(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP00/02467 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 203917 (21) Numer zgłoszenia: 355264 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 17.03.2000 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 17.03.2000, PCT/EP00/02467 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 28.09.2000, WO00/56359 PCT Gazette nr 39/00 (51) Int.Cl. A61K 39/09 (2006.01) A61K 39/385 (2006.01) A61K 39/39 (2006.01) A61P 31/04 (2006.01) (54) Kompozycja immunogenna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie (30) Pierwszeństwo: 19.03.1999,GB,9906437.0 20.04.1999,GB,9909077.1 23.04.1999,GB,9909466.6 15.07.1999,GB,9916677.9 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 05.04.2004 BUP 07/04 (73) Uprawniony z patentu: GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS S.A., Rixensart,BE (72) Twórca(y) wynalazku: Carine Capiau,Rixensart,BE Marguerite Deschamps,Rixensart,BE Pierre Michel Desmons,Rixensart,BE Craig Antony Joseph Laferriere,Rixensart,CA Jan Poolman,Rixensart,NL Jean-Paul Prieels,Rixensart,BE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.11.2009 WUP 11/09 (74) Pełnomocnik: Kossowska Janina, Rzecznik Patentowy, PATPOL Sp. z o.o. PL 203917 B1

2 PL 203 917 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest kompozycja immunogenna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie antygenów polisacharydowych oraz białkowych ze Streptococcus pneumoniae. Streptococcus pneumoniae jest Gram-dodatnią bakterią odpowiedzialną za znaczną zachorowalność i śmiertelność (w szczególności u osób młodych i w podeszłym wieku) powodującą inwazyjne choroby, takie jak zapalenie płuc, bakteriemię i zapalenie opon mózgowych, oraz choroby związane z kolonizacją takie jak ostre zapalenie ucha środkowego. Częstość zapalenia płuc powodowanego przez pneumokoki w USA dla osób w wieku ponad 60 lat ocenia się na 3 do 8 na 100000. W 20% przypadków prowadzi to do bakteriemii i innych objawów, takich jak zapalenie opon mózgowych, ze śmiertelnością bliską 30% nawet przy leczeniu antybiotykami. Pneumokoki są otoczone związanym chemicznie polisacharydem, który nadaje specyficzność serotypu. Znanych jest 90 serotypów pneumokoków i otoczka jest główną determinantą wirulencji pneumokoków, jako że otoczka chroni nie tylko wewnętrzną powierzchnię bakterii przed dopełniaczem, ale sama jest słabo immunogenna. Polisacharydy są antygenami T-niezależnymi i nie mogą być przetwarzane lub prezentowane na cząsteczkach MHC, aby reagowały z komórkami T. Mogą one jednak stymulować układ odpornościowy przez alternatywny mechanizm, który obejmuje krzyżowe połączenie receptorów powierzchniowych na komórkach B. Wykazano w kilku doświadczeniach, że ochrona przed inwazyjną chorobą pneumokokową jest najsilniej skorelowana z przeciwciałem specyficznym dla otoczki i ochrona jest specyficzna wobec serotypu. Szczepionki oparte na polisacharydach są dobrze znane w dziedzinie. Cztery, które zostały dopuszczone do stosowania u ludzi obejmują polisacharyd Vi Salmonella typhi, polisacharyd PRP z Haemophilus influenzae, tetrawalentną szczepionkę przeciw meningokokom złożoną z serotypów A, C, W135 i Y oraz 23-walentną szczepionkę pneumokokową złożoną z polisacharydów odpowiadających serotypom 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33 (co obejmuje przynajmniej 90% izolatów pneumokoków z krwi). Trzy ostatnie szczepionki dają ochronę przeciw bakteriom wywołującym zakażenia dróg oddechowych, powodującym poważną zachorowalność i śmiertelność u niemowląt. Jednak szczepionki te nie zostały dopuszczone do stosowania u dzieci poniżej dwóch lat, ponieważ nie są dostatecznie immunogenne w tej grupie wiekowej (Peltola i wsp. (1984) N. Engl. J. Med. 310: 1561-1566). Streptococcus pneumoniae jest najczęstszą przyczyną inwazyjnej choroby bakteryjnej i zapalenia ucha środkowego u niemowląt i małych dzieci. Podobnie, odpowiedzi odpornościowe u osób starszych na szczepionki pneumokokowe są słabe (Roughmann i wsp., (1987), J. Gerontol. 42: 265-270), stąd też w populacji tej występuje zwiększona zachorowalność na bakteryjne zapalenie płuc (Verghese i Berk, (1993) Medicine (Baltimore) 62: 271-285). Strategie, które zaprojektowano by pokonać ten brak immunogenności u niemowląt obejmują łączenie polisacharydu z dużymi immunogennymi białkami, które dostarczają pomocy obecnych komórek T i wpływają na pamięć immunologiczną w stosunku do polisacharydowego antygenu, z którym są koniugowane. Szczepionki koniugatów glikoprotein pneumokoków są obecnie oceniane pod kątem bezpieczeństwa, immunogenności i skuteczności w różnych grupach wiekowych. A) Pneumokokowe szczepionki polisacharydowe 23-walentna niekoniugowana szczepionka pneumokokowa wykazała znaczną zmienność skuteczności klinicznej, od 0% do 81% (Fedson i wsp. (1994) Arch. Intern. Med. 154: 2531-2535). Skuteczność wydaje się być związana z poddawaną szczepieniu grupą ryzyka, taką jak osoby starsze, osoby z chorobą Hodgkina, po usunięciu śledziony, z anemią sierpowatą i agammaglobulinemią (Fine i wsp. (1994) Arch. Intern. Med. 154: 2666-2677), a także z przejawami choroby. 23-walentna szczepionka nie dostarcza ochrony przed powodowanym przez pneumokoki zapaleniem płuc (w niektórych grupach wysokiego ryzyka, takich jak osoby starsze) i chorobami ucha środkowego. Istnieje więc zapotrzebowanie na ulepszone kompozycje szczepionek przeciwko pneumokokom, szczególnie takich, które będą bardziej skuteczne w zapobieganiu lub łagodzeniu choroby pneumokokowej (w szczególności zapalenia płuc) u osób starszych i małych dzieci. B) Wybrane kompozycje pneumokokowy koniugat polisacharydów + 3D-MPL Ogólnie przyjmuje się, że efekt ochronny handlowo dostępnej szczepionki przeciwko pneumokokom jest mniej lub bardziej związany ze stężeniem przeciwciała indukowanym po szczepieniu; faktycznie 23 polisacharydy były zaakceptowane do stosowania wyłącznie na podstawie immunogenności

PL 203 917 B1 3 każdego składowego polisacharydu (red. Williams i wsp. New York Academy of Sciences 1995 str. 241-249). Tak więc dalsze zwiększenie odpowiedzi przeciwciał na polisacharydy pneumokokowe mogłoby zwiększyć procent niemowląt i osób starszych odpowiadających ochronnymi poziomami przeciwciał na pierwszy zastrzyk polisacharydu lub koniugatu polisacharydu i mogłoby zmniejszyć dawkę i ilość zastrzyków wymaganych do indukcji ochronnej oporności na choroby powodowane przez Streptococcus pneumoniae. Od wczesnych lat dwudziestego wieku naukowcy eksperymentowali z dużą liczbą związków, które mogą być dodawane do antygenów, aby poprawić ich immunogenność w kompozycjach szczepionek (przegląd w M.F. Powell i M. J. Newman, Plenum Press NY, Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach (1995). Rozdział 7: A compendium of vaccine adjuvants and excipients ). Wiele z nich jest bardzo skutecznych, ale powoduje znaczące miejscowe i ogólnoustrojowe niekorzystne reakcje, które wykluczają ich stosowanie w kompozycjach szczepionek dla ludzi. Adiuwanty na bazie glinu (takie jak alum, wodorotlenek glinu lub fosforan glinu) opisane po raz pierwszy w 1926 r. pozostają jedynymi adiuwantami dopuszczonymi do stosowania w Stanach Zjednoczonych w szczepionkach ludzkich. Adiuwanty na bazie glinu są przykładem nośnikowej klasy adiuwantów działającej tylko przez efekt typu depot, który indukują. Antygen jest absorbowany na jego powierzchni i gdy kompozycja jest wstrzyknięta adiuwant i antygen nie są natychmiast rozproszone w krwiobiegu - zamiast tego kompozycja pozostaje w lokalnym otoczeniu wstrzyknięcia i powstaje bardziej wyraźna odpowiedź immunologiczna. Takie nośnikowe adiuwanty mają dodatkową znaną korzyść - są odpowiednimi do stabilizacji antygenów, które są podatne na rozkład, na przykład niektórych antygenów polisacharydowych. 3D-MPL jest przykładem adiuwanta nienośnikowego. Jego pełna nazwa to 3-O-deacylowany monofosforylolipid A (lub 3-De-O-acylowany monofosforylolipid A lub 3-O-dezacylo-4'-monofosforylolipid A) i jest określany jako 3D-MPL, aby wskazać, że pozycja 3 glukozoaminy na redukującym końcu jest de-o-acylowana. Jego preparatyka została opisana w GB 2220211. 3D-MPL chemicznie jest mieszaniną 3-deacylowanego monofosforylo lipidu A z 4, 5 lub 6 acylowanymi łańcuchami. Został oryginalnie wytworzony we wczesnych latach 1990-tych, gdy metoda 3-O-deacylacji 4'-monofosforylo pochodnej lipidu A (MPL) doprowadziła do uzyskania cząsteczki z dodatkowo zmniejszoną toksycznością i bez zmiany aktywności immunostymulującej. 3D-MPL był stosowany jako adiuwant albo sam albo korzystnie w kombinacji z adiuwantem typu depot, takim jak wodorotlenek glinu, fosforan glinu lub w emulsjach olej-w-wodzie. W takich kompozycjach antygen i 3D-MPL są zawarte w tych samych strukturach w postaci cząstek, pozwalając na bardziej skuteczne dostarczania antygenowych i immunostymulujących sygnałów. Badania wykazały, że 3D-MPL jest zdolny do dalszego zwiększenia immunogenności antygenu zaadsorbowanego na alumie (Thoelm i wsp. Vaccine (1998) 16: 708-14; EP 689454-B1). Takie kombinacje są także korzystne w dziedzinie dla antygenów podatnych na adsorpcję (na przykład, koniugatów polisacharydów bakteryjnych), przy czym adsorpcja na alumie zazwyczaj stabilizuje antygen. Strącone adiuwanty na bazie glinu są zazwyczaj stosowane jako, że są jedynymi adiuwantami, które są obecnie stosowane w dopuszczonych ludzkich szczepionkach. Tak więc szczepionki zawierające 3D-MPL w kombinacji z adiuwantami na bazie alum są preferowane w dziedzinie ze względu na łatwość ich opracowania i tempo wprowadzania na rynek. MPL (nie 3-deacylowany) był oceniany jako adiuwant z kilkoma monowalentnymi szczepionkowymi antygenami koniugatów polisacharydowych. Wspólne wstrzyknięcie MPL w roztworze soli zwiększało odpowiedź przeciwciał surowicy dla czterech monowalentnych koniugatów polisacharydów: PS 6B pneumokoków - toksoid tężca, PS 12 pneumokoków - toksoid dyfterytu, S. aureus typ 5 i S. aureus typ 8 skoniugowane z egzotoksyną A Pseudomonas aeruginosa (Schneerson i wsp. J. Immunology (1991) 147: 2136-2140). Stwierdzono, że zwiększone odpowiedzi są specyficzne wobec antygenu. MPL w emulsji olej-w-wodzie (adiuwant typu nośnika) powtarzalnie zwiększał działanie MPL w soli fizjologicznej ze względu na obecność MPL i antygenu w tej samej strukturze w postaci cząstek, i uważano, że jest to odpowiedni układ adiuwantowy do optymalnego dostarczania innych szczepionek koniugatów polisacharydów. Devi i wsp. (Infect. Immun. (1991) 59: 3700-7) oceniali wpływ adiuwanta MPL (nie 3-deacylowanego) w soli fizjologicznej na odpowiedź przeciwciał myszy na koniugat TT polisacharydu otoczki Cryptococcus neoformans. Gdy stosowano MPL równocześnie z koniugatem istniał tylko marginalny przyrost specyficznej odpowiedzi zarówno IgM i IgG wobec PS. Jednakże MPL miał znacznie większy

4 PL 203 917 B1 efekt, gdy był podany 2 dni po koniugacie. Wątpliwa jest praktyczność stosowania schematu szczepień, szczególnie u niemowląt, który wymaga opóźnienia w podawaniu MPL w stosunku do antygenu. Efekt adiuwantowy MPL z polisacharydami i koniugatami polisacharyd-białko wydaje się być zależny od składu. Ponownie, włączenie MPL do odpowiednich układów powolnego uwalniania (na przykład stosując adiuwant nośnikowy) dostarcza bardziej trwałego efektu adiuwantowego i obchodzi problem zgrania w czasie i opóźnionego podawania. Podsumowując, obecny stan techniki wykazuje, że dla danego antygenu będącego polisacharydem lub koniugatem polisacharyd-białko, gdy MPL lub 3D-MPL jest stosowany jako adiuwant jest on korzystnie stosowany razem z adiuwantem nośnikowym (na przykład adiuwantami na bazie glinu), aby zmaksymalizować działanie immunostymulujące. Zadziwiające jest, że obecni twórcy stwierdzili, że dla pewnych pneumokokowych koniugatów polisacharydu immunogenność kompozycji szczepionki jest znacząco większa gdy antygen jest formułowany z samym 3D-MPL, raczej niż z 3D-MPL w połączeniu z adiuwantem nośnikowym (takim jak adiuwant na bazie glinu). Ponadto zaobserwowana poprawa jest niezależna od stosowanego stężenia 3D-MPL i od tego czy dane koniugaty są w kompozycji monowalentnej lub kombinowane z wytworzeniem kompozycji poliwalentnej. C) Koniugaty polisacharyd bakteryjny - białko D Jak wskazano powyżej szczepionki oparte na antygenach polisacharydowych są dobrze znane w dziedzinie. Dopuszczone szczepionki polisacharydowe wymienione powyżej mają różne wykazane skuteczności kliniczne. Szacowano, że polisacharydowa szczepionka Vi ma potwierdzoną w hodowli skuteczność między 55% i 77% w zapobieganiu durowi brzusznemu (Plotkin i Cam (1995) Arch. Intern. Med. 155: 2293-2299). Wykazano, że polisacharydowa szczepionka menongokoków C ma skuteczność 79% w warunkach epidemii (De Wals P. i wsp. (1996) Bull World Health Organ. 74: 407-411). 23-walentna szczepionka pneumokokowa wykazała szeroki zakres skuteczności klinicznej od 0% do 81% (Fedson i wsp. (1994) Arch. Intern. Med. 154: 2531-2535). Jak wskazano powyżej, przyjmuje się że ochronna skuteczność szczepionki pneumokokowej jest mniej lub bardziej zależna od stężenia przeciwciała indukowanego podczas szczepienia. Wśród problemów związanych z wykorzystaniem polisacharydów do szczepień, jest fakt że polisacharydy jako takie są słabymi immunogenami. Strategie zaprojektowane by przezwyciężyć ten brak immunogenności obejmują podłączenie polisacharydu do dużych, wysoce immunogennych nośników białkowych, które zapewniają pomoc obecnych komórek T. Przykłady tych wysoce immunogennych nośników, które są obecnie często stosowane do wytwarzania immunogenów polisacharydowych obejmują toksoid dyfterytu (DT lub mutant CRM197), toksoid tężca (TT), hemocyjaninę skałoczepu (KLH) i oczyszczoną białkową pochodną tuberkuliny (PPD). Problemy związane z często stosowanymi nośnikami Z każdym z tych powszechnie stosowanych nośników związane są problemy, w tym podczas wytwarzania koniugatów GMP, a także w immunologicznych właściwościach koniugatów. Mimo powszechnego stosowania tych nośników i ich skuteczności w indukowaniu odpowiedzi przeciwciał przeciwko polisacharydom, są one obarczone kilkoma wadami. Na przykład wiadomo, że specyficzne w stosunku do antygenu odpowiedzi odpornościowe mogą ulec supresji (supresja epitopu) przez obecność już istniejących przeciwciał skierowanych wobec nośnika, w tym przypadku toksynę tężca (Di John i wsp. (1989) Lancet 2: 1415-8). W ogólnej populacji bardzo wysoki procent ludzi będzie mieć uprzednio istniejącą odporność zarówno na DT i TT, jako że ludzie są rutynowo szczepieni tymi antygenami. W Wielkiej Brytanii na przykład 95% dzieci otrzymuje szczepionkę DTP zawierającą zarówno DT i TT. Inni autorzy opisali problem supresji epitopu na szczepionki peptydowe w modelach zwierzęcych (Sad i wsp. Immunology, 1991; 74: 223-227; Schutze i wsp. J. Immunol. 133: 4, 1985; 2319-2322). Ponadto, dla szczepionek, które wymagają regularnych dawek przypominających stosowanie wysoko immunogennych nośników, takich jak TT i DT prawdopodobnie zniesie odpowiedź przeciwciał na polisacharydy po kilku zastrzykach. Tym wielokrotnym szczepieniom mogą także towarzyszyć niepożądane odpowiedzi, takie jak nadwrażliwość typu opóźnionego (DTH). Wiadomo, że KLH jest silnym immunogenem i był już stosowany jako nośnik dla peptydów IgE w próbach klinicznych u ludzi. Jednak pewne niekorzystne reakcje (reakcje DTH-podobne lub uczulenie na IgE), jak i odpowiedzi przeciwciał przeciwko przeciwciałom były obserwowane. Tak więc wybór białka nośnikowego dla szczepionki opartej na polisacharydzie będzie wymagał zrównoważenia konieczności stosowania nośnika działającego u wszystkich pacjentów (szerokie

PL 203 917 B1 5 rozpoznawanie MHC), indukowania wysokich poziomów odpowiedzi przeciwciał przeciw polisacharydom oraz niskiej odpowiedzi przeciwciał przeciw nośnikowi. Uprzednio stosowane nośniki do szczepionek polisacharydowych mają więc wiele wad. Jest tak szczególnie w przypadku szczepionek kombinowanych, w których supresja epitopu jest szczególnym problemem, jeśli ten sam nośnik jest stosowany do różnych antygenów polisacharydowych. W WO 98/51339 podjęto próby obejścia tego zjawiska przez stosowanie wielokrotnych nośników w szczepionkach kombinowanych. Białko D (EP 0 594 610 B1) z Haemophilus influenzae lub jego fragmenty może być stosowane jako nośnik dla opartych na polisacharydach kompozycji immunogennych, w tym szczepionek. Stosowanie tego nośnika jest szczególnie korzystne w szczepionkach kombinowanych. Przedmiotem wynalazku jest kompozycja immunogenna zawierająca przynajmniej cztery antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae pochodzące od co najmniej czterech serotypów i przynajmniej dwa antygeny białkowe Streptococcus pneumoniae lub ich immunologicznie funkcjonalne ekwiwalenty. Korzystnie co najmniej jeden antygen białkowy w kompozycji według wynalazku jest białkiem zewnętrznej powierzchni lub wydzielanym białkiem Streptococcus pneumoniae lub jego immunologicznie funkcjonalnymi ekwiwalentami, korzystniej toksyną, adhezyną lub lipoproteiną Streptococcus pneumoniae lub ich immunologicznie funkcjonalnymi ekwiwalentami, przy czym najkorzystniej co najmniej jeden antygen białkowy lub jego immunologicznie funkcjonalny ekwiwalent jest wybrany z grupy obejmującej pneumolizynę, PspA lub jego transbłonowe warianty delecyjne, PspC lub jego transbłonowe warianty delecyjne, PsaA lub jego transbłonowe warianty delecyjne, dehydrogenazę gliceroaldehydo-3-fosforanową i CbpA lub jego transbłonowe warianty delecyjne. Również korzystnie w kompozycji według wynalazku polisacharydowe antygeny są prezentowane w postaci koniugatu polisacharyd-nośnik białkowy, przy czym korzystniej białko nośnikowe jest wybrane z grupy składającej się z: anatoksyny błonicy, anatoksyny tężca, CRM197, hemocyjaniny skałoczepu (KLH), pochodnej białkowej tuberkuliny (PPD) i białka D z H. influenzae. Kompozycja immunogenna według wynalazku korzystnie dodatkowo zawiera adiuwant. Korzystniej adiuwantem w kompozycji według wynalazku jest sól glinu lub preferencyjny induktor odpowiedzi TH1 obejmujący przynajmniej jedno z następujących: 3D-MPL lub jego pochodną saponinowy czynnik immunostymulujący, lub immunostymulujący oligonukleotyd CpG. Korzystnie adiuwantem jest też emulsja olej w wodzie i tokoferol. Najkorzystniej adiuwant w kompozycji według wynalazku obejmuje nośnik wybrany z grupy zawierającej: emulsję olej w wodzie, liposomy i sól glinu. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja immunogenna do zastosowania jako lek oraz szczepionka zawierająca kompozycję immunogenną według wynalazku. Wynalazek dostarcza również zastosowania co najmniej czerech antygenów polisacharydowych pneumokoków pochodzących od co najmniej czterech serotypów w kombinacji z co najmniej dwoma antygenami białkowymi Streptococcus pneumoniae i ewentualnie adiuwantem indukującym TH1, który obejmuje co najmniej jeden spośród 3D-MPL lub jego pochodnej, saponinowego czynnika immunostymulującego, lub immunostymulującego oligonukleotydu CpG, do wytwarzania leku do zapobiegania zapaleniu płuc u pacjentów w wieku powyżej 55 lat. Ponato przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompozycji immunogennej według wynalazku obejmujący etapy: - wybierania czterech lub więcej polisacharydowych antygenów pneumokoków; - wybierania dwóch lub więcej białkowych antygenów pneumokoków; i - zmieszania tych antygenów polisacharydowych i białkowych z odpowiednią zaróbką. W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza zastosowania co najmniej czerech antygenów polisacharydowych pneumokoków pochodzących od co najmniej czterech serotypów w kombinacji z co najmniej dwoma antygenami białkowymi Streptococcus pneumoniae do wytwarzania leku do zapobiegania lub łagodzenia zapalenia ucha środkowego u niemowląt lub młodszych dzieci. A) Szczepionki polisacharydowe pneumokoków Tak więc niniejszy wynalazek dostarcza kompozycji obejmującej antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae (korzystnie skoniugowane) i antygeny białkowe Streptococcus pneumoniae lub ich immunologicznie funkcjonalne ekwiwalenty, ewentualnie z adiuwantem Th1 (adiuwantem indukującym odpowiedź immunologiczną Th1). Kompozycje według wynalazku są szczególnie odpowiednie do leczenia zapalenia płuc u osób starszych.

6 PL 203 917 B1 Szczepionki polisacharydowe pneumokoków (skoniugowane lub nie) mogą nie być skuteczne jako ochrona przed zapaleniem płuc w populacji osób starszych, w której częstość występowania tej choroby jest bardzo wysoka. Kluczowym mechanizmem obrony przeciwko pneumokokom jest opsonofagocytoza (zdarzenie humoralne z udziałem komórki B/granulocytu obojętnochłonnego powodowane przez wytwarzanie przeciwciał przeciwko polisacharydowi pneumokoków, w którym ostatecznie bakteria ulega fagocytozie), jednak części zaangażowanych mechanizmów opsonizacji są upośledzone u osób starszych np. wytwarzanie nadtlenku przez PMN (granulocyty, ang. polymorphonuclear cells), wytwarzanie innych reaktywnych typów tlenu, mobilizacja PMN, apoptoza PMN, odkształcalność PMN. U osób starszych również odpowiedzi przeciwciał mogą być upośledzone. Przeciwnie do normalnie akceptowanego dogmatu, normalne poziomy przeciwciał przeciwko polisacharydom otoczki mogą być nieskuteczne w całkowitym usuwaniu bakterii, jako że pneumokoki mogą wnikać do komórek gospodarza tym samym unikając tej gałęzi układu odpornościowego. Twórcy niniejszego wynalazku ujawnili, że przez równoczesną stymulację gałęzi komórkowej układu odpornościowego (na przykład odporności opartej na komórkach T) i humoralnej gałęzi układu odpornościowego (z udziałem komórek B), powstaje synergizm (lub kooperacja), która jest zdolna do zwiększania klirensu pneumokoków z gospodarza. Ujawnienie to pomoże w ogólności w zapobieganiu (lub leczeniu) zakażeń pneumokokami, oraz będzie szczególnie ważne dla zapobiegania (lub terapii) zapalenia płuc u osób starszych, u których szczepionki oparte na polisacharydach nie wykazują skuteczności. Twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że oba ramiona układu odpornościowego mogą działać synergistycznie w ten sposób, jeśli polisacharyd pneumokoków (korzystnie skoniugowany) jest podawany z białkiem pneumokoków (korzystnie białkiem wyrażanym na powierzchni pneumokoków, lub wydzielanym lub uwalnianym, które może być przetwarzane i prezentowane w kontekście klasy II i klasy I MHC na powierzchni zakażonych komórek ssaków). Choć białko pneumokoków może samo wywołać odporność komorkową. Twórcy stwierdzili także, że obecność adiuwanta indukującego Th1 w preparacie szczepionki wspomaga to ramię układu odpornościowego i zwiększa dalej w sposób zaskakujący synergizm pomiędzy obydwoma ramionami układu odpornościowego. B) Wybrane kompozycje polisacharyd pneumokoków + 3D-MPL Niniejszym opisano kompozycje antygenowe zawierające jeden lub więcej koniugatów polisacharydów pneumokokowych z adiuwantem 3D-MPL i zasadniczo wolne od adiuwantów na bazie glinu, przy czym przynajmniej jeden z koniugatów polisacharydów pneumokokowych jest znacząco bardziej immunogenny w kompozycjach zawierających 3D-MPL w porównaniu z kompozycjami zawierającymi 3D-MPL w kombinacji z adiuwantem na bazie glinu. Kompozycje antygenowe mogą zawierać koniugaty jednego lub więcej z następujących polisacharydów otoczki pneumokoków: serotyp 4, 6B, 18C, 19F i 23F. W takich kompozycjach każdy z polisacharydów jest zadziwiająco bardziej immunogenny w kompozycjach zawierających 3D-MPL w porównaniu z kompozycjami zawierającymi 3D-MPL w połączeniu z adiuwantem na bazie glinu. Tak więc kompozycja antygenowa zawierająca polisacharyd otoczki Streptococcus pneumoniae, serotyp 4, 6B, 18C, 19F lub 23F, skoniugowany z białkiem immunogennym i adiuwantem 3D-MPL może być zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu. Kompozycja może być kombinowaną kompozycją antygenową zasadniczo pozbawioną adiuwantów na bazie glinu i zawierającą adiuwant 3D-MPL i dwa lub więcej koniugatów polisacharydów pneumokokowych wybranych z grupy składającej się z serotypu 4, serotypu 6B, serotypu 18C, serotypu 19F, i serotypu 23F. C) Koniugaty polisacharyd bakteryjny - białko D Polisacharydowy antygen może być skoniugowany z białkiem D Haemophilus influenzae lub fragmentem tego białka D. W poliwalentnych kompozycjach szczepionek jeden lub więcej z antygenów polisacharydowych może być skoniugowanych z białkiem D. Szczegółowy opis wynalazku A) Szczepionki z polisacharydów pneumokokowych Niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję szczególnie użyteczną do zapobiegania lub łagodzenia zakażeń pneumokokowych u osób starszych (i/lub niemowląt i małych dzieci). W kontekście niniejszego opisu pacjent jest uważany za osobę starszą jeśli ma ponad 55 lat, zazwyczaj ponad 60 lat, a bardziej ogólnie ponad 65 lat.

PL 203 917 B1 7 Tak więc dostarczona niniejszym kompozycja jest odpowiednia do stosowania u osób starszych (i/lub niemowląt i małych dzieci) i zawiera antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae i antygeny białkowe Streptococcus pneumoniae. Kompozycja według wynalazku (odpowiednia do zapobiegania zapaleniu płuc u osób starszych) oprócz antygenów polisacharydowych Streptococcus pneumoniae i antygenów białkowych Streptococcus pneumoniae zawiera adiuwant Th1. Przewiduje się, że taka szczepionka będzie także użyteczna w leczeniu zakażeń pneumokokami (na przykład w zapaleniu ucha środkowego) w innych grupach wysokiego ryzyka w populacji, takich jak niemowlęta i małe dzieci. Zatem kompozycja szczepionki zawierająca polisacharydowy antygen pneumokokokowy może zawierać adiuwant Th1. Antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae Antygeny polisacharydowe (korzystnie skoniugowane) w szczepionce Streptococcus pneumoniae pochodzą z przynajmniej czterech serotypów pneumokoków. Korzystnie cztery serotypy obejmują 6B, 14, 19F i 23F. Bardziej korzystnie w kompozycji włączonych jest przynajmniej 7 serotypów, na przykład 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F i 23F. Jeszcze bardziej korzystnie w kompozycji włączonych jest przynajmniej 11 serotypów, na przykład te polisacharydy otoczki pochodzące z serotypów 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F (korzystnie skoniugowanych). W kompozycji według wynalazku może być włączonych przynajmniej 13 antygenów polisacharydowych (korzystnie skoniugowanych) choć kolejne polisacharydowe antygeny, takie jak na przykład w 23-walentnej kompozycji (takie serotypy jak 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33F) są również rozważane. Do szczepienia osób starszych (na przykład w celu zapobiegania zapaleniu płuc) jest korzystne włączenie serotypów 8 i 12F (i najbardziej korzystnie także 15 i 22) do opisanej powyżej 11 walentnej kompozycji antygenowej, podczas gdy dla niemowląt i małych dzieci (u których większy problem stanowi zapalenie ucha środkowego) korzystnie włącza się serotypy 6A i 19A, aby wytworzyć szczepionkę 13-walentną. Aby zapobiegać/łagodzić zapalenie płuc w populacji osób starszych (ponad 55 lat) i zapalenie ucha środkowego u niemowląt (do 18 miesięcy) i małych dzieci (typowo 18 miesięcy do 5 lat) należy multiwalentny polisacharyd Streptococcus pneumoniae, jak tu opisano, łączyć z białkiem Streptococcus pneumoniae lub jego funkcjonalnym immunologicznie ekwiwalentem. Białka pneumokokowe Dla celów niniejszego opisu immunologicznie funkcjonalny ekwiwalent jest określony jako peptyd lub białko zawierające przynajmniej jeden ochronny epitop z białek pneumokokowych. Takie epitopy są typowo eksponowane na powierzchni, wysoce konserwatywne i mogą wywołać bakteriobójczą odpowiedź przeciwciał u gospodarza lub zapobiegać efektom toksycznym. Korzystnie ekwiwalent funkcjonalny ma przynajmniej 15, a korzystnie 30 lub więcej kolejnych aminokwasów z białka pneumokokowego. Bardziej korzystnie fragmenty, delecje białka, takie jak jego transbłonowe warianty delecyjne (tj. stosowanie zewnątrzkomórkowej domeny białek), fuzje, chemicznie lub genetycznie detoksyfikowane pochodne, i tym podobne, mogą być stosowane pod warunkiem, że są zdolne do wywołania zasadniczo takiej samej odpowiedzi immunologicznej jak natywne białko. Korzystnymi białkami są te białka pneumokoków, które są eksponowane na zewnętrznej powierzchni pneumokoka (zdolne do bycia rozpoznawanymi przez układ odpornościowy gospodarza przez przynajmniej część cyklu życiowego pneumokoka) lub te, które są wydzielane lub uwalniane przez pneumokoki. Najbardziej korzystnie białko jest toksyną, adhezyną, 2-składnikowym przekaźnikiem sygnału lub lipoproteiną Streptococcus pneumoniae, lub jego immunologicznie funkcjonalnym ekwiwalentem. Szczególnie korzystne białka do włączenia w takiej szczepionce kombinowanej obejmują nieograniczająco pneumolizynę (korzystnie detoksyfikowaną za pomocą działania chemicznego lub mutagenezy) (Mitchell i wsp. Nucleic Acids Res. 1900 Jul 11; 18(13): 4010 Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2. Mitchell i wsp. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1): 67-72 Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton i wsp.), WO 99/03884 (NAVA)); PspA i jego transbłonowe warianty delecyjne (US 5804193 - Briles i wsp.); PspC i jego transbłonowe warianty delecyjne (WO 97/09994 - Briles i wsp.); PsaA i jego transbłonowe warianty delecyjne (Berry i Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64(12): 5255-62 Sequence heterogeneity of

8 PL 203 917 B1 PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence in Streptococcus pneumoniae ); pneumokokowe białka wiążące cholinę i ich transbłonowe wiarianty delecyjne; CbpA i jego transmembranowe warianty delecyjne (WO 97/41151; WO 99/51226); dehydrogenaza gliceroaldehydo-3-fosforanowa (Infect. Immun. 1996 64: 3533); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato i wsp. FEMS Mirobiol Lett 1998, 164: 207-14); białko podobne do M, zgłoszenie patentowe SB nr EP 0837130 i adhezyna 18627, zgłoszenie patentowe SB nr EP 0834568. Białka stosowane w rozwiązaniach według wynalazku są korzystnie wybrane z grupy obejmującej pneumolizynę, PsaA, PspA, PspC, CbpA lub kombinację dwóch lub więcej takich białek. Niniejszy wynalazek także obejmuje immunologicznie funkcjonalne ekwiwalenty takich białek (jak zdefiniowano powyżej). W kompozycji białko może pomagać w indukowaniu odpowiedzi zachodzącej za pośrednictwem komórek T przeciwko chorobie pneumokokowej - szczególnie potrzebnej do ochrony przed zapaleniem płuc - która współpracuje z ramieniem humoralnym układu odpornościowego, aby zahamować inwazję pneumokoków i stymulować opsonofagocytozę. Kolejną korzyścią włączenia antygenu białkowego jest prezentacja dodatkowych antygenów w procesie opsonofagocytozy i zahamowanie adhezji bakteryjnej (jeśli stosowana jest adhezyna) lub zobojętnienie toksyny (o ile stosowana jest toksyna). Tak więc, w wykonaniu wynalazku dostarczona jest szczepionka Streptococcus pneumoniae zawierająca skoniugowaną szczepionkę polisacharydów pneumokokowych zawierającą antygeny polisacharydowe pochodzące od przynajmniej czterech serotypów, korzystnie przynajmniej siedmiu serotypów, bardziej korzystnie przynajmniej jedenastu serotypów, i przynajmniej dwóch białek Streptococcus pneumoniae. Korzystnie jedno z białek jest pneumolizyną lub PsaA lub PspA lub CbpA (najbardziej korzystnie detoksyfikowaną pneumolizyną). Korzystna kombinacja zawiera przynajmniej pneumolizynę lub jej pochodną i PspA. Jak wskazano powyżej, problemem związanym z zastosowaniem polisacharydów do szczepień jest to, że polisacharydy jako takie są słabymi immunogenami. Aby to przezwyciężyć, polisacharydy mogą być koniugowane do nośników białkowych, co dostarcza pomocy od otaczających komórek T. Jest więc korzystne by polisacharydy stosowane w rozwiązaniach według wynalazku były połączone z takim nośnikiem białkowym. Przykłady takich nośników, które są obecnie powszechnie stosowane do wytwarzania immunogenów polisacharydowych obejmują toksoidy (anatoksyny) dyfterytu i tężca (odpowiednio DT, DT CRM197 i TT), hemocyjaninę skałoczepu (KLH), OMPC z N. meningitidis i oczyszczoną pochodną białkową tuberkuliny (PPD). Jednak z każdym z tych powszechnie stosowanych nośników są związane problemy (patrz Problemy związane z często stosowanymi nośnikami powyżej). Niniejszym przedstawiono nośnik do stosowania w konstruktach immunogenów opartych na polisacharydach, który nie ma takich wad. Korzystnym nośnikiem do immunogennych kompozycji (lub szczepionek) na bazie polisacharydów jest białko D z Haemophilus influenzae (EP 594610-B) lub jego fragmenty. Fragmenty odpowiednie do stosowania obejmują fragmenty obejmujące epitopy pomocniczych komórek T. W szczególności fragment białka D będzie korzystnie zawierał N-końcową 1/3 białka. Dalszym korzystnym nośnikiem polisacharydów pneumokoków jest samo białko pneumokokokowe (jak określono powyżej w części pt. Białka pneumokokowe ). Szczepionki według niniejszego wynalazku korzystnie zawierają adiuwant. Odpowiednie adiuwanty obejmują sól glinu, taką jak żel wodorotlenku glinu (alum) lub fosforan glinu, ale mogą też być solą wapnia, żelaza lub cynku, lub nierozpuszczalną zawiesiną acylowanej tyrozyny, lub acylowanych cukrów, kationowymi lub anionowymi pochodnymi polisacharydów, lub polifosfazenami. Korzystnie adiuwant jest wybrany tak, aby był preferencyjnym induktorem odpowiedzi typu TH1 i wspomagał komórkową odpowiedź odpornościową. Adiuwanty TH1 Wysokie poziomy cytokin typu TH1 sprzyjają zazwyczaj indukcji komórkowych odpowiedzi odpornościowych na dany antygen, podczas gdy wysokie poziomy cytokin typu Th2 zazwyczaj sprzyjają indukcji humoralnych odpowiedzi odpornościowych na antygen. Należy pamiętać, że różnica między odpowiedzią odpornościową typu Th1 i Th2 nie jest bezwzględna. W rzeczywistości u danej osoby wystąpi odpowiedź odpornościowa, którą można opisać jako przede wszystkim Th1 lub przede wszystkim Th2. Jednak jest często wygodnie rozważać rodziny cytokin na zasadach opisanych dla mysich klonów komórek T CD4 +ve przez Mosmanna i Coffmana (Mosmann, T.R. i Coffman, R.L. (1989). TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion

PL 203 917 B1 9 lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, str. 145-173). Tradycyjnie, odpowiedzi typu Th1 są związane z wytwarzaniem INFγ i cytokin IL-2 przez limfocyty T. Inne cytokiny często bezpośrednio związane z indukcją odpowiedzi odpornościowej typu Th1 nie są wytwarzane przez komórki T, takie jak IL-12. Przeciwnie, odpowiedzi typu Th2 są związane z wydzielaniem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Odpowiednie układy adiuwantowe, które sprzyjają przede wszystkim odpowiedzi Th1 obejmują monofosforylolipid A lub jego pochodną, szczególnie 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A, i kombinację monofosforylolipidu A, korzystnie 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A (3D-MPL), razem z solą glinu. Wzmocniony układ obejmuje kombinację monofosforylolipidu A i pochodnej saponiny, szczególnie kombinację QS21 i 3D-MPL jak ujawniono w WO 94/00153, lub kompozycję o zmniejszonej reaktywności, w której QS21 jest wygaszony cholesterolem jak ujawniono w WO 96/33739. Szczególnie silny preparat adiuwanta obejmujący QS21, 3D-MPL i tokoferol w emulsji olej-w-wodzie opisano w WO 95/17210 i stanowi on korzystny preparat. Korzystnie szczepionka dodatkowo zawiera saponinę, korzystniej QS21. Preparat może też zawierać emulsję olej-w-wodzie i tokoferol (WO 95/17210). Niniejszy wynalazek także dostarcza sposobu wytwarzania komozycji immunogennej według wynalazku obejmującego zmieszanie antygenów białkowych i polisacharydowych razem z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, taką jak 3D-MPL. Oligonukleotydy zawierające niemetylowany CpG (WO 96/02555) są także korzystnymi induktorami odpowiedzi TH1 i są odpowiednie do stosowania w rozwiązaniach według wynalazku. Szczególnie korzystne kompozycje według wynalazku obejmują skoniugowane polisacharydy pneumokoków, białka pneumokoków i adiuwant Th1. Indukcja odpowiedzi komórkowej za pomocą biała pneumokoków (jak opisano powyżej) i współpraca pomiędzy obydwoma ramionami układu odpornościowego może być wspomagana przez dodanie adiuwanta Th-1, w wyniku czego otrzymywana jest szczególnie skuteczna szczepionka przeciwko chorobom pneumokokowym, a co jest ważne przeciwko pneumokokowemu zapaleniu płuc u osób starszych. W dalszym aspekcie niniejszego wynalazku dostarczona jest kompozycja immunogenna do zastosowania w medycynie. Dostarczona kompozycja zawierająca koniugat polisacharydu pneumokoków i adiuwant Th1 (korzystnie 3D-MPL) jest zdolna do serokonwersji lub indukcji odpowiedzi humoralnej przeciwciał przeciwko antygenowi polisacharydowemu w populacji osobników nie-odpowiadających. Wiadomo, że 10-30% populacji nie reaguje na immunizację polisacharydami (nie odpowiada na ponad 50% serotypów w szczepionce) (Konradsen i wsp., Scand. J. Immun 40: 251 (1994); Rodriguez i wsp., JID, 173: 1347 (1996)). Może też być tak w przypadku szczepionek koniugowanych (Musher i wsp. Clin. Inf. Dis. 27: 1487 (1998)). Może być to szczególnie poważne w obszarach wysokiego zagrożenia populacji (niemowlęta, małe dzieci i osoby starsze). Twórcy niniejszego wynalazku ujawnili, że kombinacja koniugowanego polisacharydu pneumokokowego (na które część populacji może mieć niską odpowiedź) z adiuwantem Th1 (patrz Adiuwanty Th1 powyżej) może zadziwiająco obejść ten brak odpowiedzi. Korzystnie powinien być stosowany 3D-MPL, a najbardziej korzystnie 3D-MPL pozbawiony adiuwanta na bazie glinu (co daje jeszcze lepszą odpowiedź). Zatem rozwiązania według wynalazku umożliwiają leczenie osób niereagujących na polisacharydy pneumokokokowe i dostarczają zastosowania adiuwanta Th1 do wytwarzania leku zawierającego skoniugowane antygeny polisacharydowe pneumokoków do leczenia (lub zapobiegania) choroby pneumokokowej u osób, które nie reagują na antygen polisacharydowy. Możliwe jest zapobieganie lub łagodzenie zapalenia płuc u osób starszych przez podanie starszemu pacjentowi bezpiecznej i skutecznej ilości szczepionki, jak tu opisano, zawierającej antygen polisacharydowy Streptococcus pneumoniae oraz antygen białkowy Streptococcus pneumoniae i ewentualnie adiuwant Th1. Możliwe jest również zapobieganie lub łagodzenie zapalenia ucha środkowego u niemowląt lub małych dzieci przez podanie temu niemowlęciu lub małemu dziecku bezpiecznej i skutecznej ilości szczepionki, jak tu opisano, zawierającej antygen polisacharydowy Streptococcus pneumoniae oraz antygen białkowy Streptococcus pneumoniae i ewenutalnie adiuwant Th1. Korzystnie w rozwiązaniach według wynalazku antygen polisacharydowy jest obecny jako koniugat polisacharyd-białko.

10 PL 203 917 B1 Preparaty szczepionek Preparaty szczepionek mogą być stosowane do ochrony lub leczenia ssaka podatnego na zakażenie przez podanie szczepionki drogą ogólnoustrojową lub przez śluzówkę. Podawanie może obejmować iniekcje drogą domięśniową dootrzewnową śródskórną lub podskórną oraz podawanie śluzówkowe do ust lub dróg pokarmowych, oddechowych i moczowo-płciowych. Donosowe podanie szczepionek do leczenia zapalenia płuc lub zapalenia ucha środkowego jest korzystne (jako że można bardziej skutecznie zapobiec nosicielstwu pneumokoków w nosogardzieli, w ten sposób osłabiając zakażenie w jego najwcześniejszym stadium). Ilość skoniugowanego antygenu w każdej dawce szczepionki jest wybrana jako ilość, która indukuje odpowiedź immunoochronną bez znaczących niekorzystnych efektów ubocznych w typowych szczepionkach. Taka ilość będzie zależała od tego który specyficzny immunogen jest stosowany i jak jest on prezentowany. Na ogół oczekuje się, że każda dawka będzie zawierała 0,1-100 μg polisacharydu, korzystnie 0,1-50 μg, korzystniej 0,1-10 μg, z czego 1 do 5 μg stanowi najbardziej korzystny zakres. Zawartość antygenów białkowych w szczepionce będzie typowo w zakresie 1-100 μg, korzystnie 5-50 μg, najbardziej typowo w zakresie 5-25 μg. Optymalne ilości składników dla danej szczepionki można ustalić przez standardowe badania obejmujące obserwację odpowiednich odpowiedzi immunologicznych u osobników. Po wstępnym szczepieniu, osobniki mogą otrzymywać jedną lub więcej odpowiednio rozmieszczonych szczepień przypominających. Przygotowanie szczepionki jest ogólnie opisane w Vaccine Design ( The subunit and adjuvant approach (red. Powell M.F. i Newman M.J.) (1995) Plenum Press Nowy Jork). Enkapsulacja w liposomach jest opisana przez Fullerton, Patent US 4,235,877. B) Wybrane kompozycje polisacharyd pneumokoków + 3D-MPL Dla celów niniejszego opisu określenie koniugaty polisacharydów pneumokoków oznacza te koniugaty polisacharydów otoczki Streptococcus pneumoniae, które są bardziej immunogenne w kompozycjach zawierających 3D-MPL w porównaniu z kompozycjami zawierającymi 3D-MPL w połączeniu z adiuwantem na bazie glinu (na przykład koniugaty serotypu 4; serotypu 6B; serotypu 18C; serotypu 19F; lub serotypu 23F). Dla celów niniejszego opisu określenie zasadniczo wolny od adiuwantów na bazie glinu oznacza kompozycję, która nie zawiera dostatecznej ilości adiuwanta na bazie glinu (na przykład wodorotlenku glinu i w szczególności fosforanu glinu), aby spowodować jakiekolwiek zmniejszenie immunogenności koniugatu polisacharydu pneumokoków w porównaniu z ekwiwalentną kompozycją zawierającą 3D-MPL bez dodanego adiuwanta na bazie glinu. Korzystnie kompozycja antygenowa powinna zawierać adiuwant, który składa się zasadniczo z 3D-MPL. Ilość adiuwanta na bazie glinu dodawana na dawkę powinna korzystnie wynosić mniej niż 50 μg, bardziej korzystnie mniej niż 30 μg, jeszcze bardziej korzystnie mniej niż 10 μg, a najbardziej korzystnie adiuwant na bazie glinu nie jest dodawany do antygenowych kompozycji. Dla celów niniejszego opisu można określić czy koniugat polisacharydu pneumokokokowego jest znacząco bardziej immunogenny w kompozycjach zawierających 3D-MPL w porównaniu z kompozycjami zawierającymi 3D-MPL w połączeniu z adiuwantem na bazie glinu sposobem przedstawionym w Przykładzie 2. Jako wskazanie czy kompozycja jest znacząco bardziej immunogenna gdy zawiera sam 3D-MPL stosunek stężenia GMC IgG (określony jak w Przykładzie 2) między kompozycją zawierającą sam 3D-MPL a ekwiwalentną kompozycją zawierającą 3D-MPL w połączeniu z adiuwantem - fosforanem glinu - powinien być większy niż 2, korzystnie większy niż 5, bardziej korzystnie większy niż 7, jeszcze bardziej korzystnie większy niż 9 i jeszcze bardziej korzystnie większy niż 14. Fakt, że polisacharydy jako takie są słabo immunogenne stanowi jeden z problemów związanych z zastosowaniem polisacharydów do szczepienia. Strategie zaprojektowane by przezwyciężyć ten brak immunogenności obejmują przyłączenie (koniugowanie) polisacharydu do dużych nośników białkowych, które zapewniają pomoc ze strony obecnych komórek T. Jest korzystne by pneumokokowe polisacharydy były podłączone do nośnika białkowego, który zapewnia pomoc komórek T. Przykłady takich nośników, które mogą być stosowane obejmują toksoid dyfterytu, mutanta dyfterytu i tężca (odpowiednio DT, CRM197 i TT), hemocyjaninę skałoczepu (KLH) i oczyszczoną białkową pochodną tuberkuliny (PPD) i OMPC Neisseria meningitidis. Najbardziej korzystnie stosowane jest białko D z Haemophilus influenzae (EP 0 594 610-B) lub jego fragmenty (patrz część C) jako immunogenne białko nośnikowe dla polisacharydów pneumokoków.

PL 203 917 B1 11 Kompozycja antygenowa może zawierać polisacharyd pneumokoków serotyp (PS) 4 skoniugowany z białkiem immunogennym i formułowany z adiuwantem 3D-MPL, przy czym kompozycja może być zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu. Kompozycja antygenowa może obejmować PS 6B, 18C, 19F lub 23F, odpowiednio, skoniugowane z białkiem immunogennym i formułowane z adiuwantem 3D-MPL, przy czym kompozycja może być zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu. Możliwe jest także dostarczenie kombinowanej kompozycji antygenowej zawierającej dwa lub więcej koniugatów polisacharydów pneumokoków z grupy PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F i PS 23F, formułowanych z adiuwantem 3D-MPL, przy czym kompozycja może być zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu. Na immunogenność koniugatów pneumokokowych polisacharydów nie wpływa znacząco ich dostarczenie wraz z innymi koniugatami polisacharydów pneumokokokowych (Przykład 3). Tak więc można dostarczyć kombinowaną kompozycję antygenową zawierającą jeden lub więcej koniugatów polisacharydów pneumokoków w kombinacji z jednym lub więcej dodatkowymi koniugatami polisacharydów pneumokoków, przy czym kompozycja może być formułowana z adiuwantem 3D-MPL, a jednocześnie zasadniczo pozbawiona adiuwantów na bazie glinu. Kombinowane kompozycje antygenowe mogą zawierać przynajmniej jeden a korzystnie 2, 3, 4 lub wszystkie 5 z koniugatów polisacharydów pneumokokowych z grupy PS 4, 6B, 18C, 19F lub 23F, a w dodatku dowolną kombinację innych koniugatów polisacharydów pneumokokokowych, formułowanych z adiuwantem 3D-MPL, ale zasadniczo pozbawionych adiuwantów na bazie glinu. Typowo kombinowana kompozycja antygenowa Streptococcus pneumoniae będzie zawierała koniugowane antygeny polisacharydowe, przy czym polisacharydy będą pochodziły z przynajmniej czterech, siedmiu, jedenastu, trzynastu, piętnastu lub dwudziestu trzech serotypów (patrz Antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae, gdzie przedstawiono preferowane kombinacje serotypów w zależności od choroby, która ma być leczona). Kompozycje antygenowe są korzystnie stosowane w kompozycjach szczepionek do zapobiegania (lub leczenia) zakażenia pneumokokami, szczególnie u osób starszych oraz niemowląt i małych dzieci. Możliwe jest zastosowanie powyższych kompozycji antygenowych w medycynie. Sposób indukcji odpowiedzi odpornościowej na koniugat polisacharydów otoczki Streptococcus pneumoniae obejmuje etapy podania bezpiecznej i skutecznej ilości jednej z powyższych kompozycji antygenowych pacjentowi i zastosowanie jednej z powyższych kompozycji antygenowych do wytwarzania leku do zapobiegania (lub leczenia) choroby powodowanej przez pneumokoki. Aby zapobiegać/łagodzić zapalenie płuc w populacji osób starszych (ponad 55 lat) zapalenie ucha środkowego u niemowląt (do 18 miesięcy) i małych dzieci (typowo 18 miesięcy do 5 lat) multiwalentne koniugaty polisacharydu Streptococcus pneumoniae należy formułować jak tu opisano z białkiem Streptococcus pneumoniae lub jego funkcjonalnym immunologicznie ekwiwalentem. Korzystne białka/kombinacje białek zostały opisane w Białka pneumokokowe powyżej. Korzystnie kompozycje antygenowe (i szczepionki) opisane tu uprzednio są liofilizowane aż do momentu kiedy będą stosowane, kiedy to są one rekonstytuowane rozcieńczalnikiem. Bardziej korzystnie są one liofilizowane w obecności 3D-MPL i są rekonstytuowane roztworem soli fizjologicznej. Liofilizacja kompozycji daje w efekcie bardziej stabilną kompozycję (na przykład zapobiega rozpadowi antygenów polisacharydowych). Proces jest też zadziwiająco odpowiedzialny za wyższe miano przeciwciał przeciw polisacharydom pneumokoków. Wykazano, że ma to szczególne znaczenie dla koniugatów PS 6B. Zatem korzystne jest stosowanie liofilizowanej kompozycji antygenowej zawierającej koniugat PS 6B z adiuwantem 3D-MPL i zasadniczo wolnej od adiuwantów na bazie glinu. Przygotowanie szczepionek zostało opisane w Preparaty szczepionek powyżej. C) Koniugaty polisacharyd bakteryjny - białko D Tendencja do stosowania szczepionek kombinowanych ma kilka zalet: zmniejsza diskomfort biorcy, ułatwia schemat szczepień i zapewnia ukończenie cyklu szczepień; ale istnieje równoczesne ryzyko zmniejszenia skuteczności szczepionki (patrz omówienie problemu supresji epitopu przez nadużycie białek nośnikowych powyżej). Byłoby więc korzystne przygotowanie kombinacji szczepionek, które spełniają potrzeby populacji, a jednocześnie nie wykazują interferencji immunogennej między składnikami. Te korzyści mogą być uzyskane przez kompozycje immunogenne (lub szczepionki) według wynalazku, które szczególnie korzystnie mogą być podawane grupom wysokiego ryzyka, takim jak niemowlęta, małe dzieci lub osoby starsze. Białko D z Haemophilus influenzae, lub jego fragmenty, może być stosowany jako nośnik w kompozycjach immunogennych opartych na polisacharydach, w tym również w szczepionkach.

12 PL 203 917 B1 Fragmenty odpowiednie do stosowania obejmują fragmenty zawierające epitopy komórek pomocniczych T. W szczególności fragmenty białka D będą korzystnie zawierały N-końcową 1/3 białka. Białko D jest białkiem wiążącym IgD z Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 B1) i jest potencjalnym immunogenem. Polisacharydy, które mogą być skoniugowane z białkiem D obejmują nieograniczająco antygen polisacharydowy Vi przeciwko Salmonella typhi, polisacharydy meningokoków (w tym typ A, C, W 135 i Y, oraz polisacharyd i modyfikowane polisacharydy meningokoków grupy B), polisacharydy ze Staphylococcus aureus, polisacharydy ze Streptococcus agalactae, polisacharydy z Mycobacterium np. Mycobacterium tuberculosis (takie jak mannofosfoinizytydy trehalozy, kwas mykolinowy, arabinomannany zakończone mannozą, ich otoczka i arabinogalaktany), polisacharyd z Cryptococcus neoformans, lipopolisacharydy nietypowalnego Haemophilus influenzae, polisacharyd otoczki z Haemophilus influenzae b, lipopolisacharydy Moraxella catharralis, lipopolisacharydy Shigella sonnei, lipopeptydofosfoglikan (LPPG) Trypanosoma cruzi, gangliozydy związane z rakiem GD3, GD2, mucyny związane z nowotworami, szczególnie antygen T-F i antygen sialilowy T-F, i polisacharyd związany z HIV, który jest związany strukturalnie z antygenem T-F. Polisacharyd może być połączony z białkiem nośnikowym za pomocą dowolnego znanego sposobu (na przykład Likhite, Patent US 4,372,945 i Armor i wsp., Patent US 4,474,757). Korzystnie przeprowadza się koniugację CDAP (WO 95/08348). W CDAP odczynnik do cyjanylowania tetrafluoroboran 1-cjano-dimetyloamonopirydyny (CDAP) jest korzystnie stosowany do syntezy koniugatów polisacharyd-białko. Reakcja cyjanylowania może być przeprowadzona we względnie łagodnych warunkach, co umożliwia uniknięcie hydrolizy polisacharydów wrażliwych na zasady. Ta synteza pozwala na bezpośrednie połączenie z białkiem nośnikowym. Polisacharyd jest solubilizowany w wodzie lub roztworze soli fizjologicznej. CDAP rozpuszcza się w acetonitrylu i dodaje natychmiast do roztworu polisacharydu. CDAP reaguje z grupami hydroksylowymi polisacharydu tworząc ester cyjanianowy. Po etapie aktywacji dodaje się białko nośnikowe. Grupy aminowe lizyny reagują z aktywowanym polisacharydem z wytworzeniem kowalencyjnego wiązania izomocznikowego. Po reakcji sprzęgania dodaje się duży nadmiar glicyny by wygasić resztkowe aktywowane ugrupowania. Produkt następnie poddaje się sączeniu w żelu, aby usunąć nieprzereagowane białko nośnikowe i resztkowe odczynniki. Tak więc sposób wytwarzania koniugatów polisacharyd - białko D obejmuje etap aktywacji polisacharydu i połączenia polisacharydu z białkiem D. Rozwiązania według wynalazku dostarczają kompozycji immunogennej (lub szczepionki) do zapobiegania zakażeniom Streptococcus pneumoniae. Mechanizmy za pomocą których pneumokoki rozprzestrzeniają się do płuca, płynu mózgowo- -rdzeniowego i krwi są słabo poznane. Wzrost bakterii w prawidłowych pęcherzykach płucnych jest hamowany przez ich stosunkową suchość i aktywność fagocytową makrofagów pęcherzykowych. Każde zmiany anatomiczne lub fizjologiczne tych koordynowanych mechanizmów obronnych zwiększają podatności płuc na zakażenie. Ściana komórkowa Streptococcus pneumoniae odgrywa ważną rolę w generowaniu odpowiedzi zapalnej w pęcherzykach płuca (Gillespie i wsp. (1997), I&I 65: 3936). Typowo szczepionka Streptococcus pneumoniae według wynalazku będzie zawierała koniugaty polisacharydowe białka D, przy czym polisacharydy pochodzą z przynajmniej czterech, siedmiu, jedenastu, trzynastu, piętnastu lub 23 serotypów. Kombinacje serotypów w zależności od choroby, która ma być leczona opisano w Antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae powyżej. Możliwe jest również dostarczenie szczepionki Neisseria meningitidis, w szczególności z serotypów A, B, C W-135 i Y. Neiserria meningitidis jest jednym z najważniejszych źródeł bakteryjnego zapalenia opon mózgowych. Otoczka węglowodanowa tych organizmów może działać jako determinanta wirulencji i cel dla przeciwciała ochronnego. Niemniej jednak wiadomo, że węglowodany są słabymi immunogenami u małych dzieci. Szczególnie odpowiednim nośnikiem białkowym dla tych polisacharydów jest białko D dostarczające epitopów komórek T, które mogą aktywować odpowiedź komórek T, aby wspomóc proliferację i dojrzewanie komórek B specyficznych wobec antygenu polisacharydowego, oraz indukcję pamięci immunologicznej. Możliwe jest również otrzymanie koniugatu polisacharyd otoczki Haemophilus influenzae b (PRP) - białko D. Możliwe jest również otrzymanie szczepionek kombinowanych, które dostarczają ochronę przed szeregiem różnych patogenów. Będące nośnikiem białko D jest zadziwiająco użyteczne jako nośnik w szczepionkach kombinowanych, w których są koniugowane wielokrotne antygeny polisacharydowe.