Zakład Diagnostyki Biochemicznej Uniwersytet Medyczny w Białymstoku Profil glikozylacji transferyny w chorobach wątroby dr n. med. Ewa Gruszewska Kraków, 5.09.2017 r.
Rola wątroby w procesie glikozylacji Większość glikozylowanych białek (glikoprotein) krwi jest syntetyzowanych w wątrobie Biosynteza N- i O-glikanów zachodzi w komórkach wątrobowych protrombina globulina APARAT GOLGIEGO angiotensynogen fibrynogen RETIKULUM ENDOPLAZMATYCZNE
Rola wątroby w procesie glikozylacji receptory powierzchniowe dla większości glikoprotein krążących we krwi połączenie z receptorami - dzięki rozpoznaniu odpowiednich sekwencji N-glikanów glikoprotein struktura i rozmieszczenie receptorów na powierzchni hepatocytów zmieniają się w chorobach wątroby, dlatego może dochodzić do nagromadzenia glikoprotein w krążeniu
Zaburzenia glikozylacji w chorobach wątroby ALKOHOLOWA CHOROBA WĄTROBY (ALD) Przewlekłe nadużywanie alkoholu zmienia normalną mikroheterogenność TF w wyniku zmiany zawartości kwasu sjalowego (SA). odsetek izoform transferyny ze zmniejszoną (<3) ilością SA i/lub pozbawionych całych łańcuchów N-glikanów - transferyna ubogowęglowodanowa (CDT). CDT = asjalo- + monosjalo- + disjalo-transferyna Przyczyną zaburzeń są zmiany aktywności enzymów: aktywności 2,6-sjalilotransferazy (mrna) aktywności sjalidazy związanej z błonami hepatocytów zmiana aktywności innych transferaz ( mannozylo- czy galaktozylotransferazy).
Zaburzenia glikozylacji w chorobach wątroby ALKOHOLOWA CHOROBA WĄTROBY (ALD) Pojawiają się inne glikoproteiny o zmienionej glikozylacji: 1-kwaśna glikoproteina; 1-antytrypsyna; ceruloplazmina Kandydatem na marker ALD jest haptoglobina. Główne zmiany: fukozylacja (hiperfukozylacja 1-3) N-glikanu ilość rozgałęzień N-glikanu - nie jest charakterystyczna dla alkoholowej marskości, występuje także w PBC i w przewlekłym nadużywaniu alkoholu, lecz jest nieobecna w aktywnym zapaleniu wątroby Zwiększona ilość rozgałęzień N-glikanu w ALD, poza haptoglobiną, występuje także w: 2-6ST 1-4GalT 1-3ManT kwas sjalowy galaktoza N-acetyloglukozamina mannoza 1-kwaśnej glikoproteinie 2-HS-glikoproteinie transferynie 1-6 fukoza
Zaburzenia glikozylacji w chorobach wątroby CHOROBY DRÓG ŻÓŁCIOWYCH Zwiększona fukozylacja N-glikanów glikoprotein w żółci: 1-antytrypsyny 1-kwaśnej glikoproteiny haptoglobiny Glikoproteiny te wykazują większy indeks fukozylacji w żółci niż we krwi, co może być sygnałem sekrecji tych glikoprotein do przewodów żółciowych. 1-6 kwas sjalowy galaktoza N-acetyloglukozamina mannoza fukoza
Zaburzenia glikozylacji w chorobach wątroby WIRUSOWE CHOROBY WĄTROBY Hepatocyty zainfekowane HBV wykazują zwiększoną ekspresję GnT-III: zwiększona akumulacja apob ze zwiększoną ilością N-acetyloglukozaminy akumulacja CH i TG w hepatocytach W komórkach hepatoblastoma zainfekowanych wirusem HBV aktywność GnT-III zmniejsza się (zmniejszenie transkryptu GnT-III), a aktywność innych glikozylotransferaz (w tym GnT-V) pozostaje niezmieniona.
Zaburzenia glikozylacji w chorobach wątroby WIRUSOWE CHOROBY WĄTROBY AGP jako czynnik dyskryminujący pomiędzy chorobami wątroby: hiperfukozylacja wiązaniem α1-3 glikozydowym - we wszystkich chorobach wątroby, w szczególności infekcji HBV i HCV; dodatkowa N-acetylogalaktozamina w infekcji HCV; zwiększona ilość rozgałęzień. 1-3FT 1-3 GnT-III GnT-V kwas sjalowy galaktoza N-acetyloglukozamina mannoza 1-6 fukoza
Zaburzenia glikozylacji w chorobach wątroby Zaburzenia glikozylacji w raku wątrobowokomórkowym (HCC) są podobne do tych w infekcji HBV. NOWOTWORY WĄTROBY Długoterminowa infekcja HBV koreluje ze zwiększonym ryzykiem HCC. GnT-III GnT-V kwas sjalowy galaktoza Związek z HCC udokumentowano dla 3 enzymów: N-acetyloglukozamina mannoza 1-6FT GnT-III GnT-V 1-6 fukoza
Zaburzenia glikozylacji w chorobach wątroby NOWOTWORY WĄTROBY Charakterystyczną zmianą jest: zwiększone stężenie fukozylowanej -fetoproteiny (AFP) i α1- antytrypsyny (AAT) zwiększenie ilości rozgałęzień glikanów czyli tzw. anten w AFP i AAT w przebiegu HCC. W AFP pochodzenia nowotworowego wykrywane są fukozylowane tri-, tetrai penta-antenowe glikany. Jednak najczęściej występują fukozylowane diantenarne struktury. Zmiany te są związane ze wzrostem aktywności enzymów: 1-6FT, GnT-III i GnT-V (dobra korelacja ze strukturą glikanów).
Transferyna białko syntetyzowane głównie w wątrobie, ale także w: komórkach glejowych, komórkach Sertoliego i układzie siateczkowośródbłonkowym występuje we krwi, PMR, płynie owodniowym, mleku kobiecym i nasieniu N-glikoproteina o m. cz. 79,57 kda i okresie półtrwania w krążeniu 8-10 dni ruchliwość elektroforetyczna β-globulin
Budowa transferyny jeden łańcuch polipeptydowy - 679 aminokwasów i dwa boczne łańcuchy węglowodanowe typu złożonego łańcuch białkowy utworzony z dwóch części (N- (336 aminokwasów) i C-końcowej (343 aminokwasów)) o 40% homologii sekwencji, zawierających po dwie domeny każda, pomiędzy którymi znajduje się jedno miejsce o wysokim powinowactwie do wiązania żelaza posiada dwa miejsca wiązania Fe 3+ N C kwas sjalowy galaktoza N-acetyloglukozamina mannoza Fe 3+ Fe 3+
Heterogenność cząsteczki transferyny Genetycznym polimorfizmem cząsteczki transferyny Różnicą w ilości transportowanych jonów żelaza Różnorodnością reszt cukrowych transferyny
Heterogenność cząsteczki transferyny Genetycznym polimorfizmem cząsteczki transferyny ponad 20 polimorficznych form TF Różnicą w ilości transportowanych jonów żelaza warianty TF (grupy cząsteczek TF o identycznej strukturze bocznych łańcuchów) są determinowane przez allele wielokrotne tego samego locus i różnią się między sobą pojedynczymi nukleotydami, ale większość z nich wykazuje taką samą zdolność do wiązania żelaza Różnorodnością reszt cukrowych transferyny
Heterogenność cząsteczki transferyny Genetycznym polimorfizmem cząsteczki transferyny Różnicą w ilości transportowanych jonów żelaza wpływa na zmiany strukturalne cząsteczki Różnorodnością holotransferyna reszt cukrowych (holotf): 30% transferyny całkowitej TF; transportuje jeden jon żelaza w N-końcowej lub C- końcowej domenie lub dwa jony żelaza w każdej z domen apotransferyna (apotf): 70% całkowitej TF; nie jest wysycona żelazem i może je związać przechodząc w ten sposób w postać holotf
Heterogenność cząsteczki transferyny Genetycznym polimorfizmem cząsteczki transferyny Różnicą w ilości transportowanych jonów żelaza Różnorodnością reszt cukrowych transferyny reszty węglowodanowe przyłączone do rdzenia białkowego różnią się ilością cukrów oraz stopniem ich rozgałęzienia MIKROHETEROGENNOŚĆ
MIKROHETEROGENNOŚĆ TRANSFERYNY główna poboczna
Mikroheterogenność transferyny główna ma charakter jakościowy i dotyczy różnorodności struktur bocznych łańcuchów cukrowych (anten) warianty zawierające: jeden łańcuch dwuantenarny dwa jednakowe łańcuchy dwu, trzy lub czteroantenarne dwa różne łańcuchy dwu i trzy lub trzy i czteroantenarne cząsteczka apotf (przypuszczalnie wariant TF3), posiadająca dwa łańcuchy dwuantenarne zakończone resztami kwasu sjalowego, które nadają cząsteczce TF ładunek ujemny
Mikroheterogenność transferyny poboczna jest uwarunkowana zawartością i rodzajem reszt węglowodanowych tworzących łańcuch oligosacharydowy poszczególne warianty mogą zawierać: cukry nietypowe dla glikoprotein, jak np. reszty fukozy, N-acetylogalaktozaminy dodatkowe reszty kwasu sjalowego, galaktozy lub N-acetyloglukozaminy
Izoformy transferyny
IZOFORMA LICZBA RESZT KWASU SJALOWEGO ZAWARTOŚĆ WE KRWI [%] PUNKT IZOELEKTRYCZNY [pi] Asjalo-TF 0 < 0,5 5,9 Monosjalo-TF 1 < 0,9 5,8 Disjalo-TF 2 < 2,5 5,7 Trisjalo-TF 3 4,5-9,0 5,6 Tetrasjalo-TF 4 64-80 5,4 Pentasjalo-TF 5 12-18 5,3 Heksasjalo-TF 6 1-3 5,3 Heptasjalo-TF 7 < 1,5 5,1 Oktasjalo-TF 8 < 0,5 -
IZOFORMA LICZBA RESZT KWASU SJALOWEGO ZAWARTOŚĆ WE KRWI [%] PUNKT IZOELEKTRYCZNY [pi] Asjalo-TF 0 < 0,5 5,9 Monosjalo-TF 1 < 0,9 5,8 Disjalo-TF 2 < 2,5 2,5 5,7 5,7 Trisjalo-TF 3 4,5-9,0 5,6 5,6 Tetrasjalo-TF 4 64-80 5,4 Pentasjalo-TF 5 12-18 5,3 Heksasjalo-TF Heksasjalo-Tf 5,3 6 1-3 5,3 Heptasjalo-TF 7 < 1,5 5,1 Oktasjalo-TF 8 < 0,5 -
IZOFORMA LICZBA RESZT KWASU SJALOWEGO ZAWARTOŚĆ WE KRWI [%] PUNKT IZOELEKTRYCZNY [pi] Asjalo-TF 0 < 0,5 5,9 Monosjalo-TF 1 < 0,9 5,8 Disjalo-TF 2 < 2,5 5,7 Trisjalo-TF 3 4,5-9,0 5,6 Tetrasjalo-TF 4 64-80 5,4 Tetrasjalo-TF 4 64-80 5,4 Pentasjalo-TF 5 12-18 5,3 Heksasjalo-TF 6 1-3 5,3 Heptasjalo-TF 7 < 1,5 5,1 Oktasjalo-TF 8 < 0,5 -
Cel badań Ocena wpływu chorób wątroby na profil izoform transferyny i przydatności tego badania w diagnostyce podstawowej i różnicowej schorzeń tego narządu
Metody diagnostyczne Izoformy transferyny Metoda elektroforezy kapilarnej (CE); MINICAP system, odczynniki firmy Sebia
Grupa badana: pacjenci z Kliniki Chorób Zakaźnych i Hepatologii USK w Białymstoku marskość alkoholowa marskość niealkoholowa toksyczne zapalenie wątroby Grupa kontrolna: pacjenci zgłaszający się na badania kontrolne do Poradni Medycyny Pracy USK w Białymstoku Materiał do badań: próbki surowicy otrzymane z krwi żylnej, które do czasu oznaczenia przechowywano w temp. -86 C Gudowska M, Gruszewska E, Panasiuk A, Cylwik B, Swiderska M, Flisiak R, Szmitkowski M, Chrostek L: Changed profile of serum transferrin isoforms in liver diseases Clin Lab 2017, 63: 349-354.
PUNKTY KLASA Skala Childa-Pugh 5-6 A 7-9 B 10-15 C PARAMETR 1 punkt 2 punkty 3 punkty jednostki Bilirubina < 2 (< 35) 2-3 (35-50) > 3 (> 50) mg/dl (μmol/l) Albumina > 3,5 2,8-3,5 < 2,8 g/dl Czas protrombinowy /INR < 5 < 1,70 5-10 1,70-2,20 > 10 > 2,20 w sekundach ponad normę Wodobrzusze brak łagodne umiarkowane Encefalopatia wątrobowa brak stopień 1-2 stopień 3-4
Grupa badana w zależności od skali Childa-Pugh 27 35
Wyniki
Stężenie TF w chorobach wątroby 4,5 4,0 3,5 Mediana 25%-75% Min-Maks P<0,001 P=0,030 Transferyna (g/l) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 P=0,013 0,0 K MA MNA TZW
Disjalo-TF w chorobach wątroby 6 5 P=0,013 Disjalo-TF (%) 4 3 2 1 P=0,019 0-1 K MA MNA TZW Mediana 25%-75% Min-Maks
Trisjalo-TF w chorobach wątroby 16 14 P<0,001 Mediana 25%-75% Min-Maks 12 Trisjalo-TF (%) 10 8 6 P=0,004 P=0,001 4 2 0 K MA MNA TZW
Tetrasjalo-TF w chorobach wątroby 90 88 86 84 Mediana 25%-75% Min-Maks P=0,011 Tetrasjalo-TF (%) 82 80 78 76 74 72 70 68 66 64 K MA MNA TZW
Pentasjalo-TF w chorobach wątroby 35 30 Pentasjalo-TF (%) 25 20 15 10 5 0-5 Mediana 25%-75% Min-Maks K MA MNA TZW
Izoformy transferyny w zależności od skali Childa-Pugh * & # * - istotnie niższe niż w A i B (P<0,001; P=0,003) # - istotnie wyższe niż w A (P=0,002) & - istotnie wyższe niż w A i B (P<0,001; P<0,001)
Wnioski 1. Profil izoform transferyny zmienia się w zależności od choroby wątroby: w marskości zmiana ta dotyczy form bardziej usjalowanych w zapaleniu wątroby - mniej usjalowanych. 2. Zmiany w profilu izoform transferyny nie zależą od etiologii marskości wątroby. 3. Profil izoform transferyny zależy od stopnia zaawansowania marskości wątroby: u chorych z najcięższym uszkodzeniem narządu dochodzi do największych przesunięć tego profilu.
Wnioski 4. Izoformy transferyny mogą być przydatne w diagnostyce różnicowej chorób wątroby: trisjalo- i tetrasjalotransferyna do różnicowania marskości wątroby o etiologii alkoholowej z toksycznym zapaleniem wątroby; disjalotransferyna - marskości niealkoholowej z toksycznym zapaleniem wątroby.
Izoformy transferyny w wirusowych zapaleniach wątroby
Grupa badana: pacjenci z Kliniki Chorób Zakaźnych i Hepatologii USK w Białymstoku wirusowe zapalenie wątroby typu B wirusowe zapalenie wątroby typu C Grupa kontrolna: pacjenci zgłaszający się na badania kontrolne do Poradni Medycyny Pracy USK w Białymstoku Materiał do badań: próbki surowicy otrzymane z krwi żylnej, które do czasu oznaczenia przechowywano w temp. -86 C Gruszewska E, Wrona A, Gudowska M, Panasiuk A, Cylwik B, Lipartowska-Klimuk K, Flisiak R, Chrostek L: The transferrin isoforms in chronic hepatitis. Clin Biochem 2017, DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2017.06.013.
Wyniki
Izoformy transferyny w wirusowych zapaleniach wątroby 6 5 Median 25%-75% Min - Max 92 90 88 Median 25%-75% Min-Max P<0,001 P<0,001 86 Disialotransferrin [%] 4 3 2 1 P=0,041 Tetrasialotransferrin [%] 84 82 80 78 76 74 72 70 0 68 66 P=0,045-1 K HBV HCV 64 K HBV HCV Trisialotransferrin [%] 10 9 8 7 6 5 4 3 2 Median 25%-75% Min-Max P<0,001 Pentasialotransferrin [%] 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 Median 25%-75% Min-Max P<0,001 P<0,001 1 0 10 8 6-1 K HBV HCV 4 K HBV HCV
Izoformy transferyny w zależności od zaawansowania choroby Disjalotransferyna Tetrasjalotransferyna 1,5 82 1 0,5 0 G1 G2 S 1 2 3 4 80 78 76 G1 G2 S 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 Trisjalotransferyna Pentasjalotransferyna 8 20 6 4 2 0 G1 G2 S 1 2 3 4 15 10 5 0 G1 G2 S 1 2 3 4 1 2 3 4 G1 - aktywność zapalna; wrotne/okołowrotne G2 - aktywność zapalna; śródzrazikowe S - włóknienie 1 2 3 4
Izoformy transferyny w zależności od zaawansowania choroby Disjalotransferyna Tetrasjalotransferyna 1,5 1 0,5 0 4 Trisjalotransferyna 3 2 1 G1 G2 S * 1 2 3 4 8 6 4 2 0 G1 G2 S 82 80 78 76 # & 20 15 2 10 1 5 0 3 G1 G2 S 1 2 3 4 Pentasjalotransferyna 4 * - istotnie wyższe niż w st. 3 (P=0,029) # - istotnie wyższe niż w st. 2 (P=0,014) & - istotnie wyższe niż w st. 2 i 1 (P=0,016; P=0,014) G1 G2 S 1 1 2 2 3 3 4 4 1 2 3 4 G1 - aktywność zapalna; wrotne/okołowrotne G2 - aktywność zapalna; śródzrazikowe S - włóknienie 1 2 3 4
Wnioski 1. W wirusowym zapaleniu wątroby typu B oraz C dochodzi do zaburzeń procesu glikozylacji transferyny i zmian profilu izoform transferyny. 2. Ocena profilu izoform transferyny może być pomocnym nieinwazyjnym badaniem do różnicowania wirusowego zapalenia wątroby typu B i C. 3. Trisjalotransferyna może być użytecznym narzędziem w ocenie stopnia włóknienia miąższu wątroby i ocenie stopnia aktywności zapalnej u chorych z wirusowymi zapaleniami wątroby.
Dziękuję za uwagę!