Streszczenie Piroliza prowadzona w obecności czynnika derywatyzującego, połączona z identyfikacją otrzymanych produktów metodą chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas, jest wartościową techniką wykorzystywaną w badaniach struktury melanin. W prezentowanej pracy po raz pierwszy badano możliwość zastosowania w tym celu odczynnika sililującego heksametylodisilazanu (HMDS). Analizie poddano syntetyczną feomelaninę otrzymaną na drodze enzymatycznej z dopaminy i cysteiny oraz wzorce feomelaninowych jednostek monomerycznych typu benzotiazynowego i benzotiazolowego. Uzyskane wyniki wskazują, że sposób termicznej degradacji oraz pirolitycznej sililacji in situ podjednostek strukturalnych badanej melaniny jest inny, niż czystej benzotiazyny i benzotiazolu. Pochodne trimetylosililowe powstające w wyniku pirolizy feomelaniny w obecności HMDS nie posiadają heterocyklicznego pierścienia zawierającego siarkę, co uniemożliwia ich wykorzystanie jako pirolitycznych markerów jednostek monomerycznych charakterystycznych dla feomelanin. Przydatność HMDS w analizie strukturalnej pigmentów feomelaninowych techniką pirolizy ogranicza ponadto jego niska stabilność termiczna. Słowa kluczowe: feomelanina, piroliza, GC/MS, derywatyzacja, sililacja, HMDS Wstęp Piroliza połączona z chromatografią gazową i spektrometrią mas (Py-GC/MS) jest wartościową techniką badania struktury pigmentów melaninowych, pozbawioną ograniczeń charakteryzujących metody oparte na degradacji chemicznej tych biopolimerów, takich jak słaba powtarzalność czy niska wydajność powstających markerów eumelaninowych i feomelaninowych [1, 2]. Jednakże niektóre produkty pirolizy mogą posiadać w swojej strukturze polarne grupy funkcyjne (-COOH, =NH, -NH 2 -OH, -SH), co znacznie Abstract Sample pyrolysis in the presence of a derivatizing reagent, coupled with identification of the products formed by gas chromatography/mass spectrometry, is the valuable technique for structural investigations of melanin pigments. In the present study a silylating agent, hexamethyldisilazane (HMDS), was applied for the first time for this purpose. Synthetic pheomelanin obtained enzymatically from dopamine and cysteine, and benzothiazine and benzithiazole being the standards of pheomelanin-type monomer units were analyzed. It was found that pyrolysis and pyrolytic in situ derivatization modes of structural subunits present in the studied pheomelanin were completely different as compared with the pure standards. Trimethylsilyl derivatives formed during pheomelanin pyrolysis in the presence of HMDS do not possess sulfur-containing heterocyclic rings, which makes them useless as the potent pyrolysis markers of the pheomelanin-type monomer units. Thermal instability also limits the usefulness of HMDS as a derivatizing agent in structural analysis of pheomelanin pigments. Keywords: pheomelanin, pyrolysis, GC/MS, derivatization, silylation, HMDS zmniejsza ich lotność utrudniając rozdział chromatograficzny. Ponadto związki takie są często adsorbowane na aktywnych powierzchniach wewnętrznych ścianek kolumny kapilarnej, co w połączeniu z niestabilnością termiczną i chemiczną może poważnie modyfikować wyniki analiz [3]. Niekorzystne właściwości chromatografowanych związków można poprawić na drodze derywatyzacji polegającej na podstawieniu aktywnego atomu wodoru w grupach funkcyjnych innym ugrupowaniem, np. grupą metylową (metylacja), trimetylosililową lub tert-butylodimetylosililową (sililacja) czy acylową (acylacja). W efekcie powstają mniej
polarne pochodne, które wykazują wyższą lotność i stabilność termiczną w porównaniu ze związkami macierzystymi. Analizując strukturę polimeru techniką Py-GC i Py- GC/MS, reakcję derywatyzacji można prowadzić przed, w trakcie bądź po zakończeniu pirolizy [4]. Derywatyzacja pre-pirolityczna polega na takiej modyfikacji grup funkcyjnych polimeru, która pozwala na osiągnięcie oczekiwanego sposobu jego degradacji termicznej, co ułatwia analizę jakościową i ilościową. Derywatyzacja post-pirolityczna jest prowadzona w celu polepszenia warunków rozdziału chromatograficznego i detekcji składników pirolizatu, nie wpływając na sposób degradacji. W pirolitycznej derywatyzacji in situ odczynnik derywatyzacyjny jest obecny w trakcie wykonywania pirolizy, dlatego powstające w tym przypadku produkty są najprawdopodobniej efektem zarówno pre- jak i post-pirolitycznych modyfikacji, co umożliwia pełniejszy wgląd w strukturę analizowanego związku. Jedynym odczynnikiem derywatyzującym zastosowanym dotychczas w analizie strukturalnej melanin jest metanolowy roztwór wodorotlenku tetrametyloamoniowego (TMAH) [2, 5-7]. Wysoka skuteczność tego odczynnika metylującego, wynikająca m.in. z jego silnie zasadowego charakteru i aktywności hydrolitycznej nasilającej się w wysokiej temperaturze pozwoliła na równoczesną analizę niemelaninowych komponentów (lipidy, białka) związanych z pigmentami melaninowymi izolowanych z naturalnych źródeł, takich jak istota czarna mózgu człowieka [2, 5], czerniak złośliwy skóry [6] czy hodowane ludzkie melanocyty naskórkowe [7]. Większość melanin naturalnych to kopolimery złożone z podjednostek strukturalnych typu eumelaninowego i feomelaninowego. W świetle danych wskazujących na odmienne właściwości eumelanin (fotoprotekcja i aktywność antyoksydacyjna) i feomelanin (fotosensybilizacja i aktywność prooksydacyjna) wydaje się, że wzajemny stosunek obu typów podjednostek może w istotny sposób modyfikować fizjologiczną rolę pigmentów, zarówno epidermalnych, jak i obecnych w ośrodkowym układzie nerwowym [8, 9]. Prowadząc pirolizę syntetycznych feomelanin w obecności TMAH niejednokrotnie obserwowano zanik lub obniżenie poziomu związków uważanych za pirolityczne markery podjednostek feomelaninowych w porównaniu z pirolizatami otrzymanymi w nieobecności czynnika metylującego [dane niepublikowane]. Może to świadczyć o nasilonej degradacji monomerów tego typu pod wpływem hydrolitycznej aktywności TMAH. Dlatego zasadne wydaje się poszukiwanie innych odczynników derywatyzujących, których zastosowanie mogłoby zwiększyć możliwości analityczne techniki Py-GC/MS, zwłaszcza w zakresie identyfikacji komponentu feomelaninowego w naturalnych biopolimerach melaninowych. W niniejszej pracy badano przydatność do tego celu odczynnika wykazującego aktywność sililującą - heksametylodisilazanu (HMDS). Materiał i metody Otrzymywanie feomelaniny Syntetyczną feomelaninę otrzymano w wyniku katalizowanej przez tyrozynazę (50 000 U, EC.1.14.18.1, 5350 U/mg Sigma) oksydacyjnej polimeryzacji dopaminy (2,5 mm, Sigma) i cysteiny (2,5 mm, Sigma) w 50 mm buforze fosforanowym (ph 6,8). Mieszaninę reakcyjną inkubowano intensywnie wytrząsając przez 72 godziny w temperaturze 37 o C bez dostępu światła. Precypitat melaniny zdekantowano i przemyto trzykrotnie wodą dejonizowaną. W celu usunięcia śladów enzymu, precypitat poddano inkubacji z SDS, po czym przemyto 0,9 % NaCl i wodą dejonizowaną, a następnie poddano liofilizacji. Pirolityczna derywatyzacja in situ Porcje liofilizatu feomelaniny (ok. 1 mg) umieszczono w cienkościennych kapilarach szklanych (długość 80 mm, średnica wewnętrzna 1,1 mm), do których wprowadzono następnie po 4μl HMDS. Po zatopieniu końcówek w płomieniu palnika, kapilary umieszczono na 2 minuty we wnętrzu pieca muflowego rozgrzanego do temperatury 500 o C. W analogiczny sposób degradacji termicznej w obecności i nieobecności HMDS poddano wzorzec strukturalnych podjednostek feomelaninowych typu benzotiazynowego (2H-1,4-benzotiazyno-3(4H)-on, Sigma; BT) i benzotiazolowego (2-hydroksybenzotiazol, Aldrich; HB). Przeprowadzono również pirolizę czystego odczynnika sililującego. Po wyjęciu z pieca i osiągnięciu temperatury pokojowej, wszystkie kapilary umieszczono na 12 godzin w temperaturze -20 C. Następnie obie zatopione końcówki każdej kapilary ostrożnie odłamano, a jej wnętrze przemyto heksanem (2 porcje po 300 μl). Supernatanty pozostałe po odwirowaniu heksanowych ekstraktów (10000 g, 10 min) przeniesiono do szklanych fiolek i poddano analizie techniką GC/MS. Warunki analizy GC/MS Do analizy GC/MS zastosowano chromatograf gazowy Agilent serii 6890 sprzężony ze spektrometrem mas Agilent Network 5973 i wyposażony w automatyczny podajnik próbek firmy Agilent Technologies. Produkty pirolizy rozdzielano na kolumnie kapilarnej J&W HP5-MS (polidimetylosiloksan z 5% dodatkiem ugrupowań bifenylowych; długość: 60m, średnica wewnętrzna: 0,32mm, grubość filmu: 0,25μm). Wykorzystano dozownik typu zimnego dozowania na kolumnę (COC) z elektroniczną kontrolą ciśnienia. Objętość nastrzyku wynosiła 1μl. Temperatura dozownika w trybie pracy Track Oven była o 3 o C wyższa niż temperatura pieca chromatograficznego. Zastosowano następujący program temperaturowy pieca chromatograficznego: temperatura początkowa 40 o C utrzymywana była przez 1min, następnie wzrastała do 64 o C z prędkością 4 o C/min, po czym następował dalszy wzrost temperatury z prędkością 5 o C/min aż do osiągnięcia temperatury końcowej 290 o C, którą utrzymywano przez 8 min. Szybkość przepływu gazu nośnego (hel) utrzymywano na stałym poziomie (2.6 ml/min) przez całą analizę. Temperatura linii transferowej wprowadzającej kolumnę chromatograficzną bezpośrednio do źródła jonów spektrometru mas wynosiła 250 C. Produkty pirolizy jonizowano strumieniem elektronów o energii 70 ev. Temperatura źródła jonów w spektrometrze wynosiła 230 o C, a analizatora kwadrupolowego 150 o C. Spektrometr pracował w trybie zbierania pełnego widma (full scan), monitorując następujące wartości m/z: 29-200 od początku analizy do 7 minuty, 45-300 od 7 do 14 minuty oraz 45-550 powyżej 14
Ryc.1. Profile pirolityczne benzotiazyny (BT) i hydroksybenzotiazolu (HB) otrzymane w obecności i nieobecności odczynnika sililującego (HMDS). minuty. Do zbierania i obróbki danych zastosowano oprogramowanie Enhanced ChemStation G1701CA ver.c.00.00 firmy Agilent Technologies, zaś do interpretacji zarejestrowanych widm mas- siódme wydanie biblioteki widm Wiley oraz bibliotekę NIST/EPA 2008. Wyniki i dyskusja Pirolizę syntetycznej feomelaniny poprzedzono degradacją termiczną związków, których zasadniczym elementem strukturalnym jest heterocykliczny pierścień tiazyny lub tiazolu skondensowany z pierścieniem benzenowym. Jak wynika z badań prowadzonych między innymi techniką Py-GC/MS, układy benzotiazyny i benzotiazolu są charakterystyczne dla jednostek monomerycznych występujących w feomelaninach [1, 5, 7, 10]. Przeprowadzono także analizę czystego odczynnika sililującego w celu oceny jego odporności na zastosowaną temperaturę degradacji. Termostabilność stosowanych odczynników ma istotne znaczenie dla prawidłowej interpretacji wyników pirolitycznej derywatyzacji in situ, prowadzonej zarówno techniką on-line (w pirolizerze połączonym bezpośrednio z kolumną chromatograficzną), jak i off-line (co zastosowano w niniejszej pracy). W pirolizacie czystego HMDS wykryto liczne produkty termicznego rozpadu odczynnika oraz związki o większych masach cząsteczkowych będące efektem rekombinacji tych produktów. Związki te, zidentyfikowane m.in. jako pochodne silanoaminy, stanowiły także istotny składnik pirolizatów feomelaniny oraz wzorców feomelaninowych jednostek monomerycznych. Na rycinie 1 zestawiono profile pirolityczne wzorców monomerów typu feomelaninowego degradowanych w obecności i nieobecności HMDS. W nieobecności odczynnika derywatyzującego sześcioczłonowy pierścień heterocykliczny benzotiazyny BT degradował głównie do pochodnych benzotiazolu z pięcioczłonowym pierścieniem heterocyklicznym, lub ulegał rozerwaniu z wytworzeniem pochodnych aniliny. Natomiast, gdy pirolizę benzotiazyny prowadzono w obecności HMDS, obok dominujących w pirolizacie pochodnych benzotiazolu zidentyfikowano pochodne trimetylosililowe (TMS) indolu, aminotiofenolu, aminofenolu, benzoizotiazoloaminy i hydroksyindolu. Profil pirolityczny hydroksybenzotiazolu HB również zależał od Ryc. 2. Wzory strukturalne trimetylosililowych (TMS) pochodnych produktów pirolizy benzotiazyny i benzotiazolu w obecności HMDS. Tab. 1. Pochodne trimetylosililowe (TMS) otrzymane w wyniku pirolizy wzorców jednostek monomerycznych typu feomelaninowego w obecności HMDS Czas retencji [min] Pochodna Charakterystyczne wartości m/z 18,57 TMS-tiofenol 182, 167, 151, 73* 24,45 TMS-indol 189*, 174, 73 25,60 TMS-benzotiazol 207, 191*, 73 269, 254, 166, 27,96 N,S-di-TMS-2-aminotiofenol 73* 30,16 N,O-di-TMS-4-aminofenol 253, 238*, 73 N-TMSbenzoizotiazoloamina 222, 207* 30,88 32,41 N,O-di-TMS-hydroksyindol 277, 262, 73 * pik główny obecności odczynnika sililującego. Przy jego braku główne produkty pirolizy stanowiły pochodne aniliny i benzotiazo-
lu. Natomiast w obecności HMDS dominowały pochodne TMS tiofenolu, benzotiazolu, aminotiofenolu, aminofenolu i benzoizotiazoloaminy. Otrzymane w obecności HMDS pochodne TMS charakterystyczne dla wzorców jednostek monomerycznych typu feomelaninowego zestawiono w tabeli 1. Są to zarówno zawierające siarkę produkty derywatyzacji związków powstałych w wyniku rozerwania pierścienia heterocyklicznego, jak i pochodne zawierające pozbawiony siarki lub nienaruszony pierścień heterocykliczny (Ryc.2). Świadczy to o wysokiej skuteczności derywatyzacyjnej HMDS w odniesieniu do Ryc.3. Chromatogram produktów pirolizy syntetycznej feomelaniny w obecności HMDS. Linią przerywaną zaznaczono pirogram czystego odczynnika derywatyzującego. analizowanych wzorców. Przykładowy pirogram feomelaniny degradowanej w obecności HMDS w zestawieniu z chromatogramem produktów termicznej degradacji czystego odczynnika sililującego przedstawiono na rycinie 3. W pirolizacie melaniny nie stwierdzono obecności charakterystycznych produktów degradacji jednostek feomelaninowych, które wykrywano prowadząc pirolizę pigmentu w nieobecności czynnika derywatyzującego [1, 2, 5]. Produktów pirolitycznej sililacji in situ eluowanych pomiędzy 26 a 36 minutą nie udało się zidentyfikować. Natomiast intensywne piki widoczne na chromatogramie pomiędzy 10 a 24 minutą zidentyfikowano jako pochodne TMS i zestawiono w tabeli 2. Jak widać, są to produkty zupełnie inne, niż te wykrywane w pirolizatach wzorców. Żaden z nich nie posiada pierścienia heterocyklicznego charakterystycznego dla monomerów typu feomelaninowego, a jedynym produktem zawierającym siarkę jest pochodna ditms siarkowodoru (Ryc. 4). Wnioski Ryc.4. Wzory strukturalne trimetylosililowych (TMS) pochodnych produktów pirolizy syntetycznej feomelaniny w obecności HMDS. Uzyskane wyniki wskazują, że sposób termicznej degradacji oraz pirolitycznej sililacji in situ jednostek monomerycznych syntetycznej feomelaniny otrzymanej z dopaminy i cysteiny jest inny, niż czystych wzorców typu benzotiazynowego i benzotiazolowego. Pochodne TMS powstające w wyniku pirolizy feomelaniny w obecności HMDS nie zawierają heterocyklicznego pierścienia tiazyny lub tiazolu. Niespecyficzna budowa tych pochodnych uniemożliwia ich wykorzystanie jako pirolitycznych markerów jednostek Tab. 2. Pochodne trimetylosililowe (TMS) wykryte w pirolizacie syntetycznej feomelaniny degradowanej termicznie w obecności HMDS Czas % sumarycznej Charakterystyczne Pochodna retencji [min] powierzchni pików wartości m/z 10,15 di-tms-siarkowodór 0,64 178, 163*, 73 13,39 TMS-fenol 0,80 166, 151* 16,14 TMS-4-metylofenol 1,14 180,165*, 91 20,33 O-TMS-2-aminofenol 2,52 181, 166*, 150, 135, 73 21,28 di-tms-1,2-benzenodiol 2,30 254, 139, 73* 23,25 di-tms-4-metylo-1,2-benzenodiol 1,84 268, 73* * pik główny
monomerycznych charakterystycznych dla feomelanin. Przydatność HMDS w analizie strukturalnej pigmentów feomelaninowych techniką pirolizy ogranicza ponadto niska stabilność termiczna tego odczynnika sililującego. Pracę wykonano w ramach tematu badawczego nr KNW-2-019/09 finansowanego przez Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Piśmiennictwo 1. 2. 3. Dzierżęga-Lęcznar A i wsp. Pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry of synthetic neuromelanins. J Anal Appl Pyrolysis 2002; 62: 239-248. Dzierżęga-Lęcznar A i wsp. GC/MS analysis of thermally degraded neuromelanin from the human substantia nigra. J Am Soc Mass Spectrom 2004; 15: 920-926. Sobeih KL, Baron M, Gonzalez-Rodriguez J. Recent trends and developments in pyrolysis-gas chromatography. J Chromatogr A 2008; 1186: 51-66. 4. Wang F Ch-Y. Polymer analysis by pyrolysis gas chromatography. J Chromatogr A 1999; 843: 413-423 5. Dzierżęga-Lęcznar A i wsp. Structural investigations of neuromelanin by pyrolysis-gas chromatography/mass spectrometry. J Neural Transm 2006; 113: 729-734. 6. Chodurek E i wsp. Thermochemolysis as the useful method to assess the purity of melanin isolated from the human melanoma malignum. Acta Pol Pharm-Drug Res 2008; 65 (6): 531-534. 7. Stępień K i wsp. Melanin from epidermal human melanocytes: study by pyrolytic GC/MS. J Am Soc Mass Spectrom 2009; 20: 464-468. 8. Brenner M, Hearing VJ. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochem Photobiol 2008; 84: 539-549. 9. Takeuchi S i wsp. Melanin acts as a potent UVB photosensitizer to cause an atypical cell death in murine skin. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101:15076-15081. 10. Napolitano A i wsp. The benzothiazine chromophore of pheomelanins: a reassessment. Photochem Photobiol 2008; 84: 593-599. data otrzymania pracy: 29.11.2010 r. data akceptacji do druku: 21.12.2011 r. Adres do korespondencji: dr n. biol. Anna Dzierżęga-Lęcznar Tel.: +48 32 364 10 54 e-mail: adler@sum.edu.pl