Rozdział 0 UTLENIANIE BILGICZNE Zespół procesów składających się na reakcje utleniania, które zachodząc w organizmach dostarczają energii i metabolitów dla potrzeb procesów życiowych określany jest terminem utlenianiem biologicznym. Funkcje tego istotnego biologicznie procesu nie ograniczają się tylko do powyższej definicji, ponieważ za pośrednictwem reakcji utleniania dochodzi także do rozkładu zbędnych produktów przemiany materii oraz do neutralizacji szkodliwego działania substancji, które organizm rozpoznaje jako obce. Z punktu widzenia prawidłowego funkcjonowania organizmów najważniejszy jest wpływ reakcji utleniania komórkowego na regulację przemiany materii: Detoksykacja Szlaki wydalnicze (szkodliwe ksenobiotyków dla komórki produkty przemiany) Synteza ważniejszych Funkcji utleniania Regulacja przemiany metabolitów biologicznego materii Zabezpieczenie energetyczne utrzymania temperatury ciała świecenia (bioluminescencji) syntezy chemicznej zjawisk osmotycznych procesów elektrycznych roboty mechanicznej Różnorodne reakcje utleniania w organizmach katalizują liczne enzymy z klasy oksydoreduktaz, które z reguły zlokalizowane są w systemach błon komórkowych, tworząc często tzw. zespoły lub układy. Przyjęte na początku XX wieku dwie koncepcje utleniania biologicznego, tzn. aktywowania tlenu i aktywowania wodoru, obowiązywały do roku 95, kiedy to D. Keilin odnalazł w tkankach owadów cytochromy funkcjonujące jako przenośniki elektronów. dkrycie to pozwoliło w późniejszych latach na opisanie jednoczesnej aktywacji tlenu i wodoru. Wyjaśnienie tego procesu przyspieszyły prace.h. Warburga, który w roku 98, zidentyfikował oksydazę cytochromową, nazywaną początkowo od nazwiska odkrywcy fermentem oddechowym Warburga. Właśnie
Rozdział 0. Utlenianie biologiczne 4 oksydaza cytochromowa okazała się enzymem bezpośrednio aktywującym tlen, a cytochromy akceptorami elektronów, przekazującymi je z atomu wodoru na enzym. W ten sposób po raz pierwszy wysunięto hipotezę dotyczącą zespołów enzymów łańcucha oddechowego uczestniczących w reakcjach utleniania biologicznego. Łańcuch oksydoredukcyjny, składający się głównie z cytochromów, nazwano systemem cytochromowym: Substrat Dehydrogenaza (H) Cytochromy Cytochromoksydaza (e) / Substrat (H) Dehydrogenaza Cytochromy (e) Cytochromoksydaza Enzymy, które znajdują się na końcu takich układów oksydoredukcyjnych i przenoszą elektrony bezpośrednio na tlen nazywane są oksydazami końcowymi. W latach 947-66 udowodniono, że system cytochromów nie jest jedynym układem zdolnym do aktywacji wodoru i tlenu, rezultatem której jest utworzenie cząsteczki wody. Systemów takich jest kilka, a najprostsza, obok reakcji z udziałem peroksydazy, to reakcja katalizowana oksydazą glikolanową (oksydaza L-- hydroksykwasów): C + Kwas glikolowy H + H - ksydaza CC + H glikolanowa Kwas glioksalowy Reakcja ta zachodzi u roślin, zwierząt, grzybów i bakterii. ksydaza glikolanowa liści szpinaku jest flawoproteiną posiadającą masę cząsteczkową 70.000 Da (8 7000). Znana jest czwartorzędowa struktura oktamerowa cząsteczki enzymu i trzeciorzędowa struktura jego podjednostki oraz wiadomo, że średnica cząsteczki składającej się z czterech dimerów wynosi około 0 nm. Koenzymem oksydazy glikolanowej jest mononukleotyd flawinowy, za pośrednictwem którego dochodzi do degradacji kwasu glikolowego związanej z aktywacją wodoru. Jednocześnie oksydaza glikolanowa zdolna jest do aktywacji tlenu i przekazania mu atomów wodoru od zredukowanego mononukleotydu flawinowego z utworzeniem H. Powstający nadtlenek wodoru ulega rozkładowi w obecności katalazy. becnie znanych jest ponad 0 oksydaz o naturze flawoproteinowej, które zawierają FMN i FAD jako koenzymy. Należą do nich m.in. oksydaza szczawianowa, glukonowa, ksantynowa oraz oksydazy L-aminokwasów. Drugim typem układów enzymatycznych, katalizujących utlenianie substratów z jednoczesnym przekazywaniem atomu wodoru na tlen, są oksydazy zawierające atomy miedzi. Charakterystycznym przedstawicielem tej grupy enzymów jest
4 Podstawy biochemii oksydaza askorbinianowa, której cząsteczka o masie wynoszącej od 0.000 do 40.000 Da, zawiera 8 atomów miedzi i składa się z dwóch podjednostek. ksydazę askorbinianową odkrył w 98 r. A. Szent-Györgyi, a dziesięć lat później H. Taube uzyskał w stanie homogennym. Równanie reakcji utleniania kwasu askorbinowego zostało podane w rozdziale 4. Rozwojowi wiedzy na temat reakcji oksydoredukcyjnych biorących udział w u- tlenianiu biologicznym towarzyszyło sprecyzowanie funkcji, klasyfikacji i nomenklatury enzymów, wchodzących w skład tych układów. Przypomnijmy (zob. rozdz. 4), że dehydrogenezy, które prowadzą bezpośrednio do odwodorowania substratu, nazywane są pierwotnymi. W odróżnieniu od nich dehydrogenazy przyłączające atom wodoru pochodzący od zredukowanych koenzymów pierwotnych, tzn. od NADH, NADPH, FMN H, FAD H, lub od pośrednich akceptorów, na które były przekazane atomy wodoru pierwotnych dehydrogenez, zaliczane są do kategorii dehydrogenez wtórnych. Zarówno dehydrogenezy pierwotne, jak i wtórne, przekazujące atom wodoru na określone akceptory, nazywane są reduktazami, a wszystkie oksydoreduktazy przenoszące atomy wodoru albo elektrony bezpośrednio na tlen oksydazami. W związku z tym zwrócono uwagę na systemy utleniania-redukcji, w których pomiędzy dehydrogenezami a tlenem cząsteczkowym uczestniczą związki pośrednie. Początkowo atomy wodoru ze zredukowanej dehydrogenazy przenoszone są na utlenioną cząsteczkę pośrednika, a następnie z niej na. bie reakcje mają charakter enzymatyczny, a ich końcowym produktem jest cząsteczka wody. Najczęściej rolę pośredniczącą w przeniesieniu elektronów pełnią chinony i kwas askorbinowy. We wzajemnych oddziaływaniach ze związkami pośredniczącymi bierze udział tylko koenzym w formie zredukowanej, jak np. NADH lub NADPH. W przypadku układu fenol chinon schemat procesu jest następujący: Reduktaza chinonowa NADH + H + H NAD + H / Fenolaza Pierwsze dane na temat odmiennego od poznanego wcześniej sposobu utleniania biologicznego przedstawili w roku 9 E. Andre i K. Hou, odkrywając w nasionach soi specyficznie działającą lipoksydazę. Katalizuje ona reakcję bezpośredniego przyłączenia tlenu atmosferycznego do podwójnych wiązań C=C wielonienasyconych wyższych kwasów tłuszczowych. Dzięki zastosowaniu 8 i H 8 w prowadzonych reakcjach, w roku 955 udowodniono istnienie nowej podklasy
Rozdział 0. Utlenianie biologiczne 4 oksyreduktaz, tzw. oksygenaz, i opisano mechanizmy przyłączania cząsteczek tlenu do różnych związków organicznych. dkrycia tego dokonały niezależnie dwa zespoły badawcze kierowane przez G. Mezona i. Haiyashi. Zgodnie ze współczesnymi informacjami masa cząsteczkowa lipoksygenazy w zależności od tkanki waha się w granicach od 60.000 do 00.000 Da. Enzym spotykany jest w postaci odmiennych form molekularnych u roślin i zwierząt. W przypadku kwasu linolowego reakcja katalizy zachodzi zgodnie z równaniem: ( ) 4 = =( ) 7 C + Lipoksygenaza ( ) 4 ()==( ) 7 C Kwas linolowy Kwas -hydroperoksy-cis-9-trans--oktadekadienowy Lipoksygenazy biorą udział w biosyntezie prostaglandyn oraz leukotrienów i tromboksanów przekształcając kwas arachidonowy (zob. rozdz. ). Ważnym etapem badania mechanizmu procesu utleniania biologicznego okazało się odkrycie sprzężenia reakcji utleniania związków organicznych z fosforylowanien ADP, którego w roku 9 dokonał V.A. Engelhardt, badając zmiany poziom kwasu adenazynopirofosforowego, umownie nazwanego pirofosforanem, w erytrocytach gołębia. Ustalił on, że w obecności azotu ilość pirofosforanu ulega zmniejszeniu, a zwiększa się w obecności tlenu. Ponowne przejście od warunków beztlenowych do tlenowych związane było z cykliczną reakcją rozpad resynteza pirofosforanu. znacza to, że energia wydzielana podczas utleniania (w warunkach tlenowych), nie ulega rozproszeniu, a wykorzystywana jest do demineralizacji i wiązania nieorganicznego fosforanu zgromadzonego w makroergicznych wiązaniach adenozynotrójfosforanu (ATP): ADP + H P 4 ATP +H. Wyniki doświadczeń Engelhardta, wykorzystane przez W. Belitsera i współpracowników, doprowadziły do określenia zależności reakcji utleniania i fosforylowania, a w szczególności do ustalenia stosunku liczby moli zsyntetyzowanego ATP do liczby moli tlenu zużytego podczas syntezy. Wartość ta, określona jako współczynnik utleniania fosforylacyjnego, we wszystkich dokonywanych pomiarach równa jest,0, co świadczy o tym, że przeniesieniu w układzie przenośników elektronów łańcucha oddechowego dwóch atomów wodoru z równoczesnym uwolnieniem dwóch elektronów towarzyszy synteza trzech cząsteczek ATP. Dowodzi to obecności trzech punktów sprzężenia utleniania z fosforylowaniem ADP. Badania dotyczące mechanizmów sprzężenia utleniania z fosforylowaniem, będące podstawą bioenergetyki, trwają już od ponad pół wieku i w związku z licznymi niewiadomymi w dalszym ciągu są tematem zainteresowania wielu naukowców. Przedstawione poniżej zagadnienia dotyczące aktualnego stanu wiedzy na ten temat, pokazują złożoność problemów utleniania biologicznego w świetle nowoczesnych badań.
44 Podstawy biochemii 0.. Klasyfikacja procesów utleniania biologicznego i ich lokalizacja w komórce Informacje przedstawione powyżej pozwalają na stwierdzenie, że w komórce funkcjonują dwa rodzaje procesów związanych z utlenianiem związków organicznych.. Samorzutne utlenianie nie jest sprzężone z fosforylowaniem ADP, a w związku z tym przemianie energii wydzielanej podczas utleniania nie towarzyszy tworzenie wiązań wysokoenergetycznych. W trakcie samorzutnego utlenianiu uwalniana energia wiązań chemicznych zostaje zamieniona w ciepło i ulega rozproszeniu. Taki mechanizm jest charakterystyczny dla reakcji utleniania katalizowanych przez peroksydazy, dla reakcji towarzyszących powstawaniu H, oraz wielu innych zachodzących w obecności oksydaz. Procesy samorzutnego utleniania, zlokalizowane głównie w cytozolu, błonach siateczki cytoplazmatycznej, błonach lizosomów, peroksysomów i aparatu Golgiego, zachodzą również na zewnątrz błon mitochondriów i chloroplastów oraz na terenie jądra komórki.. Utlenianie sprzężone z fosforylowaniem ADP może mieć dwojaki przebieg. Jeżeli wiązanie wysokoenergetyczne powstaje wskutek bezpośredniego utleniania substratu i następnie zostaje przeniesione na resztę fosforanową, która, fosforylując ADP, syntetyzuje cząsteczkę ATP, to taki rodzaj utleniania nazywany jest utlenianiem sprzężonym z fosforylowaniem ADP na poziomie substratu. Do niedawna proces taki określano terminem fosforylacja oksydacyjna lub fosforylacja substratowa. W przypadku, gdy atomy wodoru koenzymów dehydrogenez, biorących udział w utlenianiu substratów, są przekazywane do łańcucha zawierającego oksydoredukazę, gdzie jednocześnie z przeniesieniem protonów i elektronów na cząsteczkę tlenu zachodzi fosforylowanie fosforanu nieorganicznego i za jego pośrednictwem fosforylowanie ADP z utworzenia ATP, to takie sprzężenie utleniania z syntezą ATP nazywane jest sprzężeniem na poziomie łańcucha transportu elektronów, przy czym utleniany substrat nie bierze udziału w aktywacji nieorganicznego fosforanu. Wcześniej, taki rodzaj utleniania biologicznego nazywany był fosforylacją oksydacyjną i utożsamiany z oddychaniem. Sprzężenie utleniania z fosforylowaniem, czyli wytwarzanie cząsteczek ATP na potrzeby komórek, przebiega głównie na wewnętrznych błonach mitochondrialnych. Właśnie na ich powierzchni dochodzi do sprzężenia utleniania z fosforylowaniem na poziomie łańcucha transportu elektronów. Procesy związane z fosforylowaniem substratowym skoncentrowane są na ogół w rozpuszczalnej części komórki, tzw. hialoplazmie. 0.. Samorzutne utlenianie Reakcje samorzutnego utleniania związków organicznych oraz związane z nimi układy enzymatyczne charakteryzuje duży stopień zróżnicowania. Niektóre z nich
Rozdział 0. Utlenianie biologiczne 45 przedstawione zostały powyżej. W ten sposób ulegają utlenieniu nie tylko liczne substraty sztuczne i naturalne, ale też i zredukowane koenzymy, takie jak: NADH, NADPH czy FAD H, które powstają przy udziale pierwotnych i wtórnych dehydrogenaz. Reakcje samorzutnego utleniania przebiegające na terenie cytozolu i błon różnych struktur komórkowych, związane są jednak głównie ze strukturami błonowymi siateczki śródplazmatycznej, wchodzącej w skład frakcji mikrosomowej, którą uzyskuje się po homogenizacji i wirowaniu różnicowym homogenatów komórkowych. Postępowanie takie daje możliwość badania w uzyskanej frakcji organizacji i funkcji łańcucha oddechowego. Pierwszą z jego właściwości jest brak sprzężenia z fosforylowaniem ADP pomimo obecności w łańcuchu enzymów zdolnych do przeniesienia elektronów. Drugą cechą jest swoistość struktury i aktywności funkcjonalnej cytochromów b 5 oraz P-450, które wchodzą w skład łańcucha. Dotyczy ona w szczególności cytochromu P-450, wielopostaciowej hemoproteiny o masie cząsteczki 50.000 Da, która syntetyzowana jest w komórce w odpowiedzi na wprowadzenie do organizmu ksenobiotyków. Występująca w tym przypadku analogia do przeciwciała syntetyzowanego w odpowiedzi na obecność antygenów sugeruje, że cytochrom P-450 może być zaangażowany w procesy odpornościowe organizmu i traktowany jako membranowa inmunoglobulina. Trzecią cechą przypisywaną łańcuchom mikrosomowym jest wysokie powinowactwo ich terminalnej oksydazy do tlenu, co pozwala enzymowi konkurować z mitochondrialną oksydazą cytochromu. Dlatego też w komórkach wątroby udział mitochondrialnego utleniania endogennych substratów stanowi 40%, podczas gdy mikrosomowego 60%. Największym stopniem swoistości charakteryzują się reakcje wolnego utleniania zachodzące przy udziale oksygenaz. Ta podklasa oksydoreduktaz zawiera enzymy, katalizujące włączenie do utlenianego substratu jednego (monoksydazy) lub dwóch (dioksydazy) atomów tlenu cząsteczkowego. Samorzutne utlenienie przy udziale dioksygenaz. Jedną z najbardziej znanych dioksygenaz jest pirokatechaza (katecholaza: decyklizująca tlenek-,-oksydoreduktaza), której masa cząsteczkowa wynosi 85.000 Da. Stężone roztwory pirokatechazy mają czerwony kolor, ponieważ zawiera ona w centrum aktywnym dwa atomy Fe, które wg. Haiyashi łączone są z tlenem cząsteczkowym w kompleks, w którym tlen ulega aktywacji: Fe + + Fe + Fe + + -. Zatem w centrum aktywnym pirokatechazy po połączeniu z substratem powstaje potrójny kompleks, którego przekształcenie prowadzi do włączenia tlenu cząsteczkowego do pirokatechiny:
H C H C H C H C 46 Podstawy biochemii ē - Fe + Fe + - + H C C Pirokatechina Kwas mukonowy Analogicznie działa katecholo-,-oksydaza (M = 40.000 Da, atom Fe),,4- dioksygenaza kwasu pirokatechinowego (M = 70.000, 8 90.000 Da), z której powstaje kwas β-karboksy-mukonowy oraz oksydaza tryptofanowa (M =.000 Da), włączająca tlen cząsteczkowy do pierścienia pirolowego rodnika indolowego. We wszystkich przypadkach tlen cząsteczkowy aktywowany jest kosztem przyłączenia elektronu, donorem którego jest kation Fe +, a powstający anion tlenu ( - ), łącząc substrat, powoduje jego utlenienie. Poznając mechanizm działania dioksydaz, wyjaśniono, w jaki sposób terminalne oksydazy aktywują tlen cząsteczkowy. Jedną z istotnych biologicznie reakcji z udziałem dioksygenaz jest reakcja przekształcenia β-karotyny w witaminę A: 5 5' β-karotyna ksygenaza β-karotynowa ( zawiera Fe +, który aktywuje ) C H Retinol (witamina A) Samorzutne utlenianie przy udziale monoksygenaz. Wysoka labilność monoksydaz i dioksydaz sprawia, że ich izolowanie i oczyszczanie jest zadaniem niezwykle trudnym. Nie mniej jednak niektóre z nich otrzymano w stanie krystalicznym, w związku z czym obecnie wiadomo, że posiadają masę cząsteczkową od 65.000 do 00.000 Da, nie zawierają kationów metali, a ich koenzymy mają z reguły naturę flawinową. Prócz tego dla wielu monoksydaz w reakcji monoksygenowania niezbędny jest udział tzw. donora parzystego dostarczającego atomy wodoru na jeden z atomów tlenu cząsteczkowego, podczas gdy drugi atom łączy się z utlenianym substratem. Najprostszym przedstawicielem monoksydaz jest hydroksylaza fenolowa (fenol--monooksygenaza):
Rozdział 0. Utlenianie biologiczne 47 Fenol Hydroksylaza fenolowa Pirokatechina + H + + NADPH + + NADP + + H Monoksygenazy biorą udział w utlenianiu aminokwasów (monoksygenazy: lizynowa, arginianowa, tryptofanowa, fenyloalaninowa oraz hydroksylaza tyrozynowa), oksydokwasów (hydroksylaza salicylowa) oraz związków poliizoprenowych (epoksydaza skwalenowa). Mechanizm działania monoksygenaz nie jest ostatecznie wyjaśniony. Uważa się, że enzym nadtlenku wodoru lub jego ekwiwalent, może być powiązany z aktywną formą tlenu. Wykazano między innymi, że monoksygenazy, takie jak fenolaza, wyizolowana z komórek grzybów, czy hydroksylaza fenyloalaninowa, mają w swoim składzie kation Cu +, w związku z czym w tym przypadku możliwy jest następujący mechanizm aktywowania tlenu: Monoksygenaza Monoksygenaza Monoksygenaza Cu + Cu + + Monoksygenaza Cu + Cu + Cu + - - + Substrat + NADH + H + Cu + Cu + Substrat + Cu + hydroksylowany + NAD+ + H Podobnie w przypadku dioksygenaz, decydującą rolę w aktywacji tlenu cząsteczkowego odgrywają elektrony przekazywane z kationu metalu, który wchodzi w skład enzymu. Prawdopodobnie, sposób włączenia tlenu cząsteczkowego w reakcje redoks ma charakter ogólny dla wszystkich oksydaz, które biorą udział zarówno w wolnym utlenianiu biologicznym, jak i w sprzężonym z fosforylowaniem. 0.. Utlenianie w sprzężeniu z fosforylowaniem ADP - - Fosforylacja substratowa. Przykładem sprzężenia utleniania z fosforylowaniem na poziomie substratu mogą być reakcje utleniania aldehydu -fosfoglicerynowego do kwasu,-difosfoglicerynowego, kwasu -fosfoglicerowego do kwasu -fosfoenolopirogronowego i kwasu α-ketoglutarowego do kwasu bursztynowego. Powstający w tych reakcjach fosforan, zawierający wiązanie wysokoenergetyczne, może być przekazany na cząsteczkę ADP lub GDP. Jeden z przykładów takiego sprzężenia
48 Podstawy biochemii wraz z mechanizmem przeniesienia aktywowanego fosforanu na ADP został przedstawiony w rozdziale III. W reakcji związanej z fosforylowaniem substratu powstają jednak niewielkie ilości ATP. Fosforylacja oksydacyjna. Większa ilość ATP w organizmach aerobowych syntetyzowana jest na drodze fosforylacji oksydacyjnej w mitochondrium, które można określić jako energetyczne fabryki komórek. Atomy wodoru, powstające z substratów w cyklu kwasów dwu- i trójkarboksylowych, a także podczas β-utleniania wyższych kwasów tłuszczowych i w reakcji z udziałem hydrogenaz glutaminowej i pirogronianowej wchodzą do łańcuchu oddechowego wewnętrznej błony mitochondrialnej. Uniwersalnym donorem atomów wodoru dla przenośników w łańcuchu oddechowym jest NADH, który powstaje w poniższej reakcji utleniania: NADPH + NAD + Transhydrogenaza NAD(P) NADP + + NADH W tym przypadku atomy H przekazywane są na NAD + przed wejściem do łańcucha oddechowego. Drugim pierwotnym źródłem atomów H i elektronów w łańcuchu oddechowym jest zredukowana flawoproteina, pełniąca funkcję pierwotnej dehydrogenazy, tak jak w przypadku utleniania kwasu bursztynowego w cyklu kwasów dwu- i trójkarboksylowych. Flawonoproteiny innej natury przenoszą atomy wodoru i elektrony z NADH na ubichinonowe układy pośredniczące łańcuchu oddechowego. Godną uwagi cechą łańcucha oddechowego jest obecność fragmentu, w którym sąsiednie układy przenośnikowe wykazują dużą różnicę potencjałów (E 0 ) (tab. 0.). W tym miejscu dochodzi do sprzężenia reakcji utleniania z fosforylowaniem ATP, ponieważ różnica poziomów energetycznych elektronu, który przekazywany jest z jednego układu na drugi z prędkością rzędu nm/ms, daje możliwość utworzenia wiązania wysokoenergetycznego i wynosi 5-8 kj dla różnych punktów sprzężenia. Intensywność fosforylacji oksydacyjnej determinowana jest wielkością ładunku (q), określającą stosunek stężeń mono-, di- i trójfosforanów adenozyny: 0.5[ ADP] + [ ATP] q = [ AMP] + [ ADP] + [ ATP] Problem sprzężania reakcji utleniania z fosforylowaniem daleki jest jeszcze od całkowitego wyjaśnienia. Wcześniejsze hipotezy dotyczące tego zjawiska, tj. hipoteza przenośników chemicznych (E. Slater, 95) i hipoteza konformacyjna (P. Boir, 964), mają obecnie znaczenie historyczne, chociaż określone elementy każdej z nich zawarte są w powszechnie uznawanej hipotezie chemiosmotycznej P. Mitchella, zgodnie z którą właściwości strukturalne i funkcjonalne błon struktur komórkowych uczestniczą w procesach sprzęgania obu reakcji prowadząc do syntezy ATP.
Rozdział 0. Utlenianie biologiczne 49 Tabela 0.. Podstawowe potencjały redoks (E0, V) związków biorących udział w utlenianiu biologicznym Forma utleniona Liczba przekazywanych elektronów Zredukowana forma E0, V ctan + C Bursztynian + C ctan Ferredoksyna (utlen.) H + Acetonooctan NAD + NADP + FMN-proteina Liponian (utlen.),-difosfoglicerynian Glutation (utlen.) FAD Acetaldehyd Pirogronian Szczawiooctan α-ketoglutaronian + NH + Błękit metylenowy (utlen.) Fumaronian Koenzym Q Cytochrom b(fe + ) Dehydroksyaskorbinian Cytochrom c (Fe + ) Cytochrom c (Fe + ) Cytochrom a (Fe + ) / + H Żelazicyjanek Azotan Cytochrom a (Fe + ) Fe + / + H + Pirogronian α-ketoglutaronian Acetaldehyd - Ferredoksyna (zred.) H β-hydroksymaślan NADH + H + NADPH + H + FMN H-proteina Liponian (zred.) Aldehyd glicerynowy P+PH Glutation (zred.) FAD H Etanol Mleczan Jabłczan Glutaminian Błękit metylenowy (zred.) Bursztynian CoQ H Cytochrom b(fe + ) Askorbinian Cytochrom c (Fe + ) Cytochrom c (Fe + ) Cytochrom a (Fe + ) H Żelazocyjanek Azotyn Cytochrom a (Fe + ) Fe + H -0,70-0,67-0,60-0,45-0,4-0,4-0,5-0, -0, -0,0-0,9-0,9-0, -0, -0,0-0,9-0,7-0,4 0,0 0,0 0,04 0,07 0,08 0, 0,5 0,9 0,0 0,6 0,4 0,55 0,77 0,8 W łańcuchu oddechowym zlokalizowanym w nieprzepuszczalnej dla NADH i H + membranie łączącej mitochondrium zachodzi proces aktywnego przeniesienia z matrycy do przestrzeni międzymembranowej sześciu protonów H + na każdą parę elektronów przechodzących wzdłuż łańcucha przekazującego elektrony. W wyniku tego procesu powstaje transmembranowa różnica potencjałów, ponieważ po zewnętrznej stronie membrany mitochondrium gromadzą się protony H +, a od strony wewnętrznej układają się aniony -. Powstająca różnica potencjałów pobudza przebieg całego procesu syntezy ATP. prócz biosyntezy ATP, powstający na membranie potencjał elektrochemiczny ( µ H + ), przeprowadzający ją w stan korzystniejszy energetycznie, jest źródłem m.in.: pracy mechanicznej (np. ruchu biczyków mutantów bakteryjnych niezdolnych do syntezy ATP na drodze sprzężenia utleniania z fosforylowaniem czy
50 Podstawy biochemii przemian chloroplastów u wodorostów), utrzymywania ciśnienia osmotycznego oraz transportu substancji w kierunku odwrotnym do gradientu stężenia, ciepła po utracie przez mitochondrium kontroli nad oddechem (np. podczas wychłodzenia zwierząt, w okresie wyparowywania olejków estrowych kwiatów, dla przywabiania owadów), wstecznego kierowania elektronów w łańcuchu oddechowym oraz syntezy pirofosforanu oraz polifosforanów jako związków wysokoenergetycznych. Źródłem energii membran może być potencjał elektrochemiczny µ Na + charakterystyczny dla bakterii morskich i wykorzystywany do ruchu biczków, powstawania gradientów stężenia soli, a w szczególności do syntezy ATP z udziałem ATPazy, zależnej od kationów Na + (Na + -ATP-syntazy). Z tym zjawiskiem związany jest problem dotyczący funkcjonowania innych ATPaz zależnych od kationów metali (Na +, K +, Ca + -ATPzy), którego poznanie stanowi ważny krok na drodze rozwoju bioenergetyki Wynika z tego, że powstawanie µ H +, a w szeregu przypadków µ Na + na membranie sprzęgającej jest uniwersalnym sposobem wytwarzania energii komórkowej, która następnie zostaje zgromadzona w wysokoenergetycznych wiązaniach ATP. 0.4. Energetyczny bilans rozpadu węglowodanów i trójglicerydów Sumowanie równań reakcji zachodzących podczas fermentacji, glikolizy lub całkowitego utlenienia glukozy na drodze jedno- lub dwustopniowej, daje ostatecznie następujące rezultaty: niepełne utlenienie Fermentacja C 6 H 6 + H P 4 + ADP C H 5 + C +ATP + H Glikoliza C 6 H 6 + H P 4 + ADP ()C + ATP +H pełne utlenianie Reakcja jednostopniowa C 6 H 6 + ATP + 7H + NADP + 6 C + ADP + H P 4 + NADPH + H + Reakcja dwustopniowa C 6 H 6 + 4H P 4 + 4ADP +0NAD + + FAD + H 6 C + 0NADH + 0H + + FADH + 4ATP Jeżeli przyjąć, że wszystkie atomy wodoru, odłączane od substratów przy pełnym utlenieniu, zostaną skierowane do łańcucha oddechowego, a ich przejście do tlenu będzie sprzężone z fosforylowaniem, to w każdym przypadku powinna utworzyć się określona, ale różna liczba cząsteczek ATP. Intensywność syntezy ATP odpowiadająca energetycznym efektom rozkładu węglowodanów przedstawia się dla każdego z nich w sposób jak przedstawia tabela 0.. Dla organizmów najkorzystniejsza w sensie energetycznym jest przemiana węglowodanów na drodze oddychania, ponieważ jest ona głównym źródłem magazynowanych w organizmie cząsteczek ATP. ddychanie jest procesem, który kumu-
Rozdział 0. Utlenianie biologiczne 5 luje energię w sposób najbardziej wydajny. Fermentacja i glikoliza dają małą ilość ATP i mogą tylko w krótkim czasie lub w nietypowych warunkach prowadzić rozpad węglowodanów poprzez utlenianie. Tabela 0.. Liczba syntetyzowanych cząsteczek ATP (natp) w zależności od sposobu rozkładu węglowodanów Sposoby rozkładu węglowodanów Fermentacja Glikoliza ddychanie: jednostopniowy sposób dwustopniowy sposób natp 5 8 W wyniku zmian energii swobodnej w czasie fermentacji, glikolizy i oddychania ilość energii gromadzonej w wysokoenergetycznych wiązaniach ATP wynosi odpowiednio 7,8%,,8% oraz 9,6% w reakcji jednostopniowej i 4% w reakcji dwustopniowej, z czego wynika, że w trakcie utleniania cząsteczki glukozy maksymalna ilość energii gromadzonej i uwalnianej powstaje w reakcji dwustopniowej. Energetyczny efekt utleniania trójglicerydów, których rozpad jest sprzężony z fosforylowaniem zostanie omówiony na przykładzie reakcji utleniania trójstearyny. W rezultacie hydrolizy trójstearyny powstaje jedna cząsteczka gliceryny i trzy cząsteczki kwasu stearynowego. Podczas utlenienia gliceryny do C i H w procesie fosforylowania gliceryny zostaje zużyta jedna cząsteczka ATP, a trzy cząsteczki ATP powstają podczas sprzężenia fosforylowania z utlenieniem fosfogliceryny do fosfodihydroksyacetonu i aldehydu -fosfoglicerynowego do kwasu pironogronowego oraz 5 cząsteczek podczas utlenienia kwasu pirogronowego do kwasów dwu- i trójkarboksylowych. znacza to, że kosztem utleniania gliceryny w warunkach, w których wszystkie atomy H odszczepione przez dehydrogenazy wchodzą do łańcucha oddechowego funkcjonującego w sprzężeniu z fosforylacją oksydacyjną, powstają cząsteczki ATP. Każde β-utlenianie daje dwie pary atomów wodoru, które mogą być skierowane do łańcucha oddechowego, sprzężonego z fosforylowaniem, co daje 5 cząsteczek ATP (dwie kosztem przekazywania do łańcucha oddechowego atomów wodoru od FAD H oraz trzy od NADH + H + ). Tak więc, do β-utleniania każdej reszty kwasu stearynowego potrzebnych jest 8 reakcji utleniania, co oznacza, że rozkład jednej cząsteczki kwasu stearynowego do acetylo-coa związany jest z syntezą 40 cząsteczek ATP, w związku z czym, utlenienie trzech cząsteczek trójstearyny odpowiada syntezie 0 cząsteczek ATP. Należy jednak pamiętać, że aktywacja każdej cząsteczki wyższego kwasu tłuszczowego wymaga obecności jednej cząsteczki ATP i dlatego w wyniku utleniania trzech cząsteczek kwasu stearynowego do acetylo-coa powstanie ich 7. Zakładając, że wszystkich 7 reszt acylowych acetylo-coa powstających z każdej cząsteczki tristearyny ulega całkowitemu utlenieniu w cyklu kwasów dwu-
5 Podstawy biochemii i trójkarboksylowych, w warunkach sprzężenia z fosforylowaniem zostaną utworzone 4 cząsteczki ATP (przy utlenieniu każdej reszty acetylowej w cykle odbierane są 4 pary atomów wodoru, co odpowiada 4 = cząsteczkom ATP; 7 = 4 cząsteczek ATP). Tak więc cały proces rozpadu trójstearyny związany jest z utworzeniem 46 ( + 7 + 4) cząsteczek ATP, co stanowi 4,% całkowitej ilości energii wydzielanej przy spalaniu tego związku i jest porównywalne ze stopniem jej kumulowania podczas utleniania węglowodanów. Dlatego też tłuszcze wraz z węglowodanami stanowią główne źródło energii organizmu.