ĆWICZENIE 5 Barwniki roślinne Ekstrakcja barwników asymilacyjnych 400 mg - zhomogenizowany w ciekłym azocie proszek z natki pietruszki 6 ml - etanol 96% 2x probówki plastikowe typu Falcon na 15 ml 5x probówki szklane waga laboratoryjna Do dwóch plastikowych probówek na 15 ml odwazyć po 200 mg zhomogenizowanego wcześniej w ciekłym azocie proszku z natki pietruszki. Do pierwszej wlać 6 ml wody destylowanej a do drugiej 6 ml 96% etanolu. Obie probówki wstawić na 5 min do wrzącej łaźni wodnej a następnie odwirować przez 5 min. Z każdej z probówek pobrac delikatnie nadsącz (tak aby nie naruszyć peletu) do czystych szklanych probówek. Porównac zabarwienie ekstraktu wodnego i etanolowego. Następnie ekstrakt etanolowy rozpipetować po ok 2 ml do trzech kolejnych pobówek i pozostawic do dalszych doświadczeń. Rozpuszczalnik H 2 0 Etanol 96% Zabarwienie Rozpuszczalność chlorofilu ekstrakt etanolowy z poprzedniego doswiadczenia 3 ml benzyna ekstrakcyjna 1x probówka szklana Do jednej z probówek z alkoholowym ekstraktem chlorofilu z poprzedniego doświadczenia dolać około 1,5 razy więcej benzyny ekstrakcyjnej, przez chwilę mocno wytrząsać, a następnie probówkę odstawić do statywu do ponownego rozdzielenia się mieszaniny. Zanotować zabarwienie górnej i dolnej warstwy cieczy. Warstwa Rozpuszczalnik Zabarwienie Barwniki asymilacyjne górna dolna 19
Reakcja chlorofilu z zasadami ekstrakt etanolowy z pierwszego doswiadczenia 2,5 ml benzyna ekstrakcyjna 0,5 ml - 10% NaOH 1x probówka szklana 3x pipetka plastikowa Do 2 ml etanolowego ekstraktu chlorofilu z pierwszego doświadczenia dodać 0,5 ml roztworu zasady sodowej, wymieszać i wstawić na 2 min do wrzącej łaźni wodnej. Po ochłodzeniu roztworu dodać 2,5 ml benzyny ekstrakcyjnej, wstrząsnąć i odstawić probówkę do rozdzielenia się warstw cieczy. Zanotować zabarwienie górnej i dolnej warstwy cieczy. Porównac zabarwienie warstw z poprzednim doswiadczeniem Warstwa Rozpuszczalnik Zabarwienie Barwniki asymilacyjne górna dolna Reakcja chlorofilu z kwasami ekstrakt etanolowy z pierwszego doswiadczenia 1 ml 10% HCl 2 kryształki - octan miedzi 2x probówka szklana Do probówki z 2 ml etanolowego ekstraktu chlorofilu z doświadczenia pierwszego dodać 5-6 kropli 10% kwasu solnego i dokładnie wymieszać. Zanotować zabarwienie ekstraktu. Część roztworu odlać do czystej probówki i pozostawić dla kontroli, a do pozostałej objętości wrzucić 2 kryształki octanu miedzi i ogrzać na wrzącej łaźni wodnej. Porównać zabarwienia roztworów. Roztwór ekstrakt alkoholowy chlorofilu ekstrakt + kwas feofityna + octan miedzi Barwa roztworu 20
Oznaczanie zawartości barwników asymilacyjnych metodą spektrofotometryczną Odczynniki: zhomogenizowany i zliofilizowany proszek z liści 6 gatunków roślin 80% buforowany aceton (200 ml buforu fosforanowego ph 7,8 + 800 ml acetonu) Bufor fosforanowy ph 7,8 2,5mM 4stC (Na2HPO4 7H2O (268,07mg/mmol) 0,55g/L i NaH2PO4 bezw (120 mg/mmol) 0,05g/L) 25% HCl na 1 gr (5 zespołów) potrzeba: zhomogenizowany i zliofilizowany proszek z liści 6 gatunków roślin: 6x 100 mg 80% buforowany aceton: 105 ml 25% HCl: 3,5 ml Sprzęt: Spektrofotometr wytrząsarka łaźnia wodna łaźnia lodowa probówki eppendorfa 1,5ml Probówki PP zakręcane (bo do wrzącej łaźni wodnej) (co najmniej 7-15ml) Kuwety szklane pipety szklane i automatyczne Procedura: przygotować 6 probówek 10 ml do każdej odważyć ok 20mg liofilizowanego proszku z rożnych gatunków roślin dodać 3 ml buforowanego acetonu o temp 4stC wytrząsać przez 30 min zwirować 10 min 5000 rcf 4stC zlać zwirowane ekstrakty do cylindra miarowego i uzupełnić do 3 ml buforowanym acetonem 80% po czym przelać do nowej probówki i zatkać Z ekstraktu pobrać 1 ml dodać 1 ml 80% acetonu i oznaczyć absorbancje (program chlo1mz). Jeżeli absorbancja 0,2-0,8 ok, jeżeli za duża zmienić rozcieńczenie. Jako referencję wlać 80% buforowany aceton 2ml Oznaczyć pozostałe próbki już z docelowym rozcieńczeniem. Ekstrakt pozostały w probówce wylać a probówkę zostawić do oznaczeń feofityny. Kuwetę po oznaczeniu na chlo1mz zlać do probówki i dodać 50 ul/ml 25% HCL w celu przekształcenia do feofityny. Po dokonaniu wszystkich oznaczeń na chlo1mz rozpocząć oznaczanie feofityny na programie chlofeo. W tym celu przelać zawartość probówki do kuwety i wstawić do spektrofotometru. Jako referencji użyć 2 ml acetonu buforowanego 80% z dodatkiem 25% HCL (50uL/ml) obliczyć zawartość chlorofilu, karotenoidów i feofityny z następujących wzorów: Obliczenia 21
wg Porra et al 1989 Chlorofil A = 12,25*A663,6-2,55*A646,6 (ug/ml) Chlorofil B = 20,31*A646,6-4,91*A663,6 (ug/ml) Chlorofil A + B = 17,76*A646,6 + 7,34*A663,6 (ug/ml) wg Lichtenthaller 1987 Karotenoidy = (1000 *A470 1,82CA 85,02CB)/198 (ug/ml) Feofityna całkowita = 3,84*A665,4+33,36*A653,4 (ug/ml) w celu przeliczenia na g suchej masy wyniki pomnożyć przez rozcieńczenie próbek (2x) oraz końcową objętość ekstraktu (3 ml) i podzielić przez 1000*masa naważki (mg/g sm) Chromatografia bibułowa barwników asymilacyjnych 200 mg proszku z liści szpinaku odważyć w probówce na 7 ml. Zalać 4 ml 96% alkoholem etylowym. Wytrząsać przez kilka minut. Przesączyć do probówki przez bibułę filtracyjną umieszczoną w lejku. Ekstrakt przechowywać w łaźni lodowej w ciemności. Na pasek bibuły o szerokości 1.5 cm i długości 20 cm nanieść kapilarą wyciąg barwników z liści w następujący sposób: 2 cm od końca paska bibuły nanosić krople barwników do momentu aż powstanie linii. Zostawić bibułę do wysuszenia. Zabieg nanoszenia powtórzyć kilka razy aż powstanie ciemnozielona linia grubości kilku mm. Do szklanej probówki nalać 2-3 cm 3 mieszaniny rozwijającej: eter naftowy+aceton 9:1. Włożyć pasek bibuły do probówki i zanurzyć koniec paska tak aby pasek barwników był około 1 cm nad roztworem rozwijającym. Po rozwinięciu chromatogramu wyjąć bibułę i wysuszyć. Właściwości antocyjanin i betacyjanidyn 200 mg - zhomogenizowany w ciekłym azocie proszek z liści kapusty czerwonej 22
200 mg - zhomogenizowany w ciekłym azocie proszek z buraka czerwonego 2x probówki plastikowe typu Falcon na 15 ml 1 ml 10% HCl 1 ml 10% NaOH 6x probówki szklane 5x pipetka plastikowa waga laboratoryjna Do dwóch plastikowych probówek na 15 ml odwazyć: do pierwszej 200 mg zhomogenizowanego wcześniej w ciekłym azocie proszku z z liści kapusty czerwonej, do drugiej 200 mg zhomogenizowanego wcześniej w ciekłym azocie proszku z buraka czerwonego. Do każdej probówki wlać 6 ml wody destylowanej. Obie probówki wstawić na 5 min do wrzącej łaźni wodnej a następnie odwirować przez 5 min. Przygotować sześć szklanych probówek. Do probówki nr 1, 2 i 3 dodac delikatnie po ok. 2 ml nadsączu (tak aby nie naruszyć peletu) z roztworu wodnego z liści kapusty, a do probówek nr 4, 5 i 6 po ok. 2 ml nadsączu z wodnego roztworu z buraka. Następnie do probówek 1 i 4 dodać 6 kropli 10% HCl, do probówek 2 i 5 dodać 6 kropli wody destylowanej, do probówek 3 i 6 dodać 6 kropli 10% NaOH. Porównać zabarwienie w probówkach. 23