Rola chromatyny w regulacji ekspresji genów. Monika Zakrzewska-Płaczek

Rola chromatyny w regulacji ekspresji genów Monika Zakrzewska-Płaczek monika.z@ibb.waw.pl

Epigenetyczna etyczna regulacja ekspresji genów zmiana ekspresji genu, która zachodzi bez zmiany sekwencji DNA www.plantcell.org/cgi/doi/1 0.1105/tpc.110.tt0110

Co oznacza epigenetyka? Dosłownie, ownie, słowo s epigenetyka oznacza powyżej genetyki Transkrypcja Jest to informacja pozagenowa,, nie dotycząca ca samej sekwencji, ale kowalencyjnych modyfikacji DNA i zmian struktury chromatyny wyciszanie epigenetyczne 3

Co oznacza epigenetyka? W praktyce, epigenetyka opisuje zjawiska, dzięki którym w identycznych genetycznie komórkach lub organizmach dochodzi do różnego sposobu ekspresji genów czego efektem są różnice fenotypowe. Różne epigenetyczne modyfikacje prowadzą do różnych wzorów ekspresji genów komórki (organizmy) identyczne genetycznie różne fenotypy 4

Struktura chromatyny ~147 bp DNA jest owinięty wokół oktameru białek histonowych + 50bp DNA łącznikowego + histon H1 ~ 147 bp DNA + 8 histonów: 2x H2A H2B H3 H4 5

Struktura chromatyny struktury 3 3 (oddziaływania między włóknami chromatyny) struktury 2 2 maksymalnie upakowane (np. włókno w 30nm) struktury 2 2 H2A H4 H3 nukleosomy H2B DNA Caterino & Hayes (2007) Nature 6

Struktura chromatyny: W mitozie cały y DNA występuje jako heterochromatyna CENTROMER heterochromatyna konstytutywna stale obecna w komórce, nie zawiera genów (obszary centromerów i telomerów) fakultatywna pojawia się w jądrze okresowo i tylko w niektórych komórkach rkach, prawdopodobnie zawiera geny nieaktywne w czasie niektórych faz cyklu komórkowego euchromatyna luźno upakowana forma chromatyny, zawierająca geny aktywne transkrypcyjnie 7

Heterochromatyna i euchromatyna tworzą obszary o różnej r gęstog stości w jądrze j komórkowym Euchromatin DAPI merge heterochromatyna centromerowa i przycentromerowa Immunolokalizacja z przeciwciałem anty-h2a.z w komórkach liści A. thaliana 8 Deal, R.B., Topp,, C.N., McKinney, E.C., and Meagher, R.B. (2007) Plant Cell

Mechanizmy epigenetyczne kontroli ekspresji genów metylacja DNA potranslacyjne modyfikacje histonów przebudowa chromatyny zależna od ATP warianty histonów ncrna histony chromatyna DNA Dulac C. (2010 10) Nature 9

Metylacja DNA metylacja DNA potranslacyjne modyfikacje histonów przebudowa chromatyny zależna od ATP warianty histonów ncrna histony chromatyna DNA Dulac C. (2010 10) Nature 10

Metylacja DNA NH2 N N O ~ cytozyna N N O metylotransferaza NH2 ~ CH3 5-metylocytozyna DNA może być kowalencyjnie modyfikowany w reakcji metylacji cytozyny: wyst. u ssaków i roslin, ale nie u niższych zwierzat czy drożdży 5-metylocytozyna TTCGCCGACTAA Rola metylacji DNA: imprinting,, inaktywacja chromosomu X, rozwój j embrionalny, represja sekwencji powtórzonych i transpozonów 11

Metylotransferazy DNA u Arabidopsis thaliana MET1 (METHYLTRANSFERASE1( METHYLTRANSFERASE1) 5'-CG CG-3 i 5 -CNG5 CNG-3 wyciszanie transpozonów,, powtórze rzeń DNA, piętnowanie niektórych genów CMT3 (CHROMOMETHYLASE3( CHROMOMETHYLASE3) 5'-CHG CHG-3' (H= A, C lub T) specyficzna dla roślin może e być rekrutowana przez metylotransferazę histonową SUVH4 a więc c odpowiadać na modyfikację białek histonowych DRM1/ DRM2 ( 2 (DOMAINS REARRANGED 1/ 1/2) 5'-CHH CHH-3' metylacja de novo DRM2 metylacja powtórze rzeń DNA wyciszanych przez sirna SUVH4 (KYP), 12

Metylotransferazy DNA (DNMT) metylotransferaza DNA 1 de novo: metylotransferaza DNA 3A metylotransferaza DNA 3B 13

Usuwanie grup metylowych - demetylacja Law & Jacobsen (2010 10) Nat Rev Genet 14

Metylacja CG (symetryczna)) może być przenoszona podczas replikacji DNA 5 A T G C G T A C T REPLI REPLIKACJA KACJA A T G C G T A C T T A C G C A T G A MET1 A T G C G T A C T T A C G C A T G A 3 T A C G C A T G A A T G C G T A C T METYLACJA ZACHOWAWCZA A T G C G T A C T T A C G C A T G A T A C G C A T G A 15

Asymetryczne miejsca metylacji: : CHH (H= A, C lub T) 5 A T G C A A A C T 3 T A C G T T T G A REPLI REPLIKACJA KACJA A T G C A A A C T T A C G T T T G A A T G C A A A C T } T A C G T T T G A konieczna jest dodatkowa informacja do ponownej metylacji DNA Metylacje w miejscach asymetrycznych są utrzymywane (i inicjowane) dzięki informacji zawartej w odpowiednich modyfikacjach białek histonowych, na drodze mechanizmu metylacji DNA zależnej od RNA (RNA-directed DNA Methylation, RdDM) 16

Metylacje cytozyny w niektórych miejscach są utrzymywane przez sirna RdDM 5 A T G C A A A C T 3 T A C G T T T G A REPLI REPLIKACJA KACJA A T G C A A A C T T A C G T T T G A A T G C A A A C T T A C G T T T G A A T G C A A A C T T A C G T T T G A sirna DRM2 17

Głównym celem metylacji cytozyn jest wyciszenie transpozonów i powtórze rzeń DNA Nie wszystkie transpozony są wyciszane na drodze mechanizmu RNAi GENY A. thaliana TRANSPOZONY demetylaza H3K9 KYP (SUVH4) H3K9 metylotransferaza DDM1 ATPaza z rodziny SNF2; przebudowa chromatyny Do zmetylowanego DNA przyłą łączają się białka z domeną MBD (methyl-cpg binding domain),, do których z kolei wiąż ąże e się kompleks deacetylazy histonowej, co prowadzi do kondensacji chromatyny i represji ekspresji genów; mogą się również przyłą łączać metylotransferazy histonowe 18 Texeira & Colot (2009) EMBO J.

Potranslacyjne modyfikacje białek histonowych metylacja DNA potranslacyjne modyfikacje histonów przebudowa chromatyny zależna od ATP warianty histonów ncrna histony chromatyna DNA Dulac C. (2010 10) Nature 19

Modyfikacje białek histonowych wpływaj ywają na zmiany struktury chromatyny DNA oktamer histonowy NUKLEOSOM Końce N białek histonowych (tzw. ogony histonowe) wystają poza nukleosom, są dostępne dla enzymów modyfikujących 20

Modyfikacje białek histonowych wpływaj ywają na zmiany struktury chromatyny DNA oktamer histonowy Modyfikacje histonów: (kod histonowy) acetylacja (Ac) metylacja (Me) fosforylacja (P) ubikwitynacja (Ub) sumoilacja (Su) W zalezności od miejsca w/w modyfikacji mogą one przyczyniać się do aktywacji lub inaktywacji transkrypcji 21

Modyfikacje białek histonowych wpływają na zmiany struktury chromatyny S/T kinazy fosfatazy -P S/T fosforylacja K acetylotransferazy histonowe (HAT) deacetylazy histonowe (HDAC) -COCH3 K acetylacja K/R metylotransferazy demetylazy -CH3 K/R metylacja 22

Known post-translational translational modifications and the amino acid residues they modify 23 Latham J. A., Dent S. Y. R. (2007) Nat. Struct.. Mol. Biol.

Acetylacja lizyny białek histonowych seria acetylo-lizyn lizyn (bardziej obojętne niż dodatnio naładowane lizyny) ) na ogonach histonów osłabia interakcje elektrostatyczne miedzy histonami a DNA, co pozwala na rozluźnienie struktury chromatyny inne funkcje: regulacja naprawy DNA poprzez przebudowę chromatyny; acetylowane lizyny są wtedy miejscami przyłączenia dla białek przebudowujących chromatynę (poprzez bromodomenę) + NH3 lizyna (K) N O CH3 acetylowana lizyna (KAc) za acetylację odpowiedzialne sa acetylotransferazy (HAT), a donorem grupy acetylowej jest acetylo-coa acetylacja jest odwracalna; deacetylację przeprowadzaja deacetylazy (HDAC) K acetylotransferazy histonowe (HAT) deacetylazy histonowe (HDAC) -COCH3 K 24

Metylacja białek histonowych metylacja lizyny powoduje zwiekszenie hydrofobowego i kationowego charakteru tej reszty aminokwasowej; ; w zależnosci od enzymu lizyna może byc mono, di lub trimetylowana. metylowana lizyna Mono (Kme1) Di (Kme2) + NH2 + NH CH3 CH3 CH3 za metylację odpowiedzialne są metylotransferazy (HMT) zawierające domenę SET, a donorem grupy metylowej jest S-adenozylometionina (SAM) lub S- adenozylohomocysteina (AdoHcy); metylacja H3K79 katalizowana jest przez Dot1 spoza rodziny Set Tri (Kme3) + N CH3 CH3 CH3 usuniecie grup metylowych: wymiana nukleosomów,, modyfikacje chemiczne zmetylowanych reszt lub enzymatyczna demetylacja K/R metylotransferazy demetylazy -CH3 K/R 25

Fosforylacja białek histonowych Fosforylacje seryn H3S10 i H3S28 niezbedne są do kondensacji chromosomów i prawidłowej mitozy; także pozytywna rola w aktywacji transkrypcji: hamuje metylację H3K9 i promuje acetylację lizyn położonych w jej sąsiedztwie Zidentyfikowano ufosforylowane seryny na wszystkich histonach (fosforylacja wariantu H2A niezbedna jest w aktywacji naprawy DNA i regulacji cyklu komórkowego po uszkodzeniu DNA) S/T kinazy fosfatazy -P S/T 26

Przykład modyfikacje H3 H3 Me Me P Ac Me Ac Ac Me Me P A R T K Q T A R K S T G G K A P R K Q L A T K A A R K S 4 9 10 14 1718 23 262728 Koniec N histonu H3 jest często modyfikowany (w jednym lub kilku miejscach), co przyczynia się do aktywacji lub inhibicji transkrypcji. 27

Przykład modyfikacje H3 H3 Me Me P Ac Me Ac Ac Me Me P A R T K Q T A R K S T G G K A P R K Q L A T K A A R K S 4 9 10 14 1718 23 262728 Koniec N histonu H3 jest często modyfikowany (w jednym lub kilku miejscach), co przyczynia się do aktywacji lub inhibicji transkrypcji. Lizyna może być acetylowana lub mono-, di-, lub tri-met metylowana + NH3 lizyna (K) N O CH3 acetylowana lizyna (KAc) metylowana lizyna Mono (Kme1) Di (Kme2) Tri (Kme3) + NH2 + NH + N CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 28

Modyfikacje białek histonowych zmieniają strukturę chromatyny H3 Me P Ac K4 S10 K14 H3 Me Me P K9 K27 S28 29

Mechanizm działania ania modyfikacji potranslacyjnych białek histonowych Działanie anie bezpośrednie: zmiany w oddziaływaniach histon-dna i histon-histon Działanie anie pośrednie: rekrutacja białek rozpoznających określone modyfikacje histonów Kozaurides 2007 30

Inne modyfikacje białek histonowych występuj pują w sekwencjach genów w kodujących białka, inne w sekwencjach transpozonowych Analiza typu ChIP-chip gen mrna H3K4me metylacja H3K4 występuje w genach aktywnie transkrybowanych H3K9me Me-C transpozonon metylacja H3K9 jest związana zana z metylowanym DNA (Me-C) i transpozonami czerwony = silna korelacja zielony = słaba korelacja Lippman,, Z., Gendrel,, A.-V., Black, M., Vaughn, M.W., Dedhia,, N., McCombie,, W.R., Lavine,, K., Mittal,, V., May, B., Kasschau, K.D., Carrington, J.C.,Doerge,, R.W., Colot,, V., Martienssen,, R. (2004) Nature 31

32 Barth T. K., Imhof A. (2010) Trends in Biochemical Science

H3K27me3: : w genach kodujących białka Analiza typu ChIP-chip niebieski = geny czerwony = powtórzenia DNA H3K27me3 u A. thaliana występuje w rejonach bogatych w sekwencje kodujące zielony = H3K27me3 fioletowy = metylocytozyna 33 Zhang, X., Clarenz,, O., Cokus,, S., Bernatavichute,, Y.V., Pellegrini,, M., Goodrich, J., Jacobsen, S.E. (2007) PLoS Biol.

Metylacja H3K27me3: : kompleks PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) 2 Polycomb Repressive Complex 2 H3K27me3 geny aktywne geny wyciszone 34

Białka rdzenia kompleksu PRC2 u Drosophila PRC2 u D. melanogaster: 4 zakonserwowane ewolucyjnie białka E(Z) ESC SU(Z)12 NURF55 Enhancer of zeste (E(Z)) Extra sex comb (ESC) Suppressor of zeste 12 (SU(Z)12) NURF55 35 Simon J. A., Kingston R. E. 2013 Mol Cell

Białka rdzenia kompleksu PRC2 u Arabidopsis Drosophila PRC2 E(Z) (methylase) ESC SU(Z)12 NURF55 Arabidopsis PRC2 CURLY LEAF (CLF) MEDEA (MEA) SWINGER (SWN) FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM (FIE) FERTILIZATION- INDEPENDENT SEED 2 (FIS2) EMBRYONIC FLOWER 2 (EMF2) MULTICOPY SUPPRESSOR OF IRA1 (MSI1,2,3,4,5) VERNALIZATION 2 (VRN2) 36

U roślin: różne r kompleksy PRC2 odgrywają różne role MEA + FIS2 kiełkowanie kowanie indukcja kwitnienia CLF/SWN + VRN2 CLF/SWN + EMF2 rozwój j kwiatów 37

Metylacja H3K27me3 u zwierząt jest utrzymywana przez PRC1 Polycomb Repressive Complex 2 Polycomb Repressive Complex 1 H3K27me3 H3K27me3 geny aktywne geny wyciszone geny stabilnie wyciszone 38 Simon J. A., Kingston R. E. 2013 Mol Cell

PRC1-like u roślin działa a podobnie Polycomb Repressive Complex 2 PRC1-like H3K27me3 LHP1 H3K27me3 geny aktywne geny wyciszone geny stabilnie wyciszone LHP1 wiąże specyficznie H3K27me3 39

LHP1 występuje razem z metylacją H3K27me3 Analiza typu ChIP-chip silna korelacja występowania LHP1 i H3K27me3 40 Turck F, Roudier F, Farrona S, Martin-Magniette Magniette M-L, Guillaume E, et al. 2007 PLoS Genet

LHP1 występuje razem z metylacją H3K27me3 Analiza typu ChIP-chip transpozon metylowany H3K9me2! 41 Turck F, Roudier F, Farrona S, Martin-Magniette Magniette M-L, Guillaume E, et al. 2007 PLoS Genet

Mechanisms of repression by PRC1 family complexes 42 Simon J. A., Kingston R. E. 2013 Mol Cell

Przebudowa chromatyny zależna od ATP (chromatin( chromatin remodelling) metylacja DNA potranslacyjne modyfikacje histonów przebudowa chromatyny zależna od ATP warianty histonów ncrna histony chromatyna DNA Aktywność kompleksów w przebudowujących chromatynę zależy y od ATP, w wyniku ich działania ania zmienia się sposób b oddziaływania histon-dna DNA. Kompleksy remodelujące zaangażowane sąs zarówno w aktywację, jak i represję transkrypcji. Dulac C. (2010 10) Nature 43

Przebudowa chromatyny: przesunięcie oktameru histonowego usunięcie oktameru histonowego odsłoni onięcie DNA rozwinięcie nici DNA zamiana dimeru H2A-H2B H2B na H2A.Z-H2B H2B (Htz1 u S. cerevisiae) usunięcie dimerów H2A-H2B H2B zmiana składu oktameru histonowego 44 Clapier C. R., Cairns B. R. 2009 Annu Rev Biochem

Wyróżniamy cztery rodziny kompleksów odpowiedzialnych za przebudowę chromatyny: SWI2: zawieraja bromodomenę, wszystkie rodzaje przebudowy chromatyny ISWI: przesuwanie nukleosomów CHD: zawieraja chromodomene, regulacja transkrypcji INO80/SWR: wymiana histonów 45 Clapier C. R., Cairns B. R. 2009 Annu Rev Biochem

Kompleksy przebudowujące chromatynę składają się z wielu białkowych podjednostek Drożdżowy SWI/SNF: 11 białek potrzebny do ekspresji genów decydujących o typie koniugacyjnym drożdży (switching),, oraz ekspresji genów regulujących metabolizm sacharozy (sucrose non-fermenting fermenting) 46

DDM1 (decrease DDM1 decrease in DNA methylation1 ATPaza z rodziny SWI/SNF u A. thaliana DNA methylation1) : DDM1 jest specyficznie zaangażowana w metylację transpozonów GENY A. thaliana TRANSPOZONY demetylacja H3K9 KYP (SUVH4) H3K9 metylotransferaza DDM1 ATPaza z rodziny SNF2; remodeling chromatyny DDM1 jest kluczowym czynnikiem łącz czącym cym przebudowę chromatyny i wprowadzanie/utrzymywanie metylacji DNA 47 Texeira & Colot (2009) EMBO J.

Warianty histonów metylacja DNA potranslacyjne modyfikacje histonów przebudowa chromatyny zależna od ATP warianty histonów ncrna histony chromatyna DNA Dulac C. (2010 10) Nature Za wymianę różnych wariantów histonów w oktamerze histonowym odpowiadają kompleksy przebudowujące chromatynę z rodziny INO80/SWR 48

Warianty histonów: X-inactivation Talbert & Henikoff (2010) Nat Rev Mol Cell Biol 49

Histon H2A.Z: aktywacja transkrypcji gen nieaktywny gen aktywny kompleks SWR1/ SRCAP H2A.Z H2A Obecność odmiany histonu H2 - H2A.Z sprzyja transkrypcji. Kompleks SWR1/SRCAP zamienia histon H2A na H2A.Z 50

Histon CENH3: centromery CENH3 H3 nukleosomy w centromerach zawierają wariant histonu H3: CENH3 (CENP-A u zwierząt) centromery zawierające CENH3 są otoczone obszarem bogatym w metylacje H3K9me2 (heterochromatyna przycentromerowa) 51 Jiang,, J., Birchler,, J.A., Parrott, W.A., and Dawe,, R.K. (2003) Trends Plant Sci.. Elsevier. Zhang, W., Lee, H.-R., Koo,, D.-H., and Jiang,, J. (2008) Plant Cell

Epigenetyczna regulacja ekspresji genów w przez ncrna metylacja DNA potranslacyjne modyfikacje histonów przebudowa chromatyny zależna od ATP warianty histonów ncrna histony chromatyna DNA RNA jest jedynym jak dotąd d poznanym czynnikiem inicjującym cym dziedziczenie epigenetyczne i odróżniaj niającym sekwencje, które mają zostać wyciszone lub aktywowane Dulac C. (2010 10) Nature 52

Epigenetyczna regulacja ekspresji genów przez ncrna long non- epigenetyczna regulacja ekspresji genów przez lncrna (long coding RNA) u ssaków: inaktywacja chromosomu X kompensacja dawki chromosomów płciowych (dosage u Drosophila melanogaster rox dosage compensation) RdDM (RNA-directed DNA methylation RdDM methylation) u roślin i S. pombe metylacja DNA zależna od RNA 20-24nt 24nt sirna 53

Epigenetyczna regulacja ekspresji genów przez lncrna u ssaków niektóre lncrna (transkrypty polimerazy RNA II) rekrutują kompleksy wyciszające ce transkrypcję do odpowiednich rejonów genomu, zarówno in cis,, jak in trans PcG- Polycomb group proteins G9a- metylotransferazy histonowe /H3K9/H3K27 XIST inaktywacja chromosomu X u ssaków (dosage compensation: : wyrównanie wnanie poziomu ekspresji genów w chromosomów w X) 54 Chen & Carmichael (2010) Wiley Interdisciplinary Reviews: : RNA

Inaktywacja chromosomu X: wyciszanie epigenetyczne X X XX W każdej komórce ssaków w płci p żeńskiej, jedna kopia chromosomu X jest inaktywowana epigenetycznie. dosage compensation: wyrównanie wnanie poziomu ekspresji genów w chromosomów w X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Kolor futra u kotów jest częściowo determinowany przez gen orange, zlokalizowany na chromosomie X. Heterozygotyczna kotka posiada mozaikowe zabarwienie futra: zależnie od chromosomu X podlegającego inaktywacji, w melanocytach dochodzi do ekspresji określonej formy melaniny: eumelanina czarno-brązowa feomelanina żółto-czerwona Photo credit: DrL 55

Inaktywacja chromosomu X: wyciszanie epigenetyczne Mus musculus: : u samic od wczesnego etapu rozwoju zarodkowego na aktywnym chromosomie X ekspresja Tsix,, na nieaktywnym ekspresja Xist 17kb (u myszy; ludzki 19kb) ncrna XIST opłaszcza chromosom X 56 John E. Froberg, Lin Yang, Jeannie T. Lee (2013) Journal of Molecular Biology

Inaktywacja chromosomu X: wyciszanie epigenetyczne XIST ncrna uruchamia zmiany epigenetyczne, które zapewniają pamięć komórkową ową stanu nieaktywnego: zamiana histonu H2A metylacja histonu H3: H2A na makroh2a H3K9 H3K27 deacetylacja histonu H4 (?) metylacja DNA /już po inaktywacji chromosomu tzw. ciałko Barra: : skondensowana forma chromosomu X, głównie w postaci heterochromatyny RepA RepA: : 1,6kb ncrna zawierający sekwencje rejonu 5 transkryptu XIST bezpośrednio wiąże kompleks PRC2 57 John E. Froberg, Lin Yang, Jeannie T. Lee (2013) Journal of Molecular Biology

Epigenetyczna regulacja ekspresji genów przez ncrna long non- epigenetyczna regulacja ekspresji genów przez lncrna (long coding RNA) u ssaków: inaktywacja chromosomu X kompensacja dawki chromosomów płciowych (dosage u Drosophila melanogaster rox dosage compensation) rox ncrna inicjuje modyfikacje histonów u samców Drosophila zwiększenie aktywności chromosomu X acetylacja histonów demetylacja H3K9 59

Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS): hc-sirna małe RNA mogą hamować transkrypcję określonych genów w poprzez kowalencyjne modyfikacje DNA lub białek histonowych białka histonowe transkrypcja Ten rodzaj wyciszenia jest często związany ze stale nieaktywnym transkrypcyjnie DNA, włączając rejony centromerowe i transpozony, ale również zachodzi w genach. DNA wyciszenie 61

Model mechanizmu metylacji DNA zależnej od RNA (RdDM- RNA-directed DNA methylation) chromatin remodelling GW/WG chromatin remodelling elongation factor dsrna-binding protein 62

Epigenetyczne programowanie pomaga kontrolować zmiany faz rozwojowych u roślin zmiana fazy rozwojowej zmiana fazy rozwojowej rozwój zarodkowy rozwój wegetatywny rozwój generatywny Ekspresja FLC jest regulowana przez RdDM regulacja ekspresji FLC: antysensowny RNA komplementarny do rejonu 3 3 genu FLC transkrypcja antysens z 3 UTR 3 prawdopodobnie przez polimerazę RNA IV regulacja ekspresji FLC: wymaga obecności ci DCL3, RDR2 i polimerazy RNA IV, transkrypcja przez polimerazę IV substrat dla DCL3 do produkcji sirna,, które rekrutują kompleksy modyfikujące histony wyciszenie ekspresji genu FLC 63