B ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (ctb) Culture Identification Reagent Pack

Transkrypt

1 B ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (ctb) Culture Identification Reagent Pack 1 U JAA(03) Polski PRZEZNACZENIE Zestaw odczynnikowy do hodowli identyfikacyjnej BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (ctb) Culture Identification Reagent Pack, przeznaczony do stosowania z systemem BD ProbeTec ET opracowano z zastosowaniem metody Strand Displacement Amplification (SDA), w celu identyfikacji szczepów kompleksu Mycobacterium tuberculosis izolowanych z hodowli. STRESZCZENIE I OBJAŒNIENIE Stosowanie sond DNA w celu identyfikacji hodowli pozwala na skrócenie czasu identyfikacji niektórych mykobakterii, np. kompleksu M. tuberculosis, z 1 2 tygodni przy u yciu metod tradycyjnych do poni ej 24 h. 1 Zestaw odczynnikowy do wykrywania kompleksu Mycobacterium tuberculosis (ctb), stosuje siê w systemie BD ProbeTec ET System. W opisywanym systemie diagnostycznym, w badaniu obecnoœci kompleksu Mycobacterium tuberculosis w hodowli zastosowano amplifikacjê przy u yciu techniki homogennej SDA i fluorescencyjnego przekazywania energii. 2-4 Wzrost mo na uzyskaæ na pod³o ach zawieraj¹cych wyci¹g jajka kurzego, agarowych lub p³ynnych pod³o y do hodowli mykobakterii. W sk³ad kompleksu Mycobacterium tuberculosis wchodz¹ gatunki M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, i M. microti. 5,6 ZASADY PROCEDURY W teœcie BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis complex (ctb) wykorzystano jednoczesn¹ amplifikacjê i detekcjê docelowego DNA przy u yciu primerów i sondy detekcyjnej znakowanej zwi¹zkiem fluorescencyjnym. 2-4 Odczynniki SDA suszy siê w dwóch oddzielnych jednorazowych mikrostudzienkach. Przygotowan¹ próbkê dodaje siê do studzienki Priming Microwell zawieraj¹cej primery amplifikacyjne, znakowane fluorescencyjnie sondy detekcyjne i inne odczynniki. Po zakoñczeniu inkubacji mieszaninê reakcyjn¹ przenosi siê do mikrostudzienki Amplification Microwell, zawieraj¹cej dwa enzymy (polimerazê DNA i endonukleazê restrykcyjn¹), konieczne do przeprowadzenia testu SDA. W celu unikniêcia kontaminacji uszczelnia siê studzienki Amplification Microwells, a nastêpnie inkubuje w sterowanym termicznie czytniku fluorescencyjnym monitoruj¹cym przebieg reakcji pod wzglêdem wytwarzania produktów amplifikacji. W przebiegu ka dej reakcji nastêpuje koamplifikacja i detekcja wewnêtrznej kontroli amplifikacji (IAC). Celem IAC jest potwierdzenie wiarygodnoœci reakcji amplifikacji oraz identyfikacji czynników hamuj¹cych amplifikacjê, zawartych w badanej próbce. Wyniki podaje siê na podstawie algorytmu jako dodatnie, ujemne lub nieokreœlone. ODCZYNNIKI I MATERIA Y Ka dy zestaw odczynników BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis complex (ctb) Culture Identification Reagent Pack zawiera: Mikrostudzienki ctb Priming Microwells, 24: 4 Oligonukleotydy 7,6 pmol; dntp 37,6 nmol; sondy detektorowe 30 pmol; oligonukleotydy syntetyczne kopii; Mikrostudzienki ctb Amplification Microwells, 24: Enzym restrykcyjny 25,5 jednostek; polimeraza DNA Polymerase 8 jednostek; odczynniki dntp 10 nmol. Akcesoria: 10 pokrywek, 8 torebek na odpady i 16 uszczelek do amplifikacji. Ka dy zestaw BD ProbeTec ET Mycobacteria Culture Identification (ctb) Sample Processing Kit zawiera: Bufor MCI Wash Buffer ml roztworu zawieraj¹cego mocznik, bufor CAPS Buffer, dimetylosulfotlenek, glicerol i wodorotlenek sodu. Bufor MCI Lysis Buffer 2 50 ml roztworu wodorotlenku potasu. Bufor MCI Neutralization Buffer ml roztworu zawieraj¹cego bicynê, wodorotlenek potasu, dimetylosulfotlenek, glicerol i roztwór œrodka konserwuj¹cego Proclin o stê eniu 0,03%. Ka dy zestaw BD ProbeTec ET Mycobacteria Culture Identification (ctb) Control Set zawiera: Odczynnik do kontroli dodatniej MCI Positive Control po 20 próbek DNA z j¹der ³ososia (suszone, 50 µl) 5 µg i 750 kopii syntetycznego oligonukleotydu M. tuberculosis na ka d¹ reakcjê, w sumie 5250 kopii. Odczynnik do kontroli ujemnej MCI Negative Control po 20 próbek DNA z j¹der ³ososia (50 µl, suszone) 5 µg. Aparatura, wyposa enie i materia³y zu ywalne: Aparat BD ProbeTec ET z p³yt¹, zespó³ bloku grzewczego BD ProbeTec ET, cieplarka BD ProbeTec ET Oven lub cieplarka laboratoryjej ogólnego przeznaczenia mo na ogrzewaæ próbkê do temperatury 101 ± 1 C przez minimum 30 min i maksymalnie 35 min, ³aŸnia ultradÿwiêkowa z wk³adem BD ProbeTec ET, pipetor BD ProbeTec ET z zasilaczem, statyw na probówki o pojemnoœci 2 ml Sample Tube Rack, statyw na probówki Clear Pipetting Rack, nakrêtki i probówki o pojemnoœci 2 ml, nakrêtki na probówki 2 ml i zestaw BD ProbeTec ET Accessories Kit oraz wymazówki CultureSwab EZ Swabs. Materia³y niezbêdne, ale niedostarczane: Mikrowirówka z rotorami zawieraj¹cymi aerozol i standardowymi, osi¹gaj¹ca x g (np. Eppendorf Model 5417C Microcentrifuge), mieszad³o, rêkawiczki jednorazowe, pipety z koñcówkami odpornymi na aerozol (z mo liwoœci¹ pobierania objêtoœci 10 µl, 100 µl, 500 µl, 600 µl i 1 ml, roztwór podchlorynu sodu i preparatu Alconox* o stê eniu 1% (v/v), sterylne pojemniki (nadaj¹ce siê do przechowywania podzielonych objêtoœci 3 buforów MCI Buffers), minutnik, pr¹tkobójczy œrodek odka aj¹cy, poch³aniaj¹ce tampony lub gaziki, kalibrowany termometr. *Dodać 7,5 g preparatu Alconox w przeliczeniu na 1 L 1% (obj./obj.) roztworu podchlorynu sodu (obj./obj.) i wymieszać.

2 Warunki przechowywania i u ytkowania: Zestawy ctb Reagent Packs mo na przechowywaæ w temperaturze 2 33 C. Nie stosowaæ nieotwartych zestawów Reagent Pack po up³ywie daty wa noœci. Po otwarciu opakowania mikrostudzienki zachowuj¹ stabilnoœæ przez okres 4 tygodni, jeœli zosta³y w³aœciwie uszczelnione lub, je eli otwarcie nast¹pi³o wczeœniej, do daty wa noœci. Nie zamra aæ. Odczynniki Mycobacteria Culture Identification (MCI) s³u ¹ce do przygotowania próbek mo na przechowywaæ w temperaturze 2 33 C. Nie stosowaæ odczynników po up³ywie daty wa noœci. Nie zamra aæ. Odczynniki kontrolne Mycobacteria Culture Identification (MCI) Controls mo na przechowywaæ w temperaturze 2 33 C. Nie stosowaæ kontroli po up³ywie daty wa noœci. Nie zamra aæ. OSTRZE ENIA I ŒRODKI OSTRO NOŒCI Do stosowania w diagnostyce in vitro 1. Praca z próbkami i ich przetwarzanie, ³¹cznie z etapem inaktywacji termicznej, powinna odbywaæ siê w kabinie bezpieczeñstwa mikrobiologicznego (BSC, Biological Safety Cabinet) klasy II. Wirowanie próbek przed etapem inaktywacji termicznej nale y wykonywaæ wy³¹cznie z zastosowaniem rotorów zawieraj¹cych aerozol. Rotor zawieraj¹cy aerozol mo na otwieraæ jedynie w BSC. Próbki poddane inaktywacji termicznej mo na poddawaæ wirowaniu poza BSC tylko przy u yciu standardowego rotora. 2. System BD ProbeTec ET zaprojektowano, tak by zmniejszyæ do minimum mo liwoœæ kontaminacji amplikonów; do pracy z systemem BD ProbeTec ET nie s¹ konieczne specjalne strefy robocze. Niemniej jednak, w razie koniecznoœci nale y stosowaæ inne œrodki ostro noœci maj¹ce na celu zapobieganie kontaminacji, a zw³aszcza kontaminacji hodowli w czasie przygotowania lub przenoszenia. 3. Nie zamieniaæ i nie mieszaæ mikrostudzienek, odczynników kontrolnych ani odczynników do przetwarzania próbek, pochodz¹cych z zestawów o ró nych numerach seryjnych. 4. Przestrzegaæ przyjêtych praktyk laboratoryjnych dotycz¹cych usuwania zu ytych koñcówek pipet, probówek na próbki, nakrywek mikrostudzienek i innych odpadów. 5. Do przenoszenia przygotowanych próbek do mikrostudzienek Priming Microwells i przenoszenia próbek z mikrostudzienek Priming Microwells do mikrostudzienek Amplification Microwells, u ywaæ wy³¹cznie pipetora BD ProbeTec ET i koñcówek BD ProbeTec ET. 6. Otwarte opakowania z odczynnikami zawieraj¹ce niewykorzystane mikrostudzienki Priming Microwells i Amplification Microwells MUSZ byæ ponownie starannie uszczelnione. Przed ponownym uszczelnieniem nale y siê upewniæ, e w opakowaniu odczynnikowym znajduje siê œrodek osuszaj¹cy. 7. Przed przeniesieniem p³ytki zawieraj¹cej mikrostudzienki Amplification Microwells z bloku grzewczego BD ProbeTec ET do aparatu BD ProbeTec ET NALE Y je ca³kowicie zakleiæ uszczelk¹ przeznaczon¹ do mikrostudzienek Amplification Microwells. Uszczelnienie jest konieczne w celu unikniêcia kontaminacji aparatu i miejsca pracy produktami amplifikacji. W adnym wypadku nie usuwaæ z mikrostudzienek materia³u uszczelniaj¹cego. 8. Je eli rozmiary p³ytki testowej przekraczaj¹ 6 kolumn (> 48 próbek i odczynników kontrolnych), w celu unikniêcia ewentualnej kontaminacji nale y u yæ CA EGO arkusza materia³u uszczelniaj¹cego mikrostudzienki Amplification Microwells wchodz¹cego w sk³ad zestawu akcesoriów. 9. Aby unikn¹æ kontaminacji œrodowiska pracy produktami amplifikacji, nale y stosowaæ torebki na odpady dostarczone w celu usuwania uszczelnionych mikrostudzienek Amplification Microwells po ukoñczeniu procedury testowej. 10. W celu unikniêcia krzy owej kontaminacji próbek nale y ZMIENIAÆ R KAWICZKI w trakcie wyszczególnionych etapów przetwarzania próbki i procedury testowej. W przypadku kontaktu rêkawiczek z próbk¹, nale y je natychmiast zmieniæ, aby unikn¹æ kontaminacji pozosta³ych próbek. 11. W przypadku kontaminacji miejsca pracy lub aparatury próbkami lub odczynnikami kontrolnymi nale y gruntownie przemyæ strefê kontaminacji roztworem podchlorynu sodu o stê eniu 1% (v/v) z preparatem Alconox i sp³ukaæ dok³adnie wod¹ dejonizowan¹ lub destylowan¹. Przed przyst¹pieniem do dalszych czynnoœci nale y odczekaæ, a powierzchnia bêdzie ca³kowicie sucha. 12. Ca³¹ strefê robocz¹ (powierzchnie blatów i urz¹dzeñ) nale y codziennie zmywaæ roztworem podchlorynu sodu o stê eniu 1% (v/v) z preparatem Alconox. Dok³adnie sp³ukaæ wod¹ dejonizowan¹ lub destylowan¹. Przed przyst¹pieniem do dalszych etapów testu nale y odczekaæ, a powierzchnia bêdzie ca³kowicie sucha. 13. Mikrostudzienki Priming Microwells z pozosta³ym p³ynem (po przeniesieniu p³ynu z mikrostudzienek Priming Microwells do Amplification Microwells) mog¹ stanowiæ Ÿród³o kontaminacji. Przed usuniêciem Priming Microwells nale y starannie uszczelniæ mikrostudzienki. 14. Nie wk³adaæ palców lub d³oni do ³aŸni ultradÿwiêkowej, gdy ultradÿwiêki s¹ W CZONE. W przeciwnym wypadku mo e wyst¹piæ uczucie dyskomfortu i podra nienia skóry oraz uszkodzenie tkanek miêkkich. 15. W celu sprawdzenia temperatury ³aŸni ultradÿwiêkowej Sonic Bath nie nale y stosowaæ termometru rtêciowego. Do tego celu dostarczono termometr cyfrowy. 16. W przypadku wyst¹pienia niecodziennych sytuacji, takich jak wylanie p³ynu do wnêtrza aparatu BD ProbeTec ET lub kontaminacja DNA, której nie mo na siê pozbyæ poprzez mycie, nale y siê skontaktowaæ z obs³ug¹ techniczn¹. 17. W przypadku korzystania z cieplarki laboratoryjnej ogólnego przeznaczenia nale y postêpowaæ zgodnie z odpowiednimi instrukcjami u ytkownika oraz œrodkami ostro noœci. 18. Podczas pracy z próbkami i/lub inaktywacji termicznej nale y stosowaæ zatwierdzone procedury laboratoryjne. 2

3 Uwaga H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. P280 Stosować rękawice ochronne/odzież ochronną/ochronę oczu/ochronę twarzy. P264 Dokładnie umyć po użyciu. P312 W przypadku złego samopoczucia skontaktować się z OS RODKIEM ZATRUC lub z lekarzem. P403+P233 Przechowywać w dobrze wentylowanym miejscu. Przechowywać pojemnik szczelnie zamknięty. P501 Zawartość/pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi/regionalnymi/krajowymi/międzynarodowymi przepisami. Niebezpieczeństwo H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H314 Powoduje poważne oparzenia skóry oraz uszkodzenia oczu. P280 Stosować rękawice ochronne/odzież ochronną/ochronę oczu/ochronę twarzy. P264 Dokładnie umyć po użyciu. P301+P312 W PRZYPADKU POŁKNIĘCIA: W przypadku złego samopoczucia skontaktować się z OS RODKIEM ZATRUC lub z lekarzem. P405 Przechowywać pod zamknięciem. P501 Zawartość/pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi/regionalnymi/ krajowymi/międzynarodowymi przepisami. PROCEDURA PRZYGOTOWANIA HODOWLI UWAGA: Poni sza procedura przygotowania hodowli pozwala na uzyskanie próbki o objêtoœci wystarczaj¹cej do przeprowadzenia trzech testów identyfikacji hodowli. A. Przygotowywanie próbki do testu na zewn¹trz BSC 1. Bufory stosowane do przetwarzania próbki nale y przechowywaæ w temperaturze pokojowej i dok³adnie wymieszaæ przed u yciem. W celu unikniêcia kontaminacji roztworów podstawowych buforów nale y rozdzieliæ bufory w równych i wystarczaj¹cych iloœciach do odpowiednio oznakowanych, sterylnych pojemników, w nastêpuj¹cy sposób: a. Bufor p³ucz¹cy MCI Wash Buffer 1 2 ml na hodowlê na pod³o u sta³ym przeznaczon¹ do testowania, 1 ml na hodowlê na pod³o u p³ynnym przeznaczon¹ do przetwarzania oraz dodatkowe 1 2 ml dla u³atwienia pipetowania. b. Bufor lityczny MCI Lysis Buffer 2 0,1 ml na hodowlê i próby kontrolne oraz dodatkowo 0,5 1 ml dla u³atwienia pipetowania. c. Bufor zobojêtniaj¹cy MCI Neutralization Buffer 3 0,6 ml na hodowlê i próby kontrolne oraz dodatkowo 0,5 1 ml dla u³atwienia pipetowania. d. W celu unikniêcia kontaminacji buforów nie nale y wlewaæ pozosta³oœci buforu z powrotem do butelek. 2. Stosuj¹c etykiety dostarczane z probówkami na próbki nale y oznakowaæ podwójne probówki na próbki 2 ml dla ka dej hodowli na pod³o u sta³ym i jedn¹ probówkê na próbkê 2 ml dla ka dej hodowli na pod³o u p³ynnym. 3. Zdj¹æ nakrêtki z probówek i odpipetowaæ po 1,0 ml buforu p³ucz¹cego MCI Wash Buffer 1 do ka dej z probówek. Ponownie zamkn¹æ probówki. 4. Przenieœæ probówki do BSC. B. Przygotowanie dodatnich hodowli do badania w systemie BD ProbeTec ET ctb wewn¹trz BSC UWAGA: Przed przyst¹pieniem do zlewania p³ynu znad osadu nale y przygotowaæ pojemnik na ska one mikrobiologicznie odpady p³ynne. 1. W celu zmniejszenia pobierania inokulum zawieraj¹cego ró ne drobnoustroje z pod³o y sta³ych nale y dopilnowaæ w³aœciwej obróbki wzrostu hodowli, mieszania w probówce i przygotowania rozcieñczeñ. Dla pod³o y sta³ych nale y wykonaæ nastêpuj¹ce czynnoœci: a. Przenieœæ materia³ z pojedynczej kolonii z p³ytki lub hodowli skoœnej przy u yciu ja³owej plastikowej ezy 1 µl do pierwszej oznakowanej probówki na próbkê, zawieraj¹cej 1 ml buforu MCI Wash Buffer 1. b. Mieszaæ ez¹ w buforze przez 5 s w celu usuniêcia drobnoustrojów z ezy. Odrzuciæ ezê. c. Ponownie mocno zamkn¹æ probówkê na próbkê i mieszaæ przez 5 s. d. Przenieœæ 10 µl z pierwszej probówki na próbkê do drugiej probówki na próbkê u ywaj¹c koñcówki opornej na aerozol. Zamkn¹æ obie probówki. Odrzuciæ pierwsz¹ probówkê na próbkê. e. Dla ka dej hodowli sta³ej powtórzyæ etapy a d. Badanie prowadzi siê na drugiej probówce na próbkê. Przejœæ do etapu Dla pod³o y p³ynnych nale y wykonaæ nastêpuj¹ce czynnoœci: a. Mieszaæ hodowlê w naczyniu przez 5 s w celu uzyskania homogennego roztworu drobnoustrojów w po ywce. Nale y przygotowywaæ jedn¹ hodowlê naraz. b. Pipet¹ zaopatrzon¹ w now¹ koñcówkê oporn¹ na aerozol przenieœæ 500 µl pod³o a p³ynnego do odpowiednio oznaczonej probówki na próbkê, zawieraj¹cej 1 ml buforu p³ucz¹cego MCI Wash Buffer 1. c. Ponownie mocno zamkn¹æ probówkê. d. Dla ka dej hodowli p³ynnej powtórzyæ etapy a c. 3. ZMIENIÆ R KAWICZKI. 3

4 4. Mieszaæ zawartoœæ ka dej probówki na próbkê przez 5 s. 5. Umieœciæ wszystkie probówki w rotorze zawieraj¹cym aerozol, a nastêpnie mocno zamkn¹æ pokrywkê powstrzymuj¹c¹ aerozol. Wytrzeæ zewnêtrzn¹ powierzchniê rotora rêcznikami lub (gaz¹) zwil onymi roztworem przeciwbakteryjnym. 6. Przenieœæ rotor zawieraj¹cy aerozol do mikrowirówki. Wirowaæ próbki przy x g przez 3 min. UWAGA: Nale y zachowaæ opisane warunki wirowania, poniewa niedostateczne odwirowanie próbek mo e prowadziæ do uzyskania wyników fa³szywie ujemnych. 7. Bezpoœrednio po odwirowaniu ostro nie wyj¹æ rotor z mikrowirówki (nie przerywaj¹c szczelnej uszczelki aerozolu) i przenieœæ go ponownie do BSC. 8. Usun¹æ pokrywê powstrzymuj¹c¹ aerozol i natychmiast wyj¹æ próbki z rotora, staraj¹c siê unikaæ ponownego mieszania nads¹czu i osadu. 9. Otworzyæ pierwsz¹ próbkê i zlaæ nads¹cz do pojemnika na ska one mikrobiologicznie odpady p³ynne, w BSC. Odwracaæ probówkê ³agodnym ruchem; na zakoñczenie strzepn¹æ w dó³ odwrócon¹ probówkê. UWAGA: Wraz z up³ywem czasu mo e nastêpowaæ oddzielanie siê osadu. Etapy 7, 8 i 9 nale y wykonywaæ bez opóÿnieñ. 10. Ponownie mocno zatkaæ probówkê i wstawiæ j¹ do statywu na probówki o pojemnoœci 2 ml. 11. Powtórzyæ etapy 9 i 10 dla wszystkich próbek. 12. ZMIENIÆ R KAWICZKI. C.1. Ogrzewanie próbki cieplarka BD ProbeTec ET Oven UWAGI: Nale y dopilnowaæ, by probówki na próbki by³y mocno zamkniête. Przed ogrzaniem próbek w cieplarce, nale y wzrokowo skontrolowaæ nakrêtki probówek i upewniæ siê, e okr¹g³e pierœcienie uszczelniaj¹ce s¹ prawid³owo umiejscowione. Je eli pierœcienie uszczelniaj¹ce s¹ zniekszta³cone lub ich brakuje, nale y zmieniæ nakrêtkê na now¹. Pe³na instrukcja obs³ugi, obejmuj¹ca odpowiednie przestrogi i ostrze enia, znajduje siê w podrêczniku u ytkownika BD ProbeTec ET System. 1. Wstawiæ statyw na próbki o pojemnoœci 2 ml do cieplarki i zamkn¹æ drzwiczki. 2. Wybraæ RUN #01. Wcisn¹æ OK. 3. Wcisn¹æ START w celu rozpoczêcia testu. 4. Po rozpoczêciu testu nale y wykonaæ nastêpuj¹ce czynnoœci: a. Przygotowaæ ³aŸniê ultradÿwiêkow¹ BD ProbeTec ET Sonic Bath, wykonuj¹c nastêpuj¹ce czynnoœci: (1) Umieœciæ wk³ad ³aŸni ultradÿwiêkowej Sonic Bath w jej wnêtrzu. (2) Nape³niæ gor¹c¹ wod¹ z kranu ³aŸniê Sonic Bath do linii Maximum. (UWAGA: Nie stosowaæ wody dejonizowanej.) (3) Ustawiæ temperaturê na 65 C i w³¹czyæ ogrzewacz. (4) Po zamkniêciu pokrywy ³aŸni wodnej w³¹czyæ ³aŸniê ultradÿwiêkow¹ na 60 min (ustawienie domyœlne). b. Umocowaæ w mikrowirówce standardowy rotor. 5. Po 15 min cyklu ogrzewania sprawdziæ temperaturê na zewnêtrznym termometrze cieplarki, by upewniæ siê, e wynosi 95 C. 6. Po zakoñczeniu cyklu ogrzewania aparat wygeneruje sygna³ dÿwiêkowy, a na wyœwietlaczu ciek³okrystalicznym zostanie wyœwietlony komunikat o zakoñczeniu cyklu ( DONE ). Zwolniæ blokadê drzwiczek, wciskaj¹c przycisk DOOR OPEN, a nastêpnie wyj¹æ statyw z probówkami o pojemnoœci 2 ml. UWAGA: Wszystkie pr¹tki obecne w probówkach z próbkami s¹ unieszkodliwione (pozbawione ywotnoœci), dlatego nastêpne etapy mog¹ mieæ miejsce na zewn¹trz BSC. Próbki nale y jednak traktowaæ jak potencjalne Ÿród³o ska enia mikrobiologicznego. C.2. Ogrzewanie próbki cieplarka ogólnego przeznaczenia UWAGI: Nale y dopilnowaæ, by probówki na próbki by³y mocno zamkniête. Przed ogrzaniem próbek w cieplarce nale y wzrokowo skontrolowaæ nakrêtki probówek i upewniæ siê, e okr¹g³e pierœcienie uszczelniaj¹ce s¹ prawid³owo umiejscowione. Je eli pierœcienie uszczelniaj¹ce s¹ zniekszta³cone lub ich brakuje, nale y zmieniæ nakrêtkê na now¹. Pe³na instrukcja obs³ugi obejmuj¹ca odpowiednie przestrogi i ostrze enia znajduje siê w podrêczniku u ytkownika cieplarki. 1. Wstawiæ statyw na próbki o pojemnoœci 2 ml do cieplarki i zamkn¹æ drzwiczki. 2. Temperatura próbki musi osi¹gn¹æ 101 ± 1 C przez minimum 30 min i maksymalnie 35 min. Proszê przestrzegaæ odpowiednich instrukcji dotycz¹cych czasu i temperatury inkubacji. 3. Podczas ogrzewania próbek w cieplarce nale y wykonaæ nastêpuj¹ce czynnoœci: a. Przygotowaæ ³aŸniê ultradÿwiêkow¹ BD ProbeTec ET Sonic Bath wykonuj¹c nastêpuj¹ce czynnoœci: (1) Umieœciæ wk³ad ³aŸni ultradÿwiêkowej Sonic Bath w jej wnêtrzu. (2) Nape³niæ gor¹c¹ wod¹ z kranu ³aŸniê Sonic Bath do linii Maximum. (UWAGA: Nie nale y stosowaæ wody dejonizowanej). (3) Ustawiæ temperaturê na 65 C i w³¹czyæ ogrzewacz. (4) Po zamkniêciu pokrywy ³aŸni wodnej w³¹czyæ ³aŸniê ultradÿwiêkow¹ na 60 min (ustawienie domyœlne). b. Umocowaæ w mikrowirówce standardowy rotor. 4. Po zakoñczeniu cyklu ogrzewania w cieplarce wyj¹æ statyw 2 ml. 4

5 OSTRZE ENIE. Ze statywem próbki nie nale y pracowaæ bez odpowiednich œrodków ochrony osobistej. Zaniechanie tego mo e byæ przyczyn¹ oparzeñ. UWAGA: Wszystkie pr¹tki obecne w probówkach z próbkami s¹ unieszkodliwione (pozbawione ywotnoœci), dlatego nastêpne etapy mog¹ mieæ miejsce na zewn¹trz BSC. Próbki nale y jednak traktowaæ jak potencjalne Ÿród³o ska enia mikrobiologicznego. D. Liza próbki ³aŸnia ultradÿwiêkowa BD ProbeTec ET Sonic Bath OSTRZE ENIE: Nie wk³adaæ palców lub d³oni do ³aŸni ultradÿwiêkowej, gdy ultradÿwiêki s¹ W CZONE. W przeciwnym wypadku mo e wyst¹piæ uczucie dyskomfortu i podra nienia skóry oraz uszkodzenie tkanek miêkkich. OSTRZE ENIE: W celu sprawdzenia temperatury ³aŸni ultradÿwiêkowej nie nale y stosowaæ termometru rtêciowego. Do tego celu dostarczono termometr cyfrowy. UWAGA: Pe³na instrukcja obs³ugi, obejmuj¹ca odpowiednie przestrogi i ostrze enia, znajduje siê w podrêczniku dla u ytkownika BD ProbeTec ET System. 1. Wstawiæ probówki do mikrowirówki ze standardowym rotorem. 2. Zamkn¹æ pokrywê i w³¹czyæ wirówkê na 10 s. 3. Wyj¹æ probówki z wirówki i sprawdziæ obecnoœæ wody na zakrêtkach probówek. W przypadku stwierdzenia skroplenia nale y powtórzyæ wirowanie. 4. Ponownie umieœciæ probówki w statywie 2 ml. 5. Zdj¹æ nakrêtkê z pierwszej probówki. Stosuj¹c pipetor z koñcówk¹ oporn¹ na aerozol, dodaæ do probówki 100 µl buforu MCI Lysis Buffer 2. Ponownie zatkaæ probówkê z próbk¹, mocno dociskaj¹c nakrêtkê. 6. Powtórzyæ procedurê w odniesieniu do wszystkich próbek, w ka dym przypadku stosuj¹c now¹ koñcówkê. 7. ZMIENIÆ R KAWICZKI. 8. Zawartoœæ ka dej probówki nale y mieszaæ przez 5 s. Po ponownym wstawieniu probówek do statywu 2 ml nale y siê upewniæ, czy s¹ one mocno domkniête, a nastêpnie wcisn¹æ probówkê w ten sposób, by wierzch probówki znalaz³ siê we wciêciu otworu statywu. Tak ustawione probówki s¹ poddane maksymalnemu dzia³aniu ultradÿwiêków. 9. WY CZYÆ ultradÿwiêki i upewniæ siê, e poziom wody we wk³adzie ³aŸni mieœci siê pomiêdzy liniami oznaczaj¹cymi poziom minimalny ( Minimum ) i maksymalny ( Maximum ). W zale noœci od potrzeb dodaæ lub odj¹æ gor¹cej wody z kranu. Sprawdziæ temperaturê ³aŸni ultradÿwiêkowej, u ywaj¹c termometru cyfrowego, by upewniæ siê, e wynosi 65 +/- 5 C. Wyj¹æ termometr z ³aŸni. 10. Przenieœæ statyw 2 ml do wk³adu (Sonic Bath Insert). Ponownie zamkn¹æ pokrywê ³aŸni ultradÿwiêkowej. 11. Ustawiæ minutnik ³aŸni ultradÿwiêkowej na 45 min, a nastêpnie W CZYÆ ultradÿwiêki. 12. Po zakoñczeniu sonifikacji WY CZYÆ ³aŸniê z ultradÿwiêkami i wyj¹æ statyw 2 ml. W celu wysuszenia umieœciæ statyw na papierowych poch³aniaj¹cych rêcznikach. E. Zobojêtnianie próbki 1. Wstawiæ probówki do mikrowirówki ze standardowym rotorem. 2. Zamkn¹æ pokrywê i w³¹czyæ wirówkê na 10 s. 3. Wyj¹æ probówki z wirówki i sprawdziæ obecnoœæ wody na zakrêtkach probówek. W przypadku stwierdzenia skroplenia nale y powtórzyæ wirowanie. 4. Wstawiæ probówki do statywu (Clear Pipetting Rack). 5. Zdj¹æ nakrêtkê z pierwszej probówki. Stosuj¹c pipetor z koñcówk¹ odporn¹ na aerozol, dodaæ do probówki 600 µl buforu zobojêtniaj¹cego MCI Neutralization Buffer 3. Ponownie zatkaæ probówkê z próbk¹, mocno dociskaj¹c nakrêtkê. 6. Powtórzyæ procedurê w odniesieniu do wszystkich probówek, w ka dym przypadku stosuj¹c now¹ koñcówkê. 7. ZMIENIÆ R KAWICZKI. 8. Zawartoœæ wszystkich probówek nale y mieszaæ przez 5 s. 9. Odwirowaæ próbki, postêpuj¹c zgodnie z etapami 1 3, wymienionymi powy ej. 10. Ponownie wstawiæ probówki do statywu (Clear Pipetting Rack). 11. Przygotowane w ten sposób próbki analizuje siê przy u yciu metody BD ProbeTec ET System. UWAGA: Je eli badania nie wykonano natychmiast, przygotowane próbki mo na przechowywaæ w nastêpuj¹cy sposób: a. W temperaturze C przez okres do 12 h. b. W temperaturze 2 8 C przez okres do 5 dni. Przed wykonaniem testu próbki nale y wstrz¹saæ przez 5 s i ponownie ogrzaæ w cieplarce BD ProbeTec ET Oven lub cieplarce laboratoryjej ogólnego przeznaczenia mo na ogrzewaæ próbkê do temperatury 101 ± 1 C przez minimum 30 min i maksymalnie 35 min. c. Próbki zamro one w temperaturze -20 C lub ni szej (nie w sposób cykliczny) przez okres do 3 miesiêcy. Przed wykonaniem testu, zamro one próbki nale y odmroziæ w temperaturze pokojowej, wstrz¹saæ przez 5 s i ponownie ogrzaæ w cieplarce BD ProbeTec ET Oven lub cieplarce laboratoryjej ogólnego przeznaczenia mo na ogrzewaæ próbkê do temperatury 101 ± 1 C przez minimum 30 min i maksymalnie 35 min. d. Po ponownym ogrzaniu probówek (zgodnie z etapami b i c opisanymi powy ej) umieœciæ je w mikrowirówce wyposa onej w standardowy rotor. Zamkn¹æ pokrywê i w³¹czyæ wirówkê na 10 s. Wyj¹æ probówki z wirówki i sprawdziæ obecnoœæ wody na zakrêtkach probówek. W przypadku stwierdzenia skroplenia nale y powtórzyæ wirowanie. Wstawiæ probówki do statywu (Clear Pipetting Rack). Gotowe próbki bada siê przy u yciu testów BD ProbeTec ET System. 5

6 PROCEDURA TESTOWA A. Przygotowanie aparatu 1. Przed rozpoczêciem oznaczenia w³¹czyæ aparat i odczekaæ, a osi¹gnie temperaturê robocz¹. a. Blok grzewczy nagrzewa siê i stabilizuje przez oko³o 90 min. Wartoœæ nastawcza sk³adowej (Priming) bloku grzewczego wynosi 72,5 C. Wartoœæ nastawcza sk³adowej (Warming) bloku grzewczego (Priming and Warming Heater) wynosi 54 C. b. Aparat BD ProbeTec ET jest sterowany programowo; czas osi¹gniêcia temperatury roboczej wynosi oko³o 30 min. 2. Przed rozpoczêciem oznaczenia nale y sprawdziæ temperatury bloku grzewczego. Termometr bloku grzewczego Priming powinien wskazywaæ temperaturê C. Termometr bloku grzewczego Warming powinien wskazywaæ temperaturê 53,5 54,5 C. 3. Sprawdziæ temperaturê wyœwietlan¹ na ekranie aparatu BD ProbeTec ET. Powinna ona wynosiæ 47,5 55,0 C. B. Pipetor BD ProbeTec ET Szczegó³owe wyjaœnienia funkcji klawiatury pipetora BD ProbeTec ET Pipettor znajduj¹ siê w podrêczniku dla u ytkownika BD ProbeTec ET System. Do wykonania oznaczenia Mycobacterium tuberculosis complex (ctb) niezbêdne s¹ nastêpuj¹ce programy. Program 1 s³u y do przenoszenia p³ynu z przetworzonych próbek do mikrostudzienek Priming Microwells z ctb. Program 5 s³u y do przenoszenia p³ynu z mikrostudzienek Priming Microwells do mikrostudzienek Amplification Microwells. Zaprogramowaæ pipetor w nastêpuj¹cy sposób: Program 1: 1. W CZYÆ pipetor. Pipetor emituje pojedynczy sygna³ dÿwiêkowy, przez chwilê jest wyœwietlane ZERO i Software Version # (wersja oprogramowania), a nastêpnie jest emitowany kolejny sygna³ dÿwiêkowy. 2. Wcisn¹æ niebieski przycisk Prog (program). Aby wybraæ program 1, nale y wcisn¹æ i przytrzymaæ przycisk Vol (objêtoœæ), a wyœwietli siê 1. Wcisn¹æ Enter. 3. Aby przejœæ do trybu programowania, nale y wcisn¹æ i przytrzymaæ przycisk Prog. Przytrzymuj¹c wciœniêty przycisk Prog, wcisn¹æ specjalny przycisk funkcyjny, u ywaj¹c koñcówki pipety lub spinacza do papieru. 4. Wcisn¹æ Fill (nape³nianie). Wcisn¹æ przycisk strza³ki w górê, a zostanie wyœwietlone 200. Wcisn¹æ Enter. 5. Wcisn¹æ Disp (dozowanie). Wcisn¹æ przycisk strza³ki w górê, a zostanie wyœwietlone 150. Wcisn¹æ Enter. 6. W celu zapisania danych i zakoñczenia programu ponownie wcisn¹æ Enter. Pipetor powinien emitowaæ sygna³ dÿwiêkowy potwierdzaj¹cy zakoñczenie programowania. 7. Zweryfikowaæ program wcisn¹æ przycisk spustowy, by przejrzeæ wszystkie etapy. Po zakoñczeniu poszczególnych etapów nale y ustawiæ prêdkoœæ pobierania/dozowania za pomoc¹ przycisku Vol (objêtoœæ). Na ka dym etapie jest wyœwietlany wskaÿnik szybkoœci (Speed). Stosuj¹c przycisk Vol nastawiæ wskaÿnik prêdkoœci, tak aby wyœwietla³ 2 kwadraty dla etapów Fill (nape³nianie) i Disp (dozowanie) oraz 3 kwadraty dla etapu Purge (opró nianie). Program 5: 1. Wcisn¹æ przycisk Prog (program). Aby wybraæ program 5, nale y wcisn¹æ i przytrzymaæ przycisk Vol, a zostanie wyœwietlone 5. Wcisn¹æ Enter. 2. Aby przejœæ do trybu programowania, nale y wcisn¹æ i przytrzymaæ przycisk Prog. Przytrzymuj¹c wciœniêty przycisk Prog, wcisn¹æ specjalny przycisk funkcyjny, u ywaj¹c koñcówki pipety lub spinacza do papieru. 3. Wcisn¹æ Fill (nape³nianie). Wcisn¹æ przycisk strza³ki w górê, a zostanie wyœwietlone 100. Wcisn¹æ Enter. 4. Wcisn¹æ Disp (dozowanie). Wcisn¹æ przycisk strza³ki w górê, a zostanie wyœwietlone 100. Wcisn¹æ Enter. 5. Wcisn¹æ Mix (mieszanie). Wcisn¹æ przycisk strza³ki w górê, a zostanie wyœwietlone 50. Wcisn¹æ Enter. 6. W celu zapisania danych i zakoñczenia programu ponownie wcisn¹æ Enter. Pipetor powinien emitowaæ sygna³ dÿwiêkowy potwierdzaj¹cy zakoñczenie programowania. 7. Zweryfikowaæ program wcisn¹æ przycisk spustowy, by przejrzeæ wszystkie etapy. Po zakoñczeniu poszczególnych etapów nale y ustawiæ prêdkoœæ pobierania, dozowania i mieszania za pomoc¹ przycisku Vol (objêtoœæ). Na ka dym etapie jest wyœwietlany wskaÿnik szybkoœci (Speed). Stosuj¹c przycisk Vol, nastawiæ wskaÿnik szybkoœci, tak aby wyœwietla³ 2 kwadraty dla etapów pobierania i dozowania. Stosuj¹c przycisk Vol, nastawiæ wskaÿnik szybkoœci, tak by wyœwietla³ 3 kwadraty. Przegl¹d programów Przed rozpoczêciem procedury nale y dokonaæ przegl¹du programów. W celu dokonania przegl¹du programów nale y W CZYÆ pipetor. Wcisn¹æ niebieski przycisk Prog (program). Wcisn¹æ i przytrzymaæ przycisk Vol (objêtoœæ), a zostanie wyœwietlony numer w³aœciwego programu. Wcisn¹æ przycisk Enter. Aby przejœæ przez wszystkie etapy programu, wcisn¹æ przycisk spustowy pipetora. Program 1: Program obejmuje pobieranie 200 µl i dozowanie 150 µl. Na wyœwietlaczu pipetora powinny byæ wyœwietlane nastêpuj¹ce dane: Fill 200 µl SII Dispense 150 µl SII W ten sam sposób nale y dokonaæ przegl¹du Programu 5: Program 5: Program obejmuje pobranie 100 µl, dozowanie 100 µl i trzykrotne mieszanie 50 µl. Na wyœwietlaczu pipetora powinny byæ wyœwietlane nastêpuj¹ce dane: Fill 100 µl SII 6

7 Dispense 100 µl SII Mix 50 µl SIII Zero (wyœwietlane pulsuj¹co) C. Uk³ad p³ytki Po wprowadzeniu do systemu typu lub typów oznaczeñ, danych identyfikacyjnych próbek, numerów seryjnych kontroli i numerów seryjnych zestawów, wyœwietlany jest raport o uk³adzie p³ytki BD ProbeTec ET. Raport o uk³adzie p³ytki przedstawia przestrzenne rozmieszczenie próbek i próbek kontrolnych na ka dej badanej p³ytce. Rozmieszczenie ma zastosowanie zarówno dla p³ytki Priming Microwell, jak i p³ytki Amplification Microwell. Mikrostudzienki Priming Microwells przeznaczone do oznaczenia ctb s¹ jednolicie bia³e, natomiast mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji (Amplification Microwells) maj¹ bia³e paski. D. Przygotowanie kontroli oznaczenia UWAGA: Przed u yciem próby kontrolne BD ProbeTec ET MCI, bufor lityczny MCI Lysis Buffer 2 i bufor neutralizuj¹cy MCI Neutralization Buffer 3 powinny byæ ogrzane do temperatury pokojowej. Do przygotowania próbki nale y u ywaæ buforów wczeœniej rozdzielonych. Wymieszaæ przed u yciem. 1. Dla ka dego planowanego cyklu testu (dla ka dej p³ytki) nale y przygotowaæ jedn¹ probówkê z kontrol¹ ujemn¹ MCI Negative Control Tube i jedn¹ z kontrol¹ dodatni¹ MCI Positive Control Tube. Je eli p³ytka zawiera zestawy ctb Reagent Pack o wiêcej ni jednym numerze seryjnym, nale y wykonaæ test kontroli dla ka dego numeru seryjnego. 2. Zdj¹æ nakrêtkê z ujemnej probówki kontrolnej: a. U ywaj¹c nowej koñcówki pipety, dodaæ 100 µl buforu litycznego MCI Lysis Buffer 2. b. U ywaj¹c nowej koñcówki pipety, dodaæ 600 µl buforu litycznego MCI Neutralization Buffer Ponownie mocno zamkn¹æ probówkê i mieszaæ przez 5 s. 4. Zdj¹æ nakrêtkê z dodatniej probówki kontrolnej: a. U ywaj¹c nowej koñcówki pipety, dodaæ 100 µl buforu litycznego MCI Lysis Buffer 2. b. U ywaj¹c nowej koñcówki pipety, dodaæ 600 µl buforu litycznego MCI Neutralization Buffer Ponownie mocno zamkn¹æ probówkê i mieszaæ przez 5 s. 6. Wstawiæ probówki kontrolne do mikrowirówki ze standardowym rotorem. Zamkn¹æ pokrywê i w³¹czyæ wirówkê na 10 s. Wyj¹æ probówki z wirówki i wstawiæ do statywu Clear Pipetting Rack. E. Procedura testowa 1. Zdj¹æ i odrzuciæ nakrêtki z probówek z próbkami do badania i z próbkami kontrolnymi przeznaczonych do pierwszego cyklu. 2. ZMIENIÆ R KAWICZKI. 3. Pos³uguj¹c siê raportem o uk³adzie p³ytki, przygotowaæ p³ytkê mikrostudzienek Priming Microwell. 4. Ponownie uszczelniæ opakowanie mikrostudzienek Priming Microwell, stosuj¹c nastêpuj¹c¹ procedurê. a. Umieœciæ opakowanie na równej powierzchni. Jedn¹ rêk¹ trzymaæ otwarty koniec p³ytki. b. Naciskaj¹c p³ytkê, przesuwaæ palec wzd³u zewnêtrznej strony uszczelnienia, poruszaj¹c siê od jednej do drugiej krawêdzi opakowania. c. Dopilnowaæ, by opakowanie by³o wystarczaj¹co uszczelnione. 5. Wybraæ Program 1 na pipetorze BD ProbeTec ET. 6. Pobraæ koñcówki pipet. Rozwin¹æ pipetor poprzez ca³kowite wyci¹gniêcie pokrêt³a regulacyjnego. UWAGA: Podczas pobierania próbek nale y uwa aæ, aby nie pobraæ resztek osadu. W przeciwnym wypadku mo e dojœæ do zatkania koñcówki pipety i zafa³szowania wyników testu. UWAGA: Aby unikn¹æ przecieku, nale y siê upewniæ, e koñcówki s¹ pewnie umocowane na pipetorze. 7. Pobraæ 200 µl z pierwszej kolumny próbek. 8. Naciskaj¹c delikatnie pipetor, dotkn¹æ koñcówkami pipet œcianek studzienek i wprowadziæ 150 µl roztworu do pierwszej kolumny mikrostudzienek Priming Microwells (1A-H). UWAGA: Aby zapewniæ dok³adnoœæ i precyzjê oraz unikn¹æ krzy owej kontaminacji, nale y dozowaæ p³yny na wewnêtrzne œcianki mikrostudzienek. 9. Wyrzuciæ koñcówki. Wcisn¹æ przycisk spustowy pipetowania w celu wyzerowania pipetora. 10. Pobraæ nowe koñcówki, rozwin¹æ pipetor i pobraæ 200 µl z drugiej kolumny próbek. 11. Naciskaj¹c delikatnie pipetor, dotkn¹æ koñcówkami pipety œcianek studzienek i wprowadziæ 150 µl do drugiej kolumny mikrostudzienek Priming Microwells (2A-H). UWAGA: Nie nale y naciskaæ pipetora nad próbkami ani mikrostudzienkami, poniewa mo e to spowodowaæ kontaminacjê. Wykonywanie gwa³townych ruchów mo e spowodowaæ powstawanie kropelek i aerozoli. 12. Wyrzuciæ koñcówki. UWAGA: Koñcówki nale y odrzucaæ ostro nie, aby unikn¹æ powstawania kropelek i aerozoli mog¹cych powodowaæ kontaminacjê miejsca pracy. 13. Kontynuowaæ przenoszenie pozosta³ych próbek przeznaczonych do danego cyklu. 14. Przykryæ p³ytkê Priming Microwell pokryw¹ Priming i pozostawiæ do inkubacji w temperaturze pokojowej na co najmniej 20 min (maksymalny czas inkubacji: do 6 h). UWAGA: Zamkn¹æ przygotowane próbki nowymi nakrêtkami. ZMIENIÆ R KAWICZKI. 7

8 15. Pod koniec inkubacji p³ytki Priming Microwell przygotowaæ p³ytkê Amplification Microwell. Rozmieœciæ mikrostudzienki na p³ytce w sposób odpowiadaj¹cy raportowi o uk³adzie p³ytki (Plate Layout Report), podobnie jak w przypadku p³ytek Priming Microwells. Ponownie uszczelniæ opakowanie Amplification Microwell zgodnie z procedur¹ opisan¹ w punkcie Zdj¹æ pokrywê z p³ytki Priming Microwell i przenieœæ p³ytkê do bloku grzewczego Priming Heater. W celu wstêpnego ogrzania NATYCHMIAST umieœciæ p³ytkê Amplification Microwell w bloku grzewczym. 17. Ustawiæ minutnik na 10 min. (UWAGA: Dla tego etapu czas ma krytyczne znaczenie.) 18. Pod koniec 10 min (+/- 1 min) inkubacji wybraæ na pipetorze Program Natychmiast pobraæ koñcówki do pipety i przenieœæ 100 µl z kolumny 1 p³ytki Priming Microwell do kolumny 1 p³ytki Amplification Microwell. Wprowadziæ p³yn, dotykaj¹c koñcówkami pipety œcianek studzienek. Po zakoñczeniu dozowania p³ynu odczekaæ, a nast¹pi automatyczne mieszanie cieczy w studzienkach. 20. Wyrzuciæ koñcówki. Pobraæ nowe koñcówki i kontynuowaæ przenoszenie mieszaniny reakcyjnej ze studzienek Priming Microwells do studzienek Amplification Microwells, u ywaj¹c nowych koñcówek dla wszystkich kolejnych kolumn. 21. Po przeniesieniu wszystkich kolumn usun¹æ podklejkê z uszczelki Amplification Sealer. (Jedna uszczelka przeznaczona dla po³owy p³ytki pozwala na zakrycie maksymalnie do 6 kolumn. Je eli na p³ytce stosuje siê ponad 6 kolumn, KONIECZNE jest u ycie pe³nego arkusza uszczelek.) Trzymaj¹c brzegi uszczelki, na³o yæ uszczelkê na mikrostudzienki. Przy nak³adaniu uszczelki nale y stosowaæ wskazówki dotycz¹ce bloku grzewczego. Docisn¹æ uszczelkê w celu zapewnienia ca³kowitego uszczelnienia wszystkich mikrostudzienek. 22. W obszarze u ytkowym urz¹dzenia BD ProbeTec ET otworzyæ drzwiczki i unieœæ pokrywê p³ytki. NATYCHMIAST (w ci¹gu 30 s) przenieœæ uszczelnion¹ p³ytkê Amplification Microwell do aparatu BD ProbeTec i rozpocz¹æ cykl. Szczegó³owe informacje znajduj¹ siê w podrêczniku dla u ytkownika BD ProbeTec ET System. 23. Po rozpoczêciu cyklu amplifikacji nale y odpowiednio wyczyœciæ p³ytkê Priming Microwell: a. Uszczelniæ p³ytkê Priming Microwell uszczelk¹ Amplification Sealer i wyj¹æ p³ytkê z bloku grzewczego. Do wyjmowania p³ytki u ywaæ rêkawicy termochronnej temperatura wynosi powy ej 70 C. b. Pozostawiæ p³ytkê na blacie przez 5 min w celu jej och³odzenia. Wyrzuciæ mikrostudzienki Priming Microwells do pojemnika na odpady ska one mikrobiologicznie. c. Wyczyœciæ metalow¹ p³ytkê: Op³ukaæ p³ytkê roztworem podchlorynu sodu o stê eniu 1% (v/v) z preparatem Alconox. Sp³ukaæ p³ytkê wod¹ destylowan¹ lub dejonizowan¹. Przed ponownym u yciem nale y zawin¹æ p³ytkê w czysty rêcznik i pozostawiæ do ca³kowitego wyschniêcia. 24. Po zakoñczeniu cyklu otrzymuje siê wydruk wyników testu. 25. Zdj¹æ noœnik p³ytki, otworzyæ drzwiczki i wyj¹æ p³ytkê. Zamkn¹æ drzwiczki i ponownie umieœciæ noœnik p³ytki w aparacie. 26. Usun¹æ z p³ytki uszczelnione mikrostudzienki Amplification Microwells. PRZESTROGA: Nie usuwaæ materia³u uszczelniaj¹cego z mikrostudzienek. Uszczelnione mikrostudzienki mo na ³atwo usun¹æ w ca³oœci, trzymaj¹c uszczelkê z przodu i z do³u i podnosz¹c p³ytkê prosto ku górze i na zewn¹trz. Umieœciæ uszczelnione mikrostudzienki w torebce na odpady. Szczelnie zamkn¹æ torebkê. 27. Wyczyœciæ metalow¹ p³ytkê: Op³ukaæ p³ytkê roztworem podchlorynu sodu o stê eniu 1% (v/v) z preparatem Alconox. Sp³ukaæ p³ytkê wod¹ destylowan¹ lub dejonizowan¹. Przed ponownym u yciem nale y zawin¹æ p³ytkê w czysty rêcznik i pozostawiæ do ca³kowitego wyschniêcia. 28. Po zakoñczeniu ostatniego cyklu danego dnia, nale y wype³niæ nastêpuj¹ce procedury porz¹dkowe: a. Wyczyœciæ blaty roztworem podchlorynu sodu o stê eniu 1% (v/v) z preparatem Alconox. Pozostawiæ roztwór na powierzchniach miejsca pracy na 2 3 min, a nastêpnie przep³ukaæ wod¹ destylowan¹ lub dejonizowan¹. b. Umyæ statywy Sample Tube Rack i Clear Pipetting Rack, zanurzaj¹c w roztworze podchlorynu sodu o stê eniu 1% (v/v) z preparatem Alconox, na nie d³u ej ni 60 s. Dok³adnie przep³ukaæ wod¹ destylowan¹ lub dejonizowan¹ i suszyæ na powietrzu. c. Wyczyœciæ zewnêtrzne powierzchnie bloku grzewczego i aparatu BD ProbeTec ET roztworem podchlorynu sodu o stê eniu 1% (v/v) z preparatem Alconox. Przep³ukaæ powierzchnie wod¹ destylowan¹ lub dejonizowan¹. d. Wyczyœciæ uchwyt pipetora (WY CZNIE UCHWYT) roztworem podchlorynu sodu o stê eniu 1% (v/v). Przep³ukaæ uchwyt wod¹ destylowan¹ lub dejonizowan¹, a nastêpnie wytrzeæ do sucha czystym rêcznikiem. e. Na³adowaæ pipetor. f. Szczelnie zamkniête torebki na odpady i odpady ska one mikrobiologicznie nale y usuwaæ zgodnie z przyjêtymi procedurami usuwania zanieczyszczonego materia³u odpadowego. KONTROLA JAKOŒCI Zestaw kontrolny BD ProbeTec ET MCI Control Set jest dostarczany osobno. W ramach ka dego cyklu, a tak e dla ka dego nowego numeru seryjnego zestawu odczynników nale y stosowaæ jedn¹ kontrolê dodatni¹ i jedn¹ ujemn¹. Kontrole mo na umieszczaæ w sposób losowy. Kontrola dodatnia MCI s³u y do monitorowania defektu odczynników, ukoñczenia zasadniczych elementów proceduralnych (pipetowania i inkubacji), amplifikacji i wykrywania. Kontrola ujemna MCI s³u y do monitorowania kontaminacji odczynników i (lub) otoczenia. Aby mo na by³o podawaæ wyniki wyników próbek, konieczne jest uzyskanie wyniku dodatniego kontroli MCI dodatniej i ujemnego wyniku ujemnej kontroli MCI. Je eli wyniki kontroli ró ni¹ siê od spodziewanych, cykl oznaczania uwa a siê za niewa ny. Dlatego aparat nie poda wyników oznaczenia próbek pochodz¹cych od pacjentów. Je eli wynik kontroli jakoœci odbiega od spodziewanych wyników, nale y powtórzyæ ca³y cykl, z zastosowaniem nowego zestawu kontroli, nowych 8

9 mikrostudzienek i przetworzonych próbek. Je eli powtórna kontrola jakoœci odbiega od spodziewanych wyników, nale y siê skontaktowaæ z obs³ug¹ techniczn¹ (zobacz czêœæ Interpretacja wyników ). Wskazówki dotycz¹ce przygotowania kontroli znajduj¹ siê w punkcje D czêœci PROCEDURA TESTOWA. Po przygotowaniu kontroli nale y kontynuowaæ wykonywanie testu, zgodnie z opisem przedstawionym w punkcie E czêœci PROCEDURA TESTOWA. Wewnêtrzna kontrola amplifikacji (IAC, Internal Amplification Control) jest wbudowana do ka dej mikrostudzienki. IAC zawiera docelowy kwas nukleinowy, amplifikowany w obecnoœci macierzy próbki. IAC jest przeznaczone do potwierdzania wiarygodnoœci reakcji amplifikacji oraz identyfikacji czynników hamuj¹cych amplifikacjê, zawartych w przetworzonej próbce. Kontrola przetwarzania próbki: W celu sprawdzenia skutecznoœci przetwarzania próbki nale y rutynowo wykonywaæ kontrolê procedury zgodnie z lokalnymi przepisami. W sk³ad kontroli procedury wchodzi zawiesina szczepu M. tuberculosis H37Ra (np. ATCC 25177). Zawiesinê nale y przygotowaæ w nastêpuj¹cy sposób: 1. Przygotowaæ zawiesinê drobnoustroju w roztworze nr 1 McFarlanda. 2. Rozcieñczyæ zawiesinê McFarlanda w bulionie Middlebrook 7H9 z glicerolem stosunku 1:100 odpipetowaæ 0,1 ml zawiesiny McFarlanda do 9,9 ml bulionu Middlebrook 7H9 z glicerolem, a nastêpnie dok³adnie zmieszaæ. 3. Próby rozporcjowane po 1,0 ml mo na przechowywaæ w temperaturze -20 C lub ni szej; nie rozmra aæ i zamra aæ prób. 4. Zawiesinê komórek nale y przygotowaæ, tak jak przygotowuje siê próbki przed wykonaniem testu w systemie BD ProbeTec ET. Monitorowanie kontaminacji DNA: Przed wykonaniem pierwszego oznaczenia BD ProbeTec ET, a nastêpnie co najmniej raz w miesi¹cu nale y przeprowadziæ nastêpuj¹c¹ procedurê testow¹, s³u ¹c¹ do monitorowania strefy roboczej i powierzchni oprzyrz¹dowania pod k¹tem kontaminacji DNA. Monitorowanie otoczenia ma podstawowe znaczenie dla wykrycia kontaminacji jeszcze przed pojawieniem siê problemu. 1. W przypadku ka dej powierzchni* poddawanej testowi nale y stosowaæ wymazówki CultureSwab EZ. 2. Dla ka dej powierzchni, z której bêdzie pobierany wymaz, nale y opisaæ probówkê Sample Tube, a nastêpnie do ka dej probówki odpipetowaæ po 100 µl buforu litycznego MCI Lysis Buffer 2 i 600 µl buforu zobojêtniaj¹cego MCI Neutralization Buffer Zanurzyæ pierwsz¹ wymazówkê w mieszaninie buforów zawartej w probówce na próbkê, a nastêpnie szerokim ruchem przetrzeæ pierwsz¹ badan¹ powierzchniê. 4. Zamieszaæ wymazówk¹ w mieszaninie buforów, wycisn¹æ wymazówkê, ponownie zamkn¹æ probówkê i wstrz¹saæ przez 5 s. Wyrzuciæ wymazówki. 5. Powtórzyæ czynnoœci dla ka dej powierzchni, z której pobiera siê wymaz. 6. Wstawiæ probówki do statywu i ogrzewaæ w cieplarce (zobacz punkt C czêœci PROCEDURA PRZYGOTOWANIA HODOWLI ). 7. W trakcie podgrzewania probówek nale y usun¹æ pozosta³oœci mieszaniny buforów z powierzchni, z których pobierano wymazy, za pomoc¹ rêczników nas¹czonych wod¹. 8. Po ogrzaniu nale y umieœciæ probówki w mikrowirówce ze standardowym rotorem, zamkn¹æ pokrywê i wirowaæ przez 10 s. 9. Wyj¹æ probówki z wirówki i sprawdziæ obecnoœæ wody na zakrêtkach probówek. W przypadku stwierdzenia skroplenia nale y powtórzyæ wirowanie. 10. Umieœciæ probówki w statywie Clear Pipetting Rack i postêpowaæ zgodnie z czêœci¹ PROCEDURA TESTOWA. *Zaleca siê testowanie nastêpuj¹cych miejsc: powierzchni cieplarki, ³aŸni ultradÿwiêkowej, statywu Sample Tube Rack, statywu Clear Pipetting Rack, bloku grzewczego, czarnych p³ytek na mikrostudzienki, uchwytu pipetora, przycisków dotykowych aparatu, klawiatury aparatu i blatu sto³u doœwiadczalnego. Je eli powierzchnia daje dodatni wynik, nale y j¹ wyczyœciæ, stosuj¹c œwie y roztwór podchlorynu sodu o stê eniu 1% (v/v) z preparatem Alconox. Dopilnowaæ, by ca³a powierzchnia zosta³a zwil ona roztworem odka aj¹cym. Pozostawiæ roztwór odka aj¹cy na powierzchni przez co najmniej 2 min lub do momentu wyschniêcia. Je eli to konieczne, nale y usun¹æ nadmiar roztworu odka aj¹cego za pomoc¹ czystego rêcznika. Wytrzeæ powierzchniê czystym rêcznikiem nas¹czonym wod¹ dejonizowan¹ lub destylowan¹ i pozostawiæ do wyschniêcia. Wykonaæ ponowny test danej powierzchni. Powtarzaæ a do uzyskania ujemnego wyniku. Je eli nie udaje siê usun¹æ kontaminacji, w celu uzyskania dalszych instrukcji nale y siê skontaktowaæ z obs³ug¹ techniczn¹. INTERPRETACJA WYNIKÓW Wyniki oznaczenia ctb Wynik dodatni Wynik ujemny Wynik nieoznaczalny Zalecane sprawozdanie Dodatni wynik testu z sond¹ wykrywaj¹c¹ DNA kompleksu M. tuberculosis. Ujemny wynik testu z sond¹ wykrywaj¹c¹ DNA kompleksu M. tuberculosis. Powtórzyæ test identyfikacji hodowli z sond¹ dla przetworzonej próbki, o ile objêtoœæ próbki jest wystarczaj¹ca. Je eli wynik powtórnego badania jest dodatni lub ujemny, nale y zastosowaæ formu³ê przedstawion¹ powy ej. Je eli wynik jest wci¹ nieoznaczalny, nale y powtórzyæ badanie dodatniej hodowli. OGRANICZENIA PROCEDURY 1. Opisywana metoda by³a testowana jedynie na próbkach mykobakterii uzyskanych w wyniku hodowli na pod³o ach zawieraj¹cych wyci¹g jajka kurzego, agarowych lub p³ynnych. Nie oceniano wydajnoœci w odniesieniu do innych pod³o y hodowlanych. Nie wykazano skutecznoœci opisywanego testu w bezpoœrednim badaniu próbek. 9

10 2. Nie oceniano testu BD ProbeTec ET ctb w badaniu wzrostu bakterii kwasoodpornych w hodowlach pierwotnych krwi lub szpiku kostnego. 3. Oznaczenie BD ProbeTec ET ctb nie daje mo liwoœci rozró nienia pomiêdzy poszczególnymi sk³adowymi kompleksu Mycobacterium tuberculosis M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum i M. microti. Opisano wystêpowanie rejonu IS6110 we wszystkich gatunkach i podgatunkach kompleksu M. tuberculosis. Niektóre warianty bakterii nie wykazuj¹ sekwencji insercji IS ; w takich przypadkach wynik testu BD ProbeTec ET ctb nie bêdzie dodatni. 4. Niestosowanie siê do podanego sposobu prowadzenia oznaczenia, np. niepe³na procedura wirowania, pipetowanie resztek pozosta³ych po wirowaniu, mo e powodowaæ zafa³szowanie wyników testu. 5. W celu izolowania szczepów z mieszanego wzrostu mykobakterii oraz potwierdzenia identyfikacji gatunków nale ¹cych do kompleksu M. tuberculosis mo na stosowaæ hodowle pochodne pod³o y p³ynnych testowanych przy u yciu testu BD ProbeTec ET ctb. 6. Test BD ProbeTec ET ctb powinien byæ stosowany wy³¹cznie przez personel przeszkolony pod wzglêdem procedury testowej i systemu BD ProbeTec ET. 7. Test BD ProbeTec ET ctb nie mo e zast¹piæ hodowli prowadzonych w celu zbadania wra liwoœci na leki przeciwbakteryjne. 8. Test BD ProbeTec ET ctb pozwala na uzyskanie wyników jakoœciowych. Nie istnieje zwi¹zek pomiêdzy wielkoœci¹ wyniku MOTA, a liczb¹ komórek w dodatniej próbce. 9. Sekwencja M. tuberculosis (IS6110) komplementarna z sond¹ jest swoista dla M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum i M. microti. 10. W przypadku korzystania z cieplarki ogólnego przeznaczenia nale y upewniæ siê, e p³yn w probówkach osi¹ga temperaturê 101 ± 1 C przez co najmniej 30 min w celu unieszkodliwienia wszelkich pr¹tków obecnych w próbkach. OCZEKIWANE WYNIKI 366 próbek pobranych w czterech oœrodkach klinicznych po³o onych w ró nych lokalizacjach geograficznych badano przy u yciu testu BD ProbeTec ET ctb. W sumie uzyskano 722 wyniki w badaniu BD ProbeTec ET ctb. Na rysunku 1 przedstawiono rozk³ad czêstotliwoœci pocz¹tkowych wyników MOTA w porównaniu z metod¹ referencyjn¹ wykorzystuj¹c¹ sondê bez amplifikacji. Na rysunku 2 przedstawiono rozk³ad pocz¹tkowych wyników MOTA w porównaniu z wynikiem ostatecznej identyfikacji. Obecnoœæ lub brak kompleksu Mycobacterium tuberculosis wyznacza siê przez porównanie wyników MOTA BD ProbeTec ET ctb z próbkami, w których wyniki zosta³y wczeœniej ustalone. Punktacja MOTA jest systemem metrycznym stosowanym do oceny wielkoœci sygna³u bêd¹cego wynikiem reakcji. Wielkoœæ punktacji MOTA nie oddaje iloœci mikroorganizmu w próbce. Wszystkie obliczenia s¹ wykonywane automatycznie przez oprogramowanie urz¹dzenia. Próbki badane w czterech oœrodkach z zastosowaniem BD ProbeTec ET identyfikowano jako dodatnie, ujemne lub nieoznaczalne. W przypadku uzyskania wyniku nieokreœlonego powtarzano badanie danej próbki. Tylko w przypadku jednej próbki otrzymano w pierwszym oznaczeniu wynik nieoznaczalny. Po wykonaniu powtórnego oznaczenia otrzymano wynik ujemny. W porównaniu z ostateczn¹ metod¹ identyfikacji œredni wynik MOTA dla wyników dodatnich wynosi³ (zakres: od 242 do ; mediana: ). Œredni wynik MOTA dla wyników ujemnych wynosi³ 2057 (zakres: od 0 do ; mediana: 47). Wartoœæ odciêcia wyniku MOTA wynosi Rysunek 1: Rozk³ad czêstoœci wyników MOTA ctb w porównaniu z sondami bez amplifikacji (-) (+) < Sonda bez amplifikacji TB (-) Sonda bez amplifikacji TB (+) MOTA

11 Rozk³ad czêstoœci wyników MOTA ctb w porównaniu z sondami bez amplifikacji Wynik referencyjny (Sonda bez amplifikacji) < Mtbc (+) Mtbc (-) Rysunek 2: Rozk³ad czêstoœci wyników MOTA ctb w porównaniu z ostateczn¹ metod¹ identyfikacyjn¹ (-) (+) < Identyfikacja ostateczna TB (-) Identyfikacja ostateczna TB (+) MOTA Rozk³ad czêstoœci wyników MOTA ctb w porównaniu z ostateczn¹ metod¹ identyfikacyjn¹ Wynik referencyjny (Identyfikacja ostateczna) < Mtbc (+) Mtbc (-) CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŒCIOWA Ocena kliniczna: Test BD ProbeTec ET ctb analizowano w czterech oœrodkach klinicznych znajduj¹cych siê w ró nych lokalizacjach geograficznych. W sumie w oznaczeniu prowadzonym przy u yciu systemu BD ProbeTec ET ctb zbadano 366 próbek, uzyskuj¹c 722 wyniki. Uzyskane wyniki porównywano z wynikami testu z sond¹ bez amplifikacji (tabela 1) i z wynikiem ostatecznej identyfikacji (tabela 2). W¹tpliwe wyniki weryfikowano przy u yciu referencyjnej metody identyfikacji biochemicznej, GLC lub HPLC. Tabela 1: Wynik testu ctb w porównaniu do wyniku sondy bez amplifikacji Wynik testu ctb Sonda bez amplifikacji (+) Sonda bez amplifikacji (-) (+) (-) Po porównaniu z wynikiem sondy bez amplifikacji, szacowana czu³oœæ wynios³a 99,6% (226/227), a swoistoœæ 95,6% (473/495). Ca³kowita zgodnoœæ wyra ona w wartoœciach procentowych wynios³a 96,8% (699/722). Tabela 2: Wynik testu ctb w porównaniu do wyniku ostatecznej identyfikacji Wynik testu ctb Identyfikacja ostateczna (+) Identyfikacja ostateczna (-) (+) (-) Po porównaniu z wynikiem identyfikacji ostatecznej szacowana czu³oœæ wynios³a 99,6% (226/227), a swoistoœæ 95,6% (473/495). Ca³kowita zgodnoœæ wyra ona w wartoœciach procentowych wynios³a 96,8% (699/722). Spoœród 23 izolatów, dla których uzyskano niezgodne wyniki testu, jeden, o wyniku ujemnym w teœcie BD ProbeTec ET ctb, zidentyfikowano przy u yciu metody referencyjnej, jako zawieraj¹cy kompleks M. tuberculosis. aden spoœród pozosta³ych 22 izolatów dla których uzyskano niezgodne wyniki testu BD ProbeTec ET ctb, nie zosta³ zidentyfikowany jako zawieraj¹cy kompleks M. tuberculosis. 11