Techniki immunochemiczne opierają się na specyficznych oddziaływaniach między antygenami a przeciwciałami
Oznaczanie immunochemiczne RIA - ( ang. Radio Immuno Assay) techniki radioimmunologiczne EIA - (ang. Enzyme Immuno Assay) techniki immunoenzymatyczne ELISA - (ang. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) test immunoenzymosorbcyjny Immunoblotting (Western blotting) Immunostrącanie Chromatografia immunopowinowactwa
Metody immunochemiczne
ELISA
TYPY TESTU ELISA Bezpośredni Pośrednie
Schemat reakcji ELISA wykonywanych na ćwiczeniach
Techniki chromatograficzne (rozdzielcze) - chromatografia gazowa (GC) - - nisko- i wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC) - - elektroforeza kapilarna (CE) -
Zastosowanie metod chromatograficznych w analizie materiału biologicznego Każdy układ biologiczny jest mieszaniną substancji chemicznych. Analiza poszczególnych składników takiego układu wymaga często ich wcześniejszego rozdzielenia. Termin chromatografia oznacza efekt rozdziału (separacji) składników mieszaniny, obserwowany podczas ich przepływu z fazą ruchomą wzdłuż powierzchni fazy nieruchomej (stacjonarnej). Cząsteczki składników mieszaniny, które słabo oddziałują z fazą nieruchomą, są szybciej unoszone przez płynącą fazę ruchomą, zaś cząsteczki przyciągane mocniej poruszają się wolniej. Fazą stacjonarną może być ciało stałe, ciecz na stałym nośniku lub żel, a fazą ruchomą może być gaz lub ciecz. kolumna chromatograficzna
Przykładowe rodzaje metod chromatograficznych: Ekstrakcja z fazy stałej (SPE) Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) Chromatografia gazowa (GC) Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) Elektroforeza kapilarna (CE) Każdy proces chromatograficzny składa się z trzech etapów: dozowanie próbki rozdział składników detekcja rozdzielonych składników detektor
Wysokosprawna (wysokociśnieniowa) chromatografia cieczowa (HPLC)
Zestaw do wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej Od prawej: komputer sterujący aparatem i rejestrujący dane, pompa z zaworem dozującym, kolumna wewnątrz termostatu i różnego rodzaju detektory rozdzielanych substancji, np. UV-vis, fluorescencyjny, MS-MS.
HPLC
Przykładowy chromatogram uzyskany metodą HPLC (detektor fluorescencyjny)
HPLC - rozdział składników Kolumny chromatograficzne
HPLC dozowanie próbki
HPLC - detekcja składników
HPLC - detekcja składników
Chromatografia gazowa - GC
Chromatografia gazowa - GC
RESET Chromatografia gazowa - GC H Gas Carrier Hydrogen Air
Chromatogram GC składników soku z pomarańczy
Wpływ warunków termicznych na rozdział w GC Warunki rozdziału: (a) izotermiczny w 45 o C (b) izotermiczny w 145 o C (c) programowany w 30 o C do 180 o C
Kolumna GC dozowanie próbki
Kolumny kapilarne stosowane w chromatografii gazowej
Przekroje kolumn do GC w powiększeniu
Fazy stacjonarne w kolumnach kapilarnych Najbardziej znanym typem faz stacjonarnych są polisiloksany. Każdy atom krzemu w łańcuchu zawiera dwie grupy funkcyjne. Typ i ilość grup decyduje o właściwościach fazy stacjonarnej, a tym samym kolumny. Poli(dimetylosiloksan) Poli(35% - difenylo- 65% dimetylosiloksan)
GC - detekcja składników - FID
Flow Flow GC - detekcja składników - TCD Uniwersalny detektor cieplno-przewodnościowy (TCD) Drut oporowy wewnątrz detektora jest chłodzony przez przepływający gaz nośny Kiedy w gazie nośnym pojawia się inna substancja, właściwości chłodzące gazu nośnego się zmieniają. Generuje to powstawanie sygnału w detektorze
Techniki łączone
Zastosowanie instrumentalnych technik analitycznych do detekcji w chromatografii gazowej i HPLC (techniki łączone) Chromatograf Spektrometr mas Spektrometr podczerwieni Spektrometr absorpcji atomowej Jądrowy rezonans magnetyczny - HPLC-MS, GC-MS - HPLC-IR, GC-IR - HPLC-AAS, GC-AAS - HPLC-NMR, GC-NMR Techniki instrumentalne nie tylko wykrywają obecność substancji, ale również dokonują jej analizy, przez co potwierdzają autentyczność mierzonej substancji w danym szczycie sygnału.
Chromatografia gazowa sprzężona ze spektometrią mas
Chromatografia gazowa sprzężona ze spektometrią mas - Detektor wykonuje co sekundę widmo masowe (skan) wycieku z kolumny. - Analizowane są jony o masach większych niż jony gazu nośnego. - Każda substancja ma charakterystyczne dla siebie widmo mas.
Analizy jakościowa i ilościowa w GC i HPLC
Podstawy analizy jakościowej i ilościowej w GC i HPLC Czas, w którym substancja przechodzi przez kolumnę nazywany jest czasem retencji (t R ). Czas retencji przypisany jest pikowi odpowiadającemu danej substancji. Jest to więc podstawowy parametr identyfikujący substancję w analizie GC i HPLC.
Tematy ćwiczeń Zadanie 1. Wykrywanie wirusa pelargonii PFBV metodą immunoenzymatyczną. Zadanie 2. Oznaczanie zawartości witaminy C w sokach z warzyw i owoców metodą HPLC. Zadanie 3. Oznaczanie produkcji etylenu przez rośliny metodą GC-FID. Zadanie 4. Analiza jakościowa auksyn metodą GC-MS.