Wstęp. Abstract. Streszczenie

Transkrypt

1 Streszczenie Silanizacja polarnych grup funkcyjnych jest jedną z metod derywatyzacyjnych, których przeprowadzenie jest niezbędne w analizie niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ) z zastosowaniem chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas. W pracy poddano ocenie możliwość wykorzystania różnych odczynników silanizujących do oznaczania ibuprofenu, paracetamolu, flurbiprofenu, naproksenu, ketoprofenu i kwasu mefenamowego techniką GC/MS. Pod wpływem BSA, BSTFA, HMDS i MSTFA otrzymano pochodne trimetylosililowe analizowanych NLPZ, natomiast po zastosowaniu MTB- STFA - pochodne tert-butylodimetylosililowe. Identyfikacji trimetylosililopochodnych dokonano na podstawie porównania ich widm mas z widmami bibliotecznymi, natomiast pochodne tert-butylodimetylosililowe zidentyfikowano poprzez interpretację otrzymanych widm. Zoptymalizowano warunki rozdziału chromatograficznego sililopochodnych NLPZ i wykonano krzywe kalibracyjne do ich oznaczania. Z przeprowadzonych badań wynika, że wszystkie testowane odczynniki wprowadzające ugrupowania trimetylosililowe można z powodzeniem wykorzystać do oznaczania ibuprofenu, flurbiprofenu, naproksenu, kwasu mefenamowego i ketoprofenu techniką GC/MS, przy czym ich skuteczność derywatyzacyjna jest porównywalna, a uzyskane krzywe wzorcowe charakteryzują się zbliżonymi parametrami. BSA i HMDS nie są polecane do derywatyzacji paracetamolu. Oznaczanie testowanych leków w postaci pochodnych tert-butylodimetylosililowych jest korzystniejsze z uwagi na wyższą czułość metody oraz na znacznie większą odporność tych związków na ślady wody, ale wymaga znacznego wydłużenia czasu analizy GC/MS. Abstract Silylation of polar functional groups is one of the derivatization methods that are indispensable in the analysis of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) by GC/ MS. In this study, the potential utility of various silylation reagents in GC/MS determination of ibuprofen, paracetamol, flurbiprofen, naproxen, ketoprofen and mefenamic acid was evaluated. Treatment with BSA, BSTFA, HMDS and MSTFA caused trimethylsilylation of the analyzed NSAIDs, while the use of MTBSTFA led to the formation of their tert-butyldimethylsilyl derivatives. Trimethylsilyl derivatives of the drugs were identified by comparison of their mass spectra with the library standards. To establish the identity of tert-butyldimethylsilyl derivatives, the interpretation of the recorded spectra was performed. The conditions of GC separations of the obtained silyl derivatives of the studied NSAIDs were optimized, and the calibration curves were plotted. It was found that all the tested trimethylsilylation reagents may be successfully applied for GC/MS determination of ibuprofen, flurbiprofen, naproxen, mefenamic acid and ketoprofen, with comparable efficiency, sensitivity and linearity. BSA and HMDS are not recommended for paracetamol derivatization. Determination of the studied drugs as tert-butyldimethylsilyl derivatives is more beneficial due to higher sensitivity of the method and much more resistance of the derivatives to the hydrolytic effects of moisture, but significant extending of GC/MS analysis is required. Key words: GC/MS, silylation, non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs Słowa kluczowe: GC/MS, silanizacja, niesteroidowe leki przeciwzapalne, NLPZ Wstęp W celu oznaczenia niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ) techniką chromatografii gazowej należy na drodze derywatyzacji przeprowadzić je w mniej polarne pochodne posiadające wyższą lotność i stabilność termiczną. W procesie derywatyzacji następuje wymiana atomu wodoru związanego z heteroatomem na taką grupę funkcyjną, która nie tworzy wiązań wodorowych [1]. W analizie NLPZ najczęściej do tego celu stosuje się metylację lub silanizację

2 [2-5]. Obecnie na rynku mamy szeroki wybór odczynników derywatyzujących, które tworzą pochodne trimetylosililowe (TMS). Odczynniki te różnią się aktywnością względem różnych grup funkcyjnych. W analizowanych lekach najłatwiej podstawieniu ulega wodór w grupie hydroksylowej, a najtrudniej w grupie amidowej, dlatego zdolność derywatyzacji grupy amidowej może być dowodem wysokiej reaktywności danego odczynnika silanizującego. Reakcja silanizacji zachodzi z reguły łatwo i szybko, zazwyczaj nie wymaga katalizatora, a nadmiar odczynnika derywatyzującego z uwagi na wysoką lotność opuszcza kolumnę wraz z rozpuszczalnikiem na początku analizy [6]. Pochodne TMS są wrażliwe na wilgoć: śladowe ilości wody powodują ich hydrolizę, co może w znaczny sposób obniżyć czułość metody. Ma to szczególne znaczenie w analizie prób pochodzenia biologicznego, które zazwyczaj są izolowane z wodnego środowiska. W celu uniknięcia tej niedogodności można stosować derywatyzację do pochodnych tert-butylodimetylosililowych (TBDMS). Chociaż pochodne te powstają trudniej, charakteryzują się znacznie większą odpornością na hydrolizę [7, 8]. Ponadto, z uwagi na większą masę cząsteczkową, zwiększa się czułość ich detekcji przy zastosowaniu jako detektora spektrometru mas z jonizacją elektronową [9, 10]. Ze względu na swoje zalety, pochodne TBDMS zostały wykorzystane w międzylaboratoryjnych, obejmujących dziewięć krajów, badaniach zawartości NLPZ w wodach rzecznych i ściekach [11, 12] Celem prezentowanej pracy było porównanie skuteczności derywatyzacyjnej odczynników silanizujących prowadzących do otrzymania pochodnych TMS i TBDMS wybranych NLPZ oraz wyznaczenie krzywych kalibracyjnych do oznaczeń ilościowych. Materiały i metody Analizie poddano roztwory wzorcowe NLPZ w dichlorometanie, zawierające ibuprofen, flurbiprofen, ketoprofen, kwas mefenamowy, naproksen oraz paracetamol. Stężenia każdego z leków w określonym roztworze były identyczne i wynosiły 10, 20, 30 i 50 ng/μl. Jako wzorzec wewnętrzny zastosowano oktadekan, którego stężenie w każdym roztworze wynosiło 25 ng/μl. Wszystkie stosowane leki, oktadekan oraz dichlorometan zakupiono w firmie Sigma-Aldrich. W celu otrzymania pochodnych trimetylosililowych zastosowano odczynniki derywatyzujące: N,Obis-trimetylosililoacetamid (BSA), N,O-bis-trimetylosililo-trifluoroacetamid (BSTFA), heksametylodisiloksan (HMDS) - firmy Supelco oraz N-metylo-N-trimetylosililotrifluoroacetamid (MSTFA) - produkcji Macherey & Nagel. Pochodne tert-butylodimetylosililowe otrzymano wykorzystując N-metylo-N-(tert-butylodimetylosililo)trifluoroacetamid (MTBSTFA) z 1% dodatkiem katalizatora tert-butylodimetylo-sililochlorku (TMCS) firmy Sigma -Aldrich. W celu derywatyzacji, 100 μl analizowanych roztworów wzorcowych NLPZ umieszczono w szklanych fiolkach (2ml) i dodano taką samą objętość odczynnika silanizującego. Następnie fiolki szczelnie zamknięto i ogrzewano przez godzinę w temperaturze 70 o C. Po schłodzeniu próbek, poddano je analizie techniką GC/MS. Analizy GC/MS wykonano stosując chromatograf gazowy Agilent serii 6890 sprzężony ze spektrometrem mas Agilent Network 5973 i automatycznym podajnikiem próbek 7683 firmy Agilent Technologies. Wykorzystano dozownik bezpośredniego wprowadzania na zimną kolumnę ( Cool on column ) z elektroniczną kontrolą ciśnienia, którego temperatura w trybie pracy Track Oven wynosiła 3 o C więcej niż temperatura pieca chromatograficznego. Jako gaz nośny zastosowano hel o szybkości przepływu 2,6 ml/min. Temperatura linii transferowej wprowadzającej kolumnę chromatograficzną bezpośrednio do źródła jonów spektrometru mas wynosiła 230 ºC. Analizowane związki jonizowano strumieniem elektronów o energii 70 ev. Źródło jonów w spektrometrze utrzymywano w temperaturze 230 ºC, a kwadrupol w 150 ºC. Spektrometr pracował w trybie zbierania pełnego widma (full scan), monitorując masy j.m.a. Do interpretacji widm mas wykorzystano ósme wydanie biblioteki widm mas Wiley a oraz bibliotekę NIST/EPA Zastosowano następujące programy temperaturowe pieca chromatograficznego: dla rozdziału pochodnych TMS: temperatura początkowa 40 o C utrzymywana była przez 1min, następnie zastosowano wzrost temperatury z prędkością 20 o C/ min do 160 o C i od 160 o C z prędkością 5 o C/min do temp. 205 o C, którą utrzymywano przez 10 min, dalej temperatura z prędkością 3 o C/min wzrastała do 270 o C. dla rozdziału pochodnych TBDMS: temperatura początkowa 50 o C utrzymywana była przez 1min, następnie zastosowano wzrost temperatury z prędkością 20 o C/min do 130 o C i od 130 o C z prędkością 2 o C/min do temp. 205 o C, którą utrzymywano przez 10 min, dalej temperatura z prędkością 3 o C/min wzrastała do 280 o C. Ryc. 1. Porównanie skuteczności derywatyzacyjnej różnych odczynników silanizujących względem ibuprofenu, kwasu mefenamowego, flurbiprofenu, naproksenu i ketoprofenu (20 ng/μl). Powierzchnię pików znormalizowano względem wzorca wewnętrznego.

3 Wyniki i dyskusja Ryc. 4. Widmo mas i schemat fragmentacji estru tert-butylodimetylosililowego ibuprofenu. Ryc. 2. Porównanie pól powierzchni pików ibuprofenu po przeprowadzeniu do pochodnej TMS przy użyciu BSTFA i pochodnej TBDMS za pomocą MTBSTFA. Pola powierzchni pików znormalizowano względem wzorca wewnętrznego. Ryc. 3. Porównanie sumy pól powierzchni pików pochodnych mono- i di- paracetamolu po przeprowadzeniu do pochodnej TMS przy użyciu BSTFA i pochodnej TBDMS za pomocą MTBSTFA. Pola powierzchni pików znormalizowano względem wzorca wewnętrznego. Ryc. 5. Krzywa kalibracyjna do oznaczania flurbiprofenu w postaci pochodnych TMS i TBDMS otrzymanych w obecności odpowiednio BSTFA i MTBSTFA. Pola powierzchni pików znormalizowano względem wzorca wewnętrznego. W celu dobrania najlepszego odczynnika derywatyzującego testowano kilka najpopularniejszych związków silanizujących: BSA, BSTFA, HMDS i MSTFA, które prowadzą do otrzymania pochodnych TMS oraz MTBSTFA, który tworzy pochodne TBDMS. Wszystkie odczynniki silanizujące prowadzące do otrzymania pochodnych TMS ibuprofenu, flurbiprofenu, naproksenu, kwasu mefanamowego i ketoprofenu charakteryzowała podobna skuteczność derywatyzacyjna. Bez względu na stosowany odczynnik derywatyzujący, uzyskano porównywalne powierzchnie pików odpowiadających sililopochodnym analizowanych leków. Każdy z tych leków posiada grupę karboksylową, której wodór stosunkowo łatwo ulega wymianie na ugrupowanie sililowe. Na rycinie 1 przedstawiono porównanie skuteczności derywatyzacyjnej wybranych związków silanizujących względem ibuprofenu, kwasu mefenamowego, flurbiprofenu, naproksenu i ketoprofenu. Natomiast w przypadku paracetamolu, jeden z aktywnych wodorów ulegających podstawieniu pochodzi z grupy hydroksylowej, a drugi znajduje się przy atomie azotu grupy amidowej. W wyniku derywatyzacji pod wpływem większości zastosowanych odczynników otrzymano disililopochodną tego leku. Wyjątek stanowił HMDS, który praktycznie nie wykazuje reaktywności w stosunku do grup amidowych. We wszystkich mieszaninach poderywatyzacyjnych zidentyfikowano ponadto mono-o-sililopochodną paracetamolu, natomiast nie stwierdzono obecności mono-n-sililopochodnej. Najefektywniejszym odczynnikiem derywatyzującym, dzięki któremu uzyskano najwięcej pochodnej di-tms, okazał się BSTFA, natomiast najsłabszym działaniem wykazał się HMDS. W tym przypadku wykryto tylko pochodną mono-tms o charakterze eteru oraz rozmyty pik niezderywatyzowanego paracetamolu. BSA, pomimo wysokiej skuteczności derywatyzacyjnej, ze względu na dodatkowy produkt, który powstaje z jego rozkładu, nie jest polecany do oznaczania paracetamolu. Produkt ten ma podobny czas retencji do pochodnej di-tms paracetamolu, co może prowadzić do zafałszowania wyników ilościowych. Na rycinie 2 przedstawiono porównanie pól powierzchni pików ibuprofenu po przeprowadzeniu do pochodnej TMS przy użyciu BSTFA i pochodnej TBDMS za pomocą MTB- STFA. Niemal dla wszystkich oznaczanych leków pochodne tert-butylodimetylosililowe charakteryzowały się większą intensywnością pików chromatograficznych. Wyjątek stano-

4 Tab. 1. Wartości m/z jonów molekularnych oraz jonów wynikających z odczepienia rodnika tert-butylowego, charakterystyczne dla pochodnych TBDMS analizowanych leków wiło najniższe stężenie paracetamolu, przy którym powstają głównie mono pochodne, zarówno TMS, jak i TBDMS (Ryc. 3). Wraz ze wzrostem stężenia leku obserwowano stopniowy przyrost stężenia pochodnej di- w mieszaninie poderywatyzacyjnej. W celu ilościowego oznaczenia paracetamolu należy uwzględnić obie jego pochodne. Ponieważ w komercyjnie dostępnych bibliotekach (8 edycja biblioteki Wiley a i NBS/EPA 2008) nie ma widm pochodnych TBDMS oznaczanych leków, ich identyfikacji dokonano na podstawie interpretacji zarejestrowanych widm mas. Na rycinie 4 przedstawiono widmo mas i schemat fragmentacji tert-butylodimetylosililowej pochodnej ibuprofenu. W zastosowanych warunkach jonizacji jon molekularny m/z 320 jest na tyle nietrwały, że zarejestrowano go tylko w śladowych ilościach. Zarejestrowano natomiast jon [(CH 3 ) 2 CHCH 2 C 6 H 4 CHCH 3 ] + przy m/z 161 charakterystyczny dla ibuprofenu bez względu na typ jego pochodnej. Pik główny o wartości m/z 263 wynika z odczepienia rodnika tert-butylowego (M-57) i jest typowy dla w wszystkich tert-butylodimetylosililowych pochodnych analizowanych leków [9, 13]. W widmach tych pochodnych zawsze obserwuje się również jon przy m/z 73 odpowiadający [Si(CH 3 ) 3 ] +, który jest charakterystyczny także dla pochodnych trimetylosililowych, oraz towarzyszący mu jon o wartości m/z 75. W podobny sposób były interpretowane widma tert-butylodimetylosililowych pochodnych pozostałych leków. W tabeli 1 przedstawiono masy cząsteczkowe tych pochodnych, jony wynikające z odczepienia rodnika tert-butylowego oraz ich względne intensywności w otrzymanych widmach. W celu oznaczenia analizowanych leków zoptymalizowano proces rozdziału chromatograficznego. Najkorzystniejsze rozdziały uzyskano na 60 m kolumnie typu HP-5 (95% polidimetylosiloksanu, 5% bifenylu). Niestety program, który zastosowano do rozdziału trimetylosililopochodnych w przypadku pochodnych TBDMS okazał się nieodpowiedni, głównie z powodu niecałkowitego rozdziału estrów ketoprofenu i kwasu mefenamowego. Z tego względu konieczne było zastosowanie łagodniejszego narostu temperaturowego i wydłużenie czasu analizy z 36 do 60 minut. Skuteczność odczynników zastosowanych do derywatyzacji potwierdzają krzywe kalibracyjne wykonane dla wszystkich oznaczanych leków. W przypadku pochodnych TMS charakteryzują się one wysokim współczynnikiem korelacji liniowej i niemal identycznym nachyleniem dla każdego z leków. Krzywe kalibracyjne uzyskane za pomocą MTBSTFA charakteryzuje Jon główny [M-57] Pochodna TBDMS Jon molekularny M + m/z intensywność m/z Ibuprofen 320 ślady 263 Flurbiprofen 358 ślady 301 Naproksen % 287 Kwas mefenamowy % 298 Ketoprofen 368 ślady 311 Paracetamol (mono) % 208 Paracetamol (di) % 322 równie wysoka korelacja liniowa, natomiast wartości ich współczynników kierunkowych a są wyraźnie wyższe, co wskazuje na lepszą czułość metody. Na rycinie 5 przedstawiono przykładowe krzywe kalibracyjne pochodnych TMS i TBDMS otrzymane dla flurbiprofenu. Wnioski Wszystkie testowane odczynniki silanizujące, które tworzą pochodne TMS można z powodzeniem wykorzystać do oznaczania ibuprofenu, flurbiprofenu, naproksenu, kwasu mefenamowego i ketoprofenu techniką GC/MS, przy czym ich skuteczność derywatyzacyjna jest porównywalna. HMDS i BSA nie są polecane do derywatyzacji paracetamolu. Oznaczanie testowanych leków w postaci pochodnych tert-butylodimetylosililowych jest korzystniejsze z uwagi na wyższą czułość metody oraz na znacznie większą odporność tych związków na ślady wody, ale wymaga znacznego wydłużenia czasu analizy GC. Badania finansowane przez Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach (grant nr KNW-2-151/09). Piśmiennictwo 1. Namieśnik J, Chrzanowski W, Szpinek P. Nowe horyzonty i wyzwania w analityce i monitoringu środowiska. Centrum Doskonałości Analityki i Monitoringu Środowiskowego, Gdańsk Maurer HH. Systematic toxicological analysis procedures for acidic drugs and/or metabolites relevant to clinical and forensic toxicology and/or doping control. J Chromatogr B 1999; 733: Polettini A. Systematic toxicological analysis of drugs and poisons in biosamples by hyphenated chromatographic and spectroscopic techniques. J Chromatogr B 1999; 733: Kurkiewicz S i wsp. Derywatyzacja on-line w oznaczaniu ibuprofenu i naproksenu techniką GC/MS. Farm Przegl Nauk 2008; 3: Kurkiewicz S, Dzierżęga-Lęcznar A, Stępień K. Wodorotlenek trimetylosulfoniowy jako czynnik derywatyzujący w analizie niesteroidowych leków przeciwzapalnych techniką GC/MS. Farm Przegl Nauk 2008; 11-12: Kosjek T, Heath E, Krbavcic A. Determination of nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAIDs) residues in water samples. Environ Int 2005; 31: Knapp DR. Handbook of Analytical Derivatization Reactions. Wiley. Chichester Farré M, Petrovic M, Barceló D. Recently developed GC/ MS and LC/MS methods for determining NSAIDs in water samples. Anal Bioanal Chem 2007; 387: Rodríguez I i wsp. Determination of acidic drugs in sewage water by gas chromatography-mass spectrometry as tert.-butyldimethylsilyl derivatives. J Chromatogr A 2003; 985:

5 10. Carpinteiro JB i wsp. Application of strategic sample composition to the screening of anti-inflammatory drugs in water samples using solid-phase microextraction. Anal Chim Acta 2004; 524: Heath E i wsp. Second interlaboratory exercise on nonsteroidal anti-inflammatory drug analysis in environmental aqueous samples. Talanta 2010; 81: Farre M i wsp. First interlaboratory exercise on non-steroidal anti-inflammatory drugs analysis in environmental samples. Talanta 2008; 76: Kyoung-Rae K, Hye-Ran Y. Rapid screening for acidic non-steroidal anti-inflammatory drugs in urine by gas chromatography mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode. J Chromatogr B 1996; 682: data otrzymania pracy: r. data akceptacji do druku: r. Adres do korespondencji: dr n. farm. Sławomir Kurkiewicz Katedra Analizy Instrumentalnej Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach ul. Narcyzów 1, Sosnowiec tel: slawek@sum.edu.pl