gn¹ temperaturê pokojow¹. OSTRZE ENIE: Wrz¹ca woda, stojak i powierzchnie ³aŸni wodnej mog¹ byæ gor¹ce. Aby unikn¹æ oparzenia, nale y zachowaæ ostro noœæ. 12. Po ostygniêciu wirowaæ (16 x g) przez oko³o 5 sekund. UWAGA: Po doprowadzeniu próbek do wrzenia: Mo na je przechowywaæ w temperaturze od 18 do 33 C nie d³u ej ni 6 godzin i mog¹ zostaæ poddane testowi bez ponownego doprowadzania do wrzenia. Mog¹ byæ przechowywane w temperaturze od 2 do 8 C nie d³u ej ni 3 dni. Przed wykonaniem testu próbki musz¹ zostaæ poddane wirowaniu i ponownej lizie. Mog¹ byæ przechowywane w temperaturze -2 C nie d³u ej ni 14 tyg. Przed wykonaniem testu próbki musz¹ zostaæ rozmro one w temperaturze pokojowej, odwirowane i ponownie doprowadzone do wrzenia. 13. Próbki s¹ gotowe do wykonania procedury testowej BD ProbeTec ET MP Assay (Rozdzia³ G). F. Przygotowanie próbek kontrolnych: Przygotowanie próbek kontrolnych wymazów z gard³a 1. Dla ka dego testowanego cyklu (p³ytki) nale y przygotowaæ jedn¹ probówkê kontroln¹ negatywn¹ (tcf/tmp) i jedn¹ pozytywn¹ (tcf/tmp). Je eli p³ytka zawiera zestawy odczynników o wiêcej ni jednym numerze seryjnym, próbki kontrolne powinny zostaæ przetestowane oddzielnie dla ka dej serii. 2. Zdj¹æ nakrêtkê z probówki kontroli negatywnej (tcf/tmp). 3. Przy u yciu nowej koñcówki pipety dodaæ 1 ml rozcieñczalnika do wymazów. 4. Ponownie szczelnie zamkn¹æ probówkê. 5. Zdj¹æ nakrêtkê z probówki kontroli pozytywnej (tcf/tmp). 6. Przy u yciu nowej koñcówki pipety dodaæ 1 ml rozcieñczalnika do wymazów. 7. Ponownie szczelnie zamkn¹æ probówkê. 8. Mieszaæ zawartoœæ probówek przez 5 sekund. 9. Probówki kontrolne s¹ teraz gotowe do lizy. Zob. Przetwarzanie wymazów z gard³a (Rozdzia³ D). Przygotowanie pod³o a kontrolnego 2SP: 1. Dla ka dego testowanego cyklu (p³ytki) nale y przygotowaæ jedn¹ probówkê kontroln¹ negatywn¹ (CF/LP/MP) i jedn¹ pozytywn¹ (CF/LP/MP). Je eli p³ytka zawiera zestawy odczynników o wiêcej ni jednym numerze seryjnym, próbki kontrolne powinny zostaæ przetestowane oddzielnie dla ka dej serii. 2. Przed u yciem delikatnie odwróciæ Rozcieñczalnik do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o a. 3. Zdj¹æ nakrêtkê z probówki kontroli negatywnej (CF/LP/MP). 4. Przy u yciu nowej koñcówki pipety dla ka dej probówki kontrolnej dodaæ po 2 μl czystej wody do celów biologii molekularnej. 5. Przy u yciu nowej koñcówki pipety dla ka dej probówki kontrolnej dodaæ po 4 μl Rozcieñczalnika do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o a. 6. Ponownie szczelnie zamkn¹æ probówkê. 7. Zdj¹æ nakrêtkê z probówki kontroli pozytywnej (CF/LP/MP). 8. Przy u yciu nowej koñcówki pipety dla ka dej probówki kontrolnej dodaæ po 2 μl czystej wody do celów biologii molekularnej. 9. Przy u yciu nowej koñcówki pipety dla ka dej probówki kontrolnej, dodaæ po 4 μl Rozcieñczalnika do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o a. 1. Ponownie szczelnie zamkn¹æ probówkê. 11. Mieszaæ zawartoœæ probówek przez 5 sekund. 12. Probówki kontrolne s¹ teraz gotowe do doprowadzenia do wrzenia. Zob. Przygotowanie pod³o a 2SP dla próbek (Rozdzia³ E). G. Procedura testowa testu BD ProbeTec ET MP Assay: UWAGA: Przed przyst¹pieniem do procedury testowej próbki badane i kontrolne nale y ustawiæ na stojaku przystosowanym do probówek 2 lub 4 ml, np. statyw BD ProbeTec ET na probówki o pojemnoœci 2 ml lub statyw lizuj¹cy BD ProbeTec ET, kompatybilnymi z pipetorem BD ProbeTec ET. 7

1. Zdj¹æ i wyrzuciæ nakrêtki ze sch³odzonych próbek i probówek kontrolnych. 2. Aby unikn¹æ zanieczyszczenia, przed przyst¹pieniem do dalszej czêœci ZMIENIÆ RÊKAWICZKI. 3. Pos³uguj¹c siê Raportem o uk³adzie p³ytki, przygotowaæ p³ytkê mikrostudzienek Priming Microwell zob. Uk³ad p³ytki (Rozdzia³ C). 4. Ponownie uszczelniæ opakowania mikrostudzienek w nastêpuj¹cy sposób: a. Umieœciæ opakowanie na równej powierzchni. Jedn¹ rêk¹ trzymaæ otwarty koniec p³ytki. b. Naciskaj¹c p³ytkê, przesuwaæ palec wzd³u zewnêtrznej strony uszczelnienia, poruszaj¹c siê od jednej do drugiej krawêdzi opakowania. c. Sprawdziæ, czy opakowanie zosta³o uszczelnione. 5. Wybraæ Program 1 na pipetorze BD ProbeTec ET. 6. Pobraæ koñcówki do pipety. Rozwin¹æ pipetor systemu BD ProbeTec ET przez ca³kowite wyci¹gniêcie pokrêt³a regulacyjnego. UWAGA: Aby unikn¹æ przecieku, nale y siê upewniæ, e koñcówki s¹ pewnie umocowane na pipetorze. 7. Pobraæ 2 μl z pierwszej kolumny próbek. 8. Naciskaj¹c delikatnie pipetor, dotkn¹æ koñcówkami pipet œcianek studzienek i wprowadziæ 15 μl roztworu do odpowiedniej kolumny mikrostudzienek do zalewania cieczy, (1 A H). UWAGA: Nie nale y naciskaæ pipetora nad próbkami ani mikrostudzienkami, poniewa mo e to spowodowaæ zanieczyszczenie. Wykonywanie gwa³townych ruchów mo e spowodowaæ powstawanie kropelek i aerozoli. 9. Wyrzuciæ koñcówki. Wcisn¹æ przycisk spustowy pipetowania w celu wyzerowania pipetora. UWAGA: Koñcówki nale y wyrzucaæ ostro nie, aby unikn¹æ powstawania kropelek i aerozoli mog¹cych powodowaæ zanieczyszczenie miejsca pracy. 1. Pobraæ nowe koñcówki, rozwin¹æ pipetor i pobraæ 2 μl z drugiej kolumny próbek. 11. Naciskaj¹c delikatnie pipetor, dotkn¹æ koñcówkami pipet œcianek studzienek i wprowadziæ 15 μl roztworu do odpowiedniej kolumny mikrostudzienek do zalewania cieczy, (2 A H). 12. Wyrzuciæ koñcówki. 13. Kontynuowaæ przenoszenie pozosta³ych próbek przeznaczonych do danego cyklu. 14. Przykryæ p³ytkê Priming Microwell pokryw¹ Priming Cover i pozostawiæ do inkubacji w temperaturze pokojowej na co najmniej 2 minut. (Maksymalnie do 6 godzin). UWAGA: Zamkn¹æ przygotowane próbki nowymi nakrêtkami. ZMIENIÆ RÊKAWICZKI. 15. Pod koniec inkubacji p³ytki Priming Microwell przygotowaæ p³ytkê Amplification Microwell. Rozmieœciæ mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji na p³ytce w sposób odpowiadaj¹cy Raportowi o uk³adzie p³ytki, (podobnie jak w przypadku p³ytki priming). Ponownie uszczelniæ opakowanie mikrostudzienek zgodnie z procedur¹ opisan¹ w kroku 4. 16. Zdj¹æ pokrywê z p³ytki Priming Microwell i przenieœæ p³ytkê do bloku grzewczego Priming Heater. W celu wstêpnego ogrzania NATYCHMIAST umieœciæ p³ytkê Amplification Microwell w bloku grzewczym Warming Heater. 17. Ustawiæ minutnik na 1 minut. (UWAGA: Dla tego kroku czas ma zasadnicze znaczenie). 18. Pod koniec 1 (±1)-minutowej inkubacji wybraæ na pipetorze Program 5. 19. Pobraæ koñcówki do pipety i przenieœæ 1 μl z kolumny 1 p³ytki Priming Microwell do kolumny 1 p³ytki Amplification Microwell. Wprowadziæ p³yn, dotykaj¹c koñcówkami pipety œcianek studzienek. Po zakoñczeniu dozowania p³ynu odczekaæ, a pipetor automatyczne zmiesza ciecz w studzienkach. Delikatnie przenieœæ pipetor poza p³ytkê. Unikaæ dotykania innych studzienek. 2. Wyrzuciæ koñcówki. Pobraæ nowe koñcówki i kontynuowaæ przenoszenie mieszaniny reakcyjnej z mikrostudzienek do zalewania cieczy do mikrostudzienek przeznaczonych do amplifikacji, kolumna po kolumnie, u ywaj¹c nowych koñcówek dla wszystkich kolejnych kolumn. 21. Po przeniesieniu wszystkich kolumn usun¹æ podklejkê z uszczelki Amplification Sealer (Jedna uszczelka (1/2) pozwala na zakrycie maksymalnie 6 kolumn. Je eli stosuje siê wiêcej ni 6 kolumn, KONIECZNE jest u ycie pe³nego arkusza uszczelek). Trzymaj¹c brzegi uszczelki, na³o yæ uszczelkê na mikrostudzienki. Przy nak³adaniu uszczelki nale y stosowaæ wskazówki dotycz¹ce bloku grzewczego. Docisn¹æ uszczelkê w celu zapewnienia ca³kowitego uszczelnienia wszystkich mikrostudzienek. 22. W interfejsie u ytkownika urz¹dzenia BD ProbeTec ET wysun¹æ stojak, otworzyæ drzwiczki i unieœæ pokrywê p³ytki. NATYCHMIAST (w ci¹gu 3 sekund) przenieœæ uszczelnion¹ p³ytkê Amplification Microwell do aparatu BD ProbeTec ET i rozpocz¹æ cykl. (Szczegó³owe instrukcje znajduj¹ siê w podrêczniku u ytkownika Systemu BD ProbeTec ET.) 8

23. Po rozpoczêciu cyklu nale y postêpowaæ zgodnie z nastêpuj¹cymi procedurami porz¹dkowymi: a. Uszczelniæ mikrostudzienki do zalewania cieczy uszczelk¹ Amplification Sealer i wyj¹æ p³ytkê z bloku grzewczego Priming and Warming Heater. OSTRZE ENIE: Do wyjmowania p³ytki u ywaæ rêkawicy termoodpornej temperatura p³ytki przekracza 7 C. b. Odczekaæ 5 minut, pozostawiaj¹c p³ytkê na blacie do sch³odzenia. c. Usun¹æ uszczelnienie mikrostudzienek do zalewania cieczy z p³ytki trzymaj¹c uszczelki z obu stron i unosz¹c studzienki w ca³oœci ku górze. Umieœciæ uszczelnione mikrostudzienki w torebce na odpady i uszczelniæ. d. Wyczyœciæ metalow¹ p³ytkê: Sp³ukaæ p³ytkê roztworem podchlorynu sodu o stê eniu 1% (v/v) roztwór Alconox. Sp³ukaæ p³ytkê wod¹. Przed ponownym u yciem nale y zawin¹æ p³ytkê w czysty papierowy rêcznik i pozostawiæ do ca³kowitego wyschniêcia. 24. Po zakoñczeniu cyklu zostanie utworzony wydruk zawieraj¹cy wyniki testu. 25. Przesun¹æ stojak p³ytki, otworzyæ drzwiczki i wyj¹æ p³ytkê. Zamkn¹æ drzwiczki i ponownie umieœciæ p³ytkê wewn¹trz aparatu. 26. Usun¹æ z p³ytki uszczelnione mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji. PRZESTROGA: W adnym wypadku nie usuwaæ z mikrostudzienek materia³u uszczelniaj¹cego. Uszczelnione mikrostudzienki mo na ³atwo usun¹æ w ca³oœci, trzymaj¹c uszczelkê z góry i z do³u oraz podnosz¹c p³ytkê prosto do góry i na zewn¹trz. Umieœciæ uszczelnione mikrostudzienki w torebce na odpady. Szczelnie zamkn¹æ torebkê. 27. Wyczyœciæ metalow¹ p³ytkê: Sp³ukaæ p³ytkê 1% roztworem podchlorynu sodu (v/v) roztwór Alconox. Sp³ukaæ p³ytkê wod¹. Przed ponownym u yciem nale y zawin¹æ p³ytkê w czysty papierowy rêcznik i pozostawiæ do ca³kowitego wyschniêcia. 28. Po zakoñczeniu ostatniego cyklu danego dnia nale y wykonaæ nastêpuj¹ce procedury porz¹dkowe: a. Nas¹czyæ papierowe rêczniki lub gaziki 1% roztworem podchlorynu sodu (v/v) z roztworem Alconox, nastêpnie zastosowaæ je do mycia blatów i zewnêtrznych powierzchni cieplarki lizuj¹cej, bloku grzewczego, stojaka na probówki, ³aŸni wodnej, wirówki oraz aparatu BD ProbeTec ET. Pozostawiæ roztwór na powierzchniach przez 2 3 minuty. Nas¹czyæ wod¹ rêczniki papierowe lub gaziki i usun¹æ roztwór czyszcz¹cy. Podczas nak³adania roztworu czyszcz¹cego lub sp³ukiwania wod¹ nale y czêsto wymieniaæ rêczniki lub gaziki. Zwil yæ rêcznik papierowy lub gazik 1% roztworem podchlorynu sodu (v/v) z preparatem Alconox i wytrzeæ rêkojeœæ pipetora (JEDYNIE RÊKOJEŒÆ). Po 2 3 minutach wytrzeæ rêkojeœæ zwil onymi wod¹ rêcznikami papierowymi lub gazikami. b. Zanurzyæ statyw lityczny, jego podstawê, pokrywê oraz p³ytki lub stojak ³aŸni wodnej w 1% roztworze podchlorynu sodu (v/v) z preparatem Alconox na 1 2 minuty. Dok³adnie sp³ukaæ wod¹ i wysuszyæ na powietrzu. c. Na³adowaæ ponownie pipetor. d. Szczelnie zamkniête torebki na odpady i odpady ska one mikrobiologicznie nale y usuwaæ zgodnie z przyjêtymi procedurami usuwania zanieczyszczonego materia³u odpadowego. 29. Co najmniej raz w tygodniu przeprowadzaæ nastêpuj¹ce procedury: a. Usuwaæ wodê z ³aŸni wodnych. b. Czyœciæ ³aŸnie wodne 1% roztworem podchlorynu sodu (v/v) z preparatem Alconox. Sp³ukaæ wod¹ i wysuszyæ na powietrzu. c. Nape³niæ ponownie wod¹ destylowan¹. Kontrola jakoœci Nale y postêpowaæ zgodnie z obowi¹zuj¹cymi wymogami kontroli jakoœci, wynikaj¹cymi z przepisów miejscowych, krajowych i (lub) federalnych, wymogami akredytacji i rutynowymi procedurami kontroli jakoœci w danym laboratorium. Zaleca siê, aby u ytkownik stosowa³ siê do odpowiednich wytycznych CLSI (dawniej NCCLS) i przepisów CLIA, dotycz¹cych sposobów kontroli jakoœci. Rozcieñczalnik do wymazów i próbki kontrolne s¹ dostarczane ³¹czniew zestawie Swab Diluent and Control Kit (Rozcieñczalnik do wymazów i zestaw próbek kontrolnych) (tcf/tlp/tmp). Rozcieñczalnik do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o a i próbki kontrolne s¹ dostarczane ³¹cznie w zestawie Respiratory and Media Diluent and Control Kit (Rozcieñczalnik do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o a i zestaw kontrolny) (CF/ LP/MP). W ramach ka dego rodzaju próbek/testu na p³ytce, a tak e dla ka dego nowego numeru seryjnego zestawu odczynników, nale y stosowaæ jedn¹ kontrolê pozytywn¹ i jedn¹ negatywn¹. Próbki mo na umieszczaæ w sposób losowy. Kontrola pozytywna s³u y do monitorowania defektu odczynników. Kontrola negatywna s³u y do monitorowania zanieczyszczenia odczynników i/lub otoczenia. Aby podawaæ wyniki 9

negatywnej. Je eli wyniki kontroli ró ni¹ siê od oczekiwanych, cykl testu uwa a siê za niewa ny, a aparat nie przedstawi wyników oznaczenia próbek pochodz¹cych od pacjentów. Je eli cykl próbek kontrolnych nie osi¹gnie spodziewanych wyników, nale y powtórzyæ ca³y cykl z zastosowaniem nowego zestawu próbek kontrolnych, nowych mikrostudzienek i przetwarzanych próbek. Jeœli podczas powtórnego testu obecne s¹ resztki przetwarzanej próbki, nale y ponownie przeprowadziæ test przy u yciu innej porcji materia³u, pochodz¹cej z poprzedniej próbki. Je eli powtórna kontrola jakoœci nie przyniesie spodziewanych wyników, nale y skontaktowaæ siê z obs³ug¹ techniczn¹ (zob. Interpretacja wyników ). Wewnêtrzna kontrola amplifikacji (Internal Amplification Control, IAC) jest wbudowana do mikrostudzienek Priming Microwell. Wewnêtrzna kontrola amplifikacji (IAC) zawiera docelowy kwas nukleinowy, amplifikowany w obecnoœci macierzy próbki. Wewnêtrzna kontrola amplifikacji (IAC) jest przeznaczona do potwierdzania wiarygodnoœci reakcji amplifikacji oraz identyfikacji czynników hamuj¹cych amplifikacjê, zawartych w przetwarzanej próbce. Kontrole przetwarzanych próbek Kontrole przetwarzanych próbek mog¹ byæ testowane zgodnie z wymaganiami odpowiednich akredytowanych organizacji. Zarówno kontrole negatywne, jak i pozytywne powinny sprawdzaæ ca³y system testowy. W tym celu próbki o znanym wyniku dodatnim mog¹ s³u yæ jako kontrola w stosunku do poddawanych przetwarzaniu i testowaniu nieznanych próbek. Próbki s³u ¹ce jako kontrola procesu przetwarzania musz¹ byæ przetwarzane i testowane zgodnie z wk³adk¹ produktu. Próbki kontrolne pozytywne i negatywne s³u ¹ do kontroli efektywnoœci procedur przetwarzania próbek podczas testowania wymazów z gard³a (z pod³o em transportowym i bez niego; odpowiednio Próbka kontrolna wymazówki oraz Próbek kontrolnych z uk³adu oddechowego i pod³o a), dlatego e s¹ one przetwarzane w podobny sposób jak próbki badane. Monitorowanie w kierunku zanieczyszczenia DNA Co najmniej raz w miesi¹cu nale y przeprowadziæ nastêpuj¹c¹ procedurê testow¹, s³u ¹c¹ do monitorowania miejsca pracy i powierzchni oprzyrz¹dowania pod k¹tem zanieczyszczenia DNA. Monitorowanie otoczenia ma podstawowe znaczenie dla wykrycia zanieczyszczenia, jeszcze przed pojawieniem siê problemu. 1. W przypadku ka dej powierzchni* poddawanej testowi nale y stosowaæ wymazówki BBL CultureSwab EZ. 2. Dla ka dej powierzchni, z której bêdzie pobierany wymaz, nale y oznakowaæ probówkê, a nastêpnie do ka dej probówki za pomoc¹ pipety przenieœæ po 1 ml rozcieñczalnika do wymazów (tcf/tmp). 3. Zanurzyæ pierwsz¹ wymazówkê w rozcieñczalniku, a nastêpnie szerokim ruchem przetrzeæ pierwsz¹ badan¹ powierzchniê. 4. Zamieszaæ wymazówk¹ w rozcieñczalniku, wycisn¹æ wymazówkê, ponownie zamkn¹æ probówkê i mieszaæ przez 5 sekund. Wyrzuciæ wymazówki. 5. Powtórzyæ czynnoœci dla ka dej powierzchni, z której pobiera siê wymaz. 6. Umieœciæ probówki w statywie litycznym i ogrzewaæ w cieplarce lizuj¹cej przez 1 minut. Wyj¹æ statyw z cieplarki i przed kontynuowaniem odczekaæ 15 minut, a próbki siê och³odz¹. 7. W trakcie podgrzewania probówek, za pomoc¹ czystych, nas¹czonych wod¹ rêczników, nale y usun¹æ pozosta³oœci mieszaniny buforów z powierzchni, z których pobierano wymazy. 8. Po och³odzeniu próbek nale y postêpowaæ zgodnie z procedur¹ testow¹ dotycz¹c¹ testu BD ProbeTec ET MP Assay (Rozdzia³ G). *Testowania wymagaj¹ nastêpuj¹ce obszary: Powierzchnie statywu litycznego, cieplarka lizuj¹ca, stojak ³aŸni wodnej, mikrowirówka, blok grzewczy Priming and Warming Heater, czarne p³ytki z mikrostudzienkami, rêkojeœæ pipetora, przyciski aparatu, klawiatura aparatu, suche powierzchnie ³aŸni wodnej, powierzchnie stojaka na próbki, blat sto³u doœwiadczalnego w³¹cznie z obszarem przetwarzania próbek. Je eli wynik danej powierzchni jest dodatni, nale y j¹ wyczyœciæ, stosuj¹c œwie y roztwór podchlorynu sodu o stê eniu 1% (v/v) z preparatem Alconox. Dopilnowaæ, by ca³a powierzchnia zosta³a zwil ona roztworem czyszcz¹cym, nastêpnie pozostawiæ roztwór czyszcz¹cy na powierzchni przez co najmniej 2 minuty lub do czasu jego wyschniêcia. Je eli to konieczne, za pomoc¹ czystego rêcznika nale y usun¹æ nadmiar roztworu czyszcz¹cego. Wytrzeæ powierzchniê czystym rêcznikiem nas¹czonym wod¹ i pozostawiæ do wyschniêcia. Wykonaæ ponowny test danej powierzchni. Powtarzaæ a do uzyskania negatywnego wyniku. Je eli nie udaje siê usun¹æ zanieczyszczenia, w celu uzyskania dalszych instrukcji nale y siê skontaktowaæ z obs³ug¹ techniczn¹. INTERPRETACJA WYNIKÓW Obecnoœæ w³aœciwego dla M. pneumoniae DNA lub jego brak oznacza siê przez obliczenie dla próbki punktacji PAT (Passes After Threshold), opartej na znanych wartoœciach progowych. Punktacja PAT jest systemem metrycznym stosowanym do oceny wielkoœci sygna³u bêd¹cego wynikiem reakcji. W tym systemie wiêksze liczby wskazuj¹, e próg zosta³ osi¹gniêty we wczesnej fazie amplifikacji, natomiast mniejsze liczby oznaczaj¹ póÿniejsze osi¹gniêcie progu w przebiegu reakcji. Wielkoœæ punktacji PAT nie odzwierciedla iloœci materia³u DNA bakterii M. pneumoniae zawartej w próbce. 1

Jeœli test próbki kontrolnej nie powiód³ siê, nie nale y podawaæ wyników pacjentów. W celu zapoznania siê z prawid³owymi wartoœciami próbek kontrolnych, zob. rozdzia³ Kontrola jakoœci. Wyniki podawane s¹ w nastêpuj¹cy sposób: Punktacja PAT Docelowe MP Docelowe IAC Wynik Interpretacja Raport > > lub = Pozytywny Przy zastosowaniu technologii SDA wykryto DNA bakterii M. pneumoniae Wynik pozytywny dla bakterii gatunku M. pneumoniae sugeruje aktualne lub przebyte zaka enie. = > Negatywny Przy zastosowaniu technologii SDA nie wykryto DNA bakterii M. pneumoniae. Wynik prawdopodobnie negatywny dla M. pneumoniae. Nie mo na wykluczyæ zaka enia bakteri¹ M. pneumoniae, poniewa stê enie DNA w próbce mo e byæ ni sze ni wykrywane przez test. = = Wynik nieokreœlony Kontrola amplifikacji zatrzymana. Aby zinterpretowaæ test, wymagane jest wykonanie dodatkowych badañ. a a Powtórzyæ test BD ProbeTec ET MP Assay z probówki przetwarzanej probki. Je eli w probówce znajduje siê niewystarczaj¹ca iloœæ materia³u, nale y powtórzyæ test, wykorzystuj¹c oryginaln¹ próbkê lub, w razie potrzeby, u yæ nowej. Je eli wynik powtórnego badania jest pozytywny lub negatywny, nale y go interpretowaæ w sposób przedstawiony powy ej. Jeœli wynik jest ponownie nieokreœlony, nale y zastosowaæ now¹ próbkê. Okreœlanie Progu MP I IAC: Wartoœci progowe docelowego DNA bakterii M. pneumoniae oraz wewnêtrznej kontroli amplifikacji IAC zosta³y okreœlone przy u yciu krzywej ROC (Receiver Operator Characteristic), analizuj¹cej dane otrzymane z kontroli pozytywnej i negatywnej. Niniejsze wartoœci progowe zosta³y zweryfikowane i poddane walidacji w badaniach klinicznych. OGRANICZENIA PROCEDURY 1. Test BD ProbeTec ET MP Assay zosta³ zbadany jedynie dla wymazów z gard³a (z pod³o em transportowym 2SP lub bez niego). Nie oceniano wydajnoœci w odniesieniu do innych typów próbek. 2. Test BD ProbeTec ET MP Assay zosta³ zbadany jedynie dla pacjentów powy ej pierwszego roku ycia. 3. Podobnie jak w przypadku innych testów diagnostycznych, tak e wyniki testu BD ProbeTec ET MP Assay nale y interpretowaæ w po³¹czeniu z innymi danymi laboratoryjnymi i klinicznymi dostêpnymi dla lekarza. Pozytywny wynik niniejszego testu, wraz z innymi objawami klinicznymi i oznakami diagnostycznymi zapalenia p³uc, wskazuje na zapalenie p³uc wywo³ane bakteriami z gatunku Mycoplasma pneumoniae. 4. Wynik negatywny nie wyklucza rozpoznania zapalenia p³uc wywo³anego bakteriami z gatunku Mycoplasma pneumoniae, poniewa mo e on byæ spowodowany nieprawid³owym pobraniem próbki, b³êdem technicznym, pomyleniem próbki, jednoczesnym stosowaniem antybiotykoterapii lub obecnoœci¹ materia³u DNA bakterii Mycoplasma pneumoniae w iloœci mniejszej, ni wynosi czu³oœæ analityczna testu. Dlatego zaleca siê zastosowanie dodatkowych metod diagnostycznych, takich jak hodowla, metody serologiczne i/lub atestowany test amplifikacji kwasów nukleinowych. 5. Test BD ProbeTec ET MP Assay nie mo e byæ stosowany w celu kontroli skutecznoœci terapii przeciwbakteryjnej, poniewa nawet po zastosowaniu skutecznego leczenia mog¹ byæ dalej obecne kwasy nukleinowe bakterii M. pneumoniae. 6. Osi¹gniêcie optymalnej wydajnoœci oznaczenia wymaga odpowiedniego pobierania próbek i postêpowania z nimi. 7. Test BD ProbeTec ET MP Assay mo e byæ wykonywany jedynie przez personel przeszkolony w zakresie procedury testu i systemu BD ProbeTec ET. 8. Test BD ProbeTec ET MP Assay dostarcza wyników jakoœciowych. Nie istnieje zwi¹zek pomiêdzy wielkoœci¹ wyniku PAT a znajduj¹c¹ siê próbce iloœci¹ DNA M. pneumoniae. 11

OCZEKIWANE WYNIKI A: Chorobowoœæ Liczba wyników pozytywnych obserwowana w testach w kierunku bakterii M. pneumoniae ró ni siê w zale noœci od zastosowanej metody, wieku pacjenta, podstawowych czynników ryzyka, lokalizacji geograficznej oraz, co najwa niejsze, chorobowoœci na danym obszarze. B: Rozk³ad czêstoœci punktacji PAT Badanie prospekywne Uwaga: Wszystkie wyniki testu BD ProbeTec ET MP Assay zosta³y porównane z wynikami hodowli wymazów z gard³a na pod³o u transportowym SP-4. W celu uzyskania szczegó³owego opisu planu badania klinicznego zob. rozdzia³ Charakterystyka wydajnoœciowa. Do badania nad testem BD ProbeTec ET MP Assay zebrano 316 wymazów z gard³a (przechowywanych bez pod³o a transportowego), uzyskanych prospektywnie od 316 pacjentów z siedmiu oœrodków klinicznych w Stanach Zjednoczonych Ameryki Pó³nocnej i Kanady. Rysunek 1 przedstawia rozk³ad czêstoœci pocz¹tkowej punktacji MP PAT w porównaniu z wynikami hodowli. Szeœædziesi¹t cztery spoœród pobranych prospektywnie i posianych na pod³o u transportowym 2SP wymazów z gard³a zosta³o tak e zbadanych za pomoc¹ testu BD ProbeTec ET MP Assay. Rysunek 2 przedstawia rozk³ad czêstoœci pocz¹tkowej punktacji MP PAT w porównaniu z wynikami hodowli. Badanie retrospektywne Siedemdziesi¹t osiem pobranych retrospektywnie wymazów z gard³a, posianych na pod³o e transportowe 2SP i przechowanych w postaci zamro onej, zosta³o przetestowanych testem BD ProbeTec ET MP Assai w oœrodkach klinicznych w Europie. Rysunek 3 przedstawia rozk³ad czêstoœci pocz¹tkowej punktacji MP PAT w porównaniu z wynikami oryginalnej hodowli. Rozk³ad czêstoœci pocz¹tkowej punktacji MP PAT w porównaniu z oryginalnym wynikiem PCR tych samych próbek przedstawia Rysunek 4. Rysunek 1: Rozk³ad czêstoœci punktacji MP PAT Porównanie wyników wymazów z gard³a pobranych prospektywnie (bez pod³o a transportowego) z wynikami hodowli Czêstoœæ 35 3 25 2 15 1 5 313 (-) (+) 1 1-19 2-39 4-6 Punktacja PAT MP 2 Hodowla Hodowla + Wynik hodowl 1-19 2-39 4-6 Razem Negatywny 313 2 315 Pozytywny 1 1 Razem 314 2 316 12

Rysunek 2: Rozk³ad czêstoœci punktacji MP PAT Porównanie wyników wymazów z gard³a pobranych prospektywnie (pod³o e 2SP) z wynikami hodowli 7 6 62 5 Czêstoœæ 4 3 2 (-) (+) Hodowla Hodowla+ 1 1 1 Punktacja PAT MP Wynik hodowl 1-19 2-39 4-6 Razem Negatywny 62 1 63 Pozytywny 1 1 Razem 63 1 64 Rysunek 3: Rozk³ad czêstoœci punktacji MP PAT Porównanie wyników wymazów z gard³a pobranych retrospektywnie (pod³o e 2SP) z wynikami hodowli (pod³o e 2SP) 14 12 12 1 Czêstoœæ 8 6 4 3 (-) (+) 3 Hodowla Hodowla + 2 1 1-19 2-39 4-6 Punktacja PAT MP Wynik hodowl 1-19 2-39 4-6 Razem Negatywny Pozytywny 3 1 3 12 19 Razem 3 1 3 12 19 Rysunek 4: Rozk³ad czêstoœci punktacji MP PAT Porównanie wyników wymazów z gard³a pobranych retrospektywnie (pod³o e 2SP) z wynikami testu PCR (pod³o e 2SP) 45 4 39 35 Czêstoœæ 3 25 2 15 1 5 15 11 (-) (+) 4 9 PCR - PCR + 1-19 2-39 4-6 Punktacja PAT MP 13

Wynik PCR 1-19 2-39 4-6 Razem Negatywny 15 15 Pozytywny 11 4 9 39 63 Razem 26 4 9 39 78 C. Próbki kontrolne Podczas badania klinicznego wszystkie z 47 cykli zosta³y przeprowadzone przy u yciu próbek kontrolnych z uk³adu oddechowego i pod³o a (CF/LP/MP). Wszystkie cykle uzyska³y zadowalaj¹ce wyniki kontroli. Wszystkie z 78 cykli zosta³y przeprowadzone przy u yciu próbek kontrolnych wymazów (tcf/tmp). WskaŸnik nieprawid³owych cykli w przypadku wymazów z gard³a wyniós³ 2,6% (2/78). W przypadku dwóch cykli zanotowano nieprawid³owoœci kontroli; w jednym zarówno próbek pozytywnych, jak i negatywnych, w drugim jedynie próbek negatywnych. Jeden z nich by³ spowodowany b³êdem procedury, drugi b³êdem operatora, który nie zastosowa³ siê do instrukcji mieszania próbek kontrolnych zawartej w ulotce do³¹czonej do opakowania testu BD ProbeTec ET MP Assay. Punktacja PAT dla próbek kontrolnych CF/LP/MP oraz tcf/tmp zosta³a podsumowana odpowiednio w tabelach 1 i 2. Tabela 1: Zestawienie punktacji PAT MP dla próbek kontrolnych z uk³adu oddechowego i pod³o a (CF/LP/MP) Kontrola N Zakres 5 percentyl Œrednia Mediana 95 percentyl Negatywny MP 47 - Pozytywny MP 47 21,7-49.9 27,5 42,2 44,2 48,5 Tabela 2: Zestawienie punktacji PAT MP dla próbek kontrolnych wymazów (tcf/tmp) Kontrola N Zakres 5 percentyl Œrednia Mediana 95 percentyl Negatywny MP 76 - Pozytywny MP 77 21-51,6 34,7 45,4 46,4 5,4 CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŒCIOWA Badanie prospektywne Test BD ProbeTec ET MP Assay, zosta³ poddany w latach 22 23, w okresie zwiêkszonej zapadalnoœci na choroby uk³adu oddechowego, prospektywnemu badaniu w siedmiu oœrodkach klinicznych w Stanach Zjednoczonych Ameryki Pó³nocnej i Kanadzie. Wymienione oœrodki kliniczne przeprowadzi³y ocenê próbek wymazów z gard³a. Od ka dego pacjenta pobrano wymaz z gard³a (CultureSwab EZ przechowywany bez pod³o a transportowego) oraz wymaz na poliestrowej wymazówce. Wymazy z gard³a (CultureSwab EZ przechowywane bez pod³o a transportowego) zosta³y przetestowane przy u yciu testu BD ProbeTec ET MP Assay systemu BD ProbeTec ET. Po pobraniu wymaz na poliestrowej wymazówce zosta³ zawieszony na pod³o u SP-4 w celu wykonania Mycoplasma hodowli referencyjnej i testów PCR. Nastêpnie wyniki testu BD ProbeTec ET MP Assay uzyskane ze wszystkich prospektywnie pobranych próbek zosta³y porównane z wynikami hodowli na pod³o u SP-4 materia³u z wymazów z gard³a. Ósmy oœrodek kliniczny zosta³ wybrany ze wzglêdu na doœwiadczenie w stosowaniu metod testowania bakterii z gatunku Mycoplasma, w celu przeprowadzenia wszystkich testów referencyjnych z wszystkich w³¹czonych do badania próbek pobranych prospektywnie. Wymaz z gard³a (na poliestrowej wymazówce) od ka dego pacjenta zosta³ posiany na pod³o e transportowe SP-4, nastêpnie pod³o e zosta³o usuniête, a inokulowana fiolka niezw³ocznie umieszczone w temperaturze -7 C. Po otrzymaniu przez referencyjny oœrodek testowy zamro onych, inokulowanych fiolek SP-4 bulion by³ rozmra any i seryjnie rozcieñczany w po ywce bulionowej SP-4. Nastêpnie na agar SP-4 wysiewano odpowiedni¹ iloœæ oryginalnej próbki SP-4 i ka dego roztworu. Wszystkie pozytywne hodowle bulionowe SP-4, podobnie jak mikroorganizmy izolowane na p³ytkach z pod³o em agarowym SP-4, zosta³y zidentyfikowane metod¹ PCR dla genu M. pneumoniae 16S rrna jako M. pneumoniae. Wszystkie próbki, które da³y wyniki nieokreœlone, zosta³y ponownie przebadane (korzystano z przetworzonej lub oryginalnej próbki, jeœli iloœæ materia³u by³a zbyt ma³a). Próbki, które w pierwotnym i powtórnym (tj. ostatecznym) badaniu da³y wynik nieokreœlony, nie zosta³y w³¹czone do charakterystyki wydajnoœciowej. Próbki, które w pierwotnym badaniu da³y wynik nieokreœlony, a w powtórnym pozytywny lub negatywny, zosta³y w³¹czone do charakterystyki wydajnoœciowej. Próbki, które w pierwszym badaniu da³y wynik nieokreœlony, a badanie nie mog³o byæ powtórzone z powodu niedostatecznej iloœci materia³u, pozosta³y nieokreœlone i nie zosta³y w³¹czone do charakterystyki wydajnoœciowej. Wszystkie spoœród 316 wymazów z gard³a (przechowywanych bez pod³o a transportowego) zosta³y pobrane od 316 pacjentów spe³niaj¹cych kryteria w³¹czenia do badania (tj. oznaki radiologiczne zapalenia p³uc, wiek 1 r.., czas trwania antybiotykoterapii 14 dni, pobranie prawid³owych rodzajów próbek, w³aœciwe przeprowadzenie metod referencyjnych itp.). 14