STRESZCZENIE Rak jelita grubego (RJG) jest jednym z najczęstszych nowotworów występujących zarówno w polskiej jak i europejskiej populacji. Nowotwór ten wykrywany jest w zdecydowanej większości przypadków w II i III stadium zaawansowania klinicznego. Odsetek przeżyć 5-letnich wynosi w Polsce 39%. Aktualnie wiadomo, że na rozwój nowotworu oprócz czynników genetycznych i epigenetycznych wpływa mikrośrodowisko guza i związana z nim odporność immunologiczna danego pacjenta. Proponowana immunologiczna klasyfikacja raka jelita grubego według Galona wykazała, że intensywny naciek limfocytów CD3 i CD8 lub CD8 i CD45RO w inwazyjnym marginesie i wewnątrz guza, był zazwyczaj korzystnym czynnikiem prognostycznym dla pacjenta. Poszukiwane są nadal inne związane z odpowiedzią przeciwnowotworową czynniki prognostyczne, umożliwiające dokładniejszą ocenę rokowania pacjenta, gdyż wyniki leczenia pacjentów z tym samym stopniem zaawansowania nowotworu wg klasyfikacji TNM znacznie się różnią między sobą. Celem niniejszej pracy było ustalenie wpływu intensywności nacieków makrofagów towarzyszących guzowi CD68(+)iNOS(-) i liczby limfocytów T CD8(+)FoxP3(+) w zrębie guza, jako czynników prognostycznych na rokowanie pacjentów po resekcji jelita grubego. Przedmiotem badań immunohistochemicznych był materiał tkankowy w postaci bloczków parafinowych, pobrany od chorych poddanych leczeniu operacyjnemu z powodu gruczolakoraka jelita grubego, w Klinicznym Oddziale Chirurgii Ogólnej, Kolorektalnej i Urazów Wielonarządowych w Sosnowcu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach oraz w Oddziale Chirurgii Ogólnej i Onkologicznej Szpitala Specjalistycznego w Jaśle, w latach 2008-2011. Z badań wyłączono pacjentów, u których stwierdzono tło genetyczne choroby, schorzenia autoimmunologiczne i reumatoidalne, leczonych z powodu cukrzycy oraz chorych, którzy wcześniej otrzymali leczenie przeciwnowotworowe (neoadjuwantowe lub z powodu innego nowotworu). Retrospektywne badania materiału tkankowego pobranego od 89 pacjentów, w stopniu zaawansowania klinicznego T3N0M0 i T3N1-2M0, przeprowadzono w dwóch zbliżonych pod względem liczebności grupach. W oparciu o badania immunohistochemiczne dokonano oceny półilościowej nacieku makrofagów towarzyszących guzowi oraz oceny bezwzględnej liczby
limfocytów T CD8+ z ekspresją czynnika transkrypcyjnego FoxP3+ w zrębie guza, jako niezależnych i często pomocniczych czynników prognostycznych, u chorych z pierwotnym operacyjnym RJG. Parametrami klinicznymi ocenianymi w pracy był czas do pojawienia się objawów wznowy miejscowej lub czas do pojawienia się przerzutów odległych oraz całkowity czas przeżycia. W okresie ponad 7,5 letniej obserwacji, u 45 chorych wystąpił nawrót choroby zasadniczej, w tym 38 zmarło. W celu oceny dalszego rokowania chorych dokonano charakterystyki kliniczno-histopatologicznej pacjentów w podgrupach, w zależności od wystąpienia obu punktów końcowych. Różnice znamienne statystycznie między analizowanymi grupami, stwierdzone za pomocą testu U Manna-Whitneya, występowały pod względem liczby zajętych węzłów chłonnych, cechy N oraz stopnia zaawansowania klinicznego. Równocześnie stwierdzono zróżnicowanie pod względem intensywności infiltracji guza nowotworowego przez makrofagi związane z guzem, jak i i limfocyty T cytotoksyczne i regulatorowe T CD8(+). Uzyskane w pracy wyniki potwierdzają, że w mikośrodowisku nowotworu, w zależności od etapu jego rozwoju, subpopulacje komórek odpornościowych pełnią zróżnicowane funkcje. Początkowo u pacjentów, u których nie stwierdzono nawrotu lub zgonu z powodu choroby zasadniczej, występował niewielki przyrost limfocytów regulatorowych T CD8(+) z ekspresją czynnika transkrypcyjnego FoxP3(+), a zwiększony był udział limfocytów efektorowych o właściwościach cytoksycznych. Wraz ze wzrostem rozwoju nowotworu u pacjentów, u których nastąpił nawrót choroby lub zgon, nastąpiło znaczne zwiększenie liczby limfocytów regulatorowych, przy równoczesnym obniżeniu liczby limfocytów cytotoksycznych. Wzrost limfocytów regulatorowych związany był ze wzrostem intensywności nacieku makrofagów CD68(+)iNOS(-) w zrębie guza. Uzyskano umiarkowaną korelację między tymi subpopulacjami, w teście korelacji porządku rang Spearmana (R=0,54; p<0,0001). W analizie wieloczynnikowej, jedynym niezależnym, negatywnym czynnikiem prognostycznym, wpływającym na przeżycie pacjenta, była zwiększona liczba limfocytów T CD8(+)FoxP3(+), wykazująca silne właściwości supresorowe. Wnioski W badanej, stosunkowo jednorodnej pod względem zaawansowania klinicznego grupie chorych na gruczolakoraka jelita grubego, obserwuje się szerokie zróżnicowanie pod względem intensywności
infiltracji guza nowotworowego, przez makrofagi związane z guzem TAMs, jak i limfocyty T CD8(+)FoxP3(+) regulatorowe. Silnie i średnio wyrażony naciek guza przez makrofagi fenotypu M2 związany jest z krótszym czasem wolnym od wznowy oraz krótszym całkowitym czasem przeżycia chorych. Intensywność nacieku makrofagów koreluje dodatnio z liczbą obserwowanych w guzie limfocytów T regulatorowych. Zwiększona liczba naciekających zrąb guza limfocytów regulatorowych T CD8(+)FoxP3(+) stanowi jedyny, niezależny, negatywny czynnik prognostyczny u chorych na gruczolakoraka jelita grubego, w stopniu zaawansowania IIA, IIIB i IIIC, w porównaniu z nasilonym naciekiem makrofagów o fenotypie M2 oraz cechą N klasyfikacji TNM. Słowa kluczowe: rak jelita grubego, klasyfikacja, prognostyczne markery, wynik immunologiczny, odporność, limfocyty T regulatorowe, FOXP3, inos, makrofagi związane z nowotworem.
ABSTRACT Colorectal cancer (CRC) is one of the most common cancers occurring in both Polish and European population. This cancer is detected in the second and the third clinical stage in the straight majority of cases. The proportion of five-year survival in Poland is 39%. At present, it is known that the microenvironment of the tumour as well as the related individual immunity of the patient, along with genetic and epigenetic factors influence the development of this cancer. The proposed immunological classification of colorectal cancer by Galon revealed that the intense infiltration of CD3 and CD8 or CD8 and CD45RO lymphocytes in the invasive margin and in the centre of the tumour was generally considered as a favourable prognostic factor for the patient. However, other prognostic factors related to anticancer immune response allowing more accurate assessment of patient prognosis are being still searched for because the results of treatment of the patients with the same tumour stage differ significantly from one another according to TNM classification. The aim of this study is to determine the impact of the intensity of macrophages infiltration of CD68(+)iNOS(-) tumour and the number of CD8(+)FoxP3(+) lymphocytes in the tumour stroma as prognostic factors for patient prognosis after colon resection. The subject of immunohistochemistry was the tissue material in the form of paraffin blocks collected from the patients operated for colorectal adenocarcinoma in the Clinical Department of General, Colorectal and Trauma Surgery in Sosnowiec of the Silesian Medical University in Katowice and the Department of General Surgery and Oncology of Specialist Hospital in Jasło in 2008-2011. The patients diagnosed with the genetic background of the disease, autoimmune and rheumatoid diseases, diabetes as well as those who had previously received anticancer treatment (neoadjuvant therapy or had another cancer) were excluded from the study. The retrospective examination of the tissue material collected from 89 patients with clinical stage of T3N0M0 and T3N1-2M0 was carried out in two groups of similar number. On the basis of the immunohistochemical studies a semiquantitative assessment of the infiltration of tumour-associated macrophages and the absolute number of CD8(+)T lymphocytes with the expression of the FoxP3(+) transcription factor in the tumour stroma, as independent and often auxiliary prognostic factors in patients with primarily operated CRC, was carried out.
The clinical parameters analysed in this study were the time period until the appearance of local recurrence or the time period until the appearance of remote metastases as well as the time period of overall survival. During the seven and a half years of observation, 45 patients had the recurrence of the underlying disease and 38 of them died. In order to carry out further assessment of patient prognosis, a clinical and histopathological characteristic of the patients was made in subgroups depending on the occurrence of both clinical endpoints. Statistically significant differences between the analysed groups identified by the Mann-Whitney U test occurred in respect to the number of affected lymph nodes, the neurotrophic marker and the tumour stage. At the same time the variation in the intensity of infiltration of the tumour by tumour-associated macrophages as well as cytotoxic T and regulatory T CD8(+) lymphocytes was identified. The results obtained in this study confirm that the subpopulations of immune cells in the tumour microenvironment depending on its stage of development perform various functions. Initially, among the patients who did not have the recurrence or die from the underlying disease, there was a little increase in regulatory T CD8(+) lymphocytes with the expression of the FoxP3(+) transcription factor, and the part taken by the effector lymphocytes of cytotoxic properties was increased. With the growth of tumour progression among the patients who had the illness recurrence or died of it, there was a significant increase in the number of regulatory lymphocytes while the reduction in the number of cytotoxic lymphocytes at the same time. The growth in regulatory lymphocytes was connected with the increase in the intensity of the macrophage infiltration of CD68(+)iNOS (-) in the tumour stroma. The Spearman rank correlation test (R = 0.54; p <0.0001) showed a moderate correlation between these subpopulations. In the multivariate analysis, the only independent negative prognostic factor affecting patient survival was the increased number of T CD8(+)FoxP3(+) lymphocytes, which showed strong suppressor properties. Conclusion In the researched group of patients with relatively similar advancement of colorectal adenocarcinoma, it can be observed that there is a wide variation in the intensity of tumor infiltration by tumor associated macrophages (TAMs) and regulatory CD8 (+) FoxP3 (+) lymphocytes. Strong and middle expressed infiltration of the tumor by macrophages of M2
phenotype is related to shorter relapse-free period as well as shorter overall survival. The intensity of infiltration of macrophages correlates positively with the number of regulatory T cells observed in the tumor. Increased number of regulatory CD8 (+) FoxP3 (+) lymphocytes infiltrating the tumor stroma is the only independent, negative factor for patient prognosis with colorectal adenocarcinoma, at the advancement stage of IIA, IIIB and IIIC, as compared with severe infiltration of macrophages of M2 phenotype and neurotrophic marker in TNM classification. Key words: colorectal cancer, classification, prognostic markers, Immunoscore, immunity, regulatory T cells, FOXP3, inos, tumor- associated macrophages.