Komórki macierzyste i ich zastosowanie w chorobach hematoonkologicznych

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2014; 50(3): 241-248 Praca poglądowa Review Article Komórki macierzyste i ich zastosowanie w chorobach hematoonkologicznych Stem cells and their practical application in hematooncologic disorders Magdalena Gauza 1, Iwona Urbanowicz 2 1 Pracownia Cytometrii Przepływowej, Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów krwi i Transplantacji Szpiku, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu 2 Zakład Hematologii Laboratoryjnej, Katedra Analityki Medycznej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu Streszczenie Poznanie biologii komórek macierzystych pozwoliło na zrozumienie wielu procesów komórkowych, takich jak: samoodnowa, proliferacja czy różnicowanie. Stało się podstawą ich klasyfikacji uwzględniającej pochodzenie tkankowe oraz zdolność komórek macierzystych do różnicowania się. Badania nad patogenezą nowotworów potwierdziły istnienie nowotworowych komórek macierzystych, wykazujących cechy zarówno fizjologicznych komórek macierzystych, jak i komórek neoplastycznych. Doniesienia naukowe potwierdzają, że komórki macierzyste mogą być wykorzystane w terapii wielu schorzeń m.in.: chorób nowotworowych, cukrzycy, chorób neurodegeneracyjnych, niewydolności mięśnia sercowego, marskości wątroby, czy uszkodzeń tkanki mięśniowej. Wprowadzenie do diagnostyki hematologicznej cytometrii przepływowej umożliwiło identyfikację hematopoetycznych (krwiotwórczych) komórek macierzystych, które należą do najlepiej poznanych dorosłych komórek macierzystych. W ostatnich latach zwrócono uwagę na szereg szlaków sygnalizacyjnych, molekuł adhezyjnych, a także komórek będących składnikami budulcowymi niszy szpikowej osteoblastyczej i okołonaczyniowej, które mają wpływ na funkcjonowanie krwiotwórczych komórek macierzystych. Transplantacja tych komórek to obecnie uznana i powszechna metoda leczenia schorzeń hematoonkologicznych. O sukcesie każdej transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych decydują m.in. reakcje zachodzące pomiędzy komórkami dawcy a mikrośrodowiskiem szpiku biorcy. Summary Understanding stem cell biology allowed for the comprehension many cellular processes, such as self-renewal, proliferation and differentiation. The current classifications of stem cells include their ability to differentiate themselves and their origins. There are also cancer stem cells showing both the physiological characteristics of physiological stem cells and tumor cells as well. Stem cells are a potential therapeutic agent in: cancer, diabetes, neurodegenerative diseases, cardiac insufficiency, cirrhosis of the liver and muscle tissue injuries. Present in the bone marrow hematopoietic stem cells (HSCs) are among the best known adult stem cells. Introducing of studies of flow cytometry into the hematologic diagnostics has enabled them to be identified. In recent years, attention has been paid to a number of signaling pathways, cell adhesion molecules, as well as cells which are components of bone marrow niche, osteoblastic and perivascular that affect the functioning of the HSCs. Currently, transplantation of hematopoietic stem cells is a recognized method of treating hematooncologic disorders. The success of any transplant of hematopoietic stem cells is determined, among others, by occurring between the cells of the donor and the bone marrow microenvironment. Słowa kluczowe: komórki macierzyste, hematopoetyczne komórki macierzyste, nisza szpikowa, transplantacja hematopoetycznych komórek macierzystych Key words: stem cells, hematopoietic stem cells, bone marrow niche, hematopoietic stem cells transplantation Wstęp Historia komórek macierzystych ma już ponad 100 lat. Pod koniec XIX wieku terminem komórki pnia (Stem Cells) określano komórki zaangażowane w produkcję komórek płciowych oraz komórkę prekursorową krwiotworzenia, zdolną do różnicowania się w kierunku erytrocytów i leukocytów [1]. W ostatnich latach definicja komórek macierzystych stała się bardziej rozbudowana. Badania prowadzone na embrionalnych i krwiotwórczych (hematopoetycznych) komórkach macierzystych dowodzą, że jest to niewyspecjalizowana grupa komórek charakteryzująca się zdolnością 241

www.diagnostykalaboratoryjna.eu do samoodnowy, proliferacji i różnicowania się w jeden lub wiele tkanek. Posiadają one zdolność do specjalizowania się w komórki typów komórek odpowiedzialnych za budowę naszego organizmu. Liczne doświadczenia wykazują, że komórki macierzyste są komórki macierzyste (MSC; Mesenchymal Stem Cells) izolowane pojedynczej warstwy zarodkowej. Należą do nich mezenchymalne źródłem uzyskiwania in vitro w pełni wykształconych komórek z różnych tkanek: szpiku kostnego, tkanki kostnej, tkanki tłuszczowej, krwi obwodowej, krwi pępowinowej i innych [7, 8]. Samoodna- potomnych, zdolnych do regeneracji uszkodzonych tkanek [2]. wialne komórki oligopotencjalne charakteryzują się zdolnością do Charakterystyka komórek macierzystych formowania się w dwie bądź więcej linii w obrębie specyficznych W klasyfikacji komórek macierzystych uwzględnia się dwa główne kryteria: zdolność do różnicowania, określaną również jako macierzyste, które różnicują się w mieloidalną i limfoidalną linię tkanek. Ich typowym przykładem są hematopoetyczne komórki wszechstronność w wykształcaniu komórek potomnych oraz ich komórkową [3, 6]. Ukierunkowane komórki macierzyste dające początek komórkom tylko jednego rodzaju nazywane są komórkami pochodzenie. Biorąc pod uwagę potencjał komórek macierzystych do różnicowania wyróżniono pięć grup [3, 4]: mięśni, które dają początek wyłącznie dojrzałym komórkom mię- unipotencjalnymi. Typowym przykładem są komórki macierzyste 1. komórki totipotencjalne (totipotent cells), śniowym oraz występujące w pęcherzykach płucnych pneumocyty 2. komórki pluripotencjalne (pluripotent cells), typu II, z których powstają pneumocyty typu I [3, 4]. 3. komórki multipotencjalne (multipotent cells), Uwzględniając pochodzenie komórek macierzystych, wyróżnia 4. komórki oligopotencjalne (oligopotent cells), się: embrionalne komórki macierzyste (ESCs; embryonic stem 5. komórki unipotencjalne (unipotent cells). cells), płodowe komórki macierzyste (FSCs; fetal stem cells), dorosłe komórki macierzyste (ASCs; adult stem cells) oraz indukowane Totipotencjalny charakter wykazują komórki począwszy od zapłodnionej zygoty aż do stadium dwóch pierwszych podziałów, pluripotencjalne komórki macierzyste (ips; induced pluripotent podczas których powstaje zarodek zbudowany z ośmiu blastomerów. Charakteryzują się one największą potencjalnością i różnicują W czasie rozwoju embrionalnego, podczas przekształcania się mo- stem cells) (ryc.1) [3, 9]. się do tkanek zarodkowych i pozazarodkowych, takich jak łożysko. Każda z komórek totipotencjalnych może rozwinąć się w cały trofoektoderma i wewnętrzna masa komórek (ICM; inner cell mass), ruli do stadium blastocysty wyodrębniają się dwie linie komórek: organizm [3]. Komórki wchodzące w skład węzła zarodkowego którą stanowią pochodzące z epiblastu blastocysty, embrionalne to pluripotencjalne komórki, które definiowane są jako komórki wielopotencjalne, posiadające potencjał do różnicowania się komórek o charakterze pluripotentnym. Wykazują możliwość nie- komórki macierzyste (ESCs). Stanowią one nieśmiertelną grupę w komórki trzech listków zarodkowych: ektodermy, endodermy skończonych podziałów symetrycznych. Są zdolne do nieograniczonej in vitro samoodnowy, a także do różnicowania się we i mezodermy. Od komórek totipotencjalnych, takich jak zygota, odróżnia je brak możliwości rozwinięcia się z nich pozazarodkowych wszystkie listki zarodkowe oraz typy komórek somatycznych. Za tkanek, takich jak łożysko, a w konsekwencji całego organizmu [5, utrzymanie ich w stanie pluripotencji, w trakcie zahamowanego 6]. Komórki multipotencjalne, można identyfikować w większości różnicowania, odpowiedzialny jest szereg czynników transkrypcyjnych, m.in. takich jak: Oct4, Nanog, Sox2. Ponadto ludzkie ESCs charakteryzują się ekspresją glikolipidowych antygenów SSEA3 i SSEA4 (Stage Specific Embryonic Antigen 3 i 4), które mogą służyć jako markery do ich identyfikacji. Pojedyncze komórki ESCs wykazują klonogenność, dając początek koloniom takich samych genetycznie komórek potomnych, posiadających właściwości matczyne. Pomyślne wyizolowanie mysich i ludzkich ESCs przyczyniło się do powszechnego uznania ich potencjału w medycynie regeneracyjnej oraz komórkowej terapii zastępczej. Obie linie komórkowe wykazywały w hodowlach prowadzonych z użyciem specyficznych czynników wzrostowych, zdolność formowania się w kardiomiocyty, neurony, adipocyty, komórki wysp trzustkowych, chondrocyty, osteocyty, a także hematopoetyczne komórki progenitorowe. Istnieją jednak liczne ograniczenia w ich wykorzystaniu. Gdy Rycina 1. Klasyfikacja komórek macierzystych uwzględniająca ich pochodzenie (źródło [9]). dwie 242

Diagn Lab 2014; 50(3): 241-248 charakterystyczne cechy, takie jak: nieograniczona zdolność do samoodnowy i pluripotencja czynią te komórki atrakcyjnymi dla terapii komórkowej, to jednocześnie te same właściwości odpowiadają za niekontrolowane różnicowanie się, co doprowadza do powstawania potworniaków. W guzach tych znaleźć można zróżnicowane komórki składające się ze wszystkich trzech warstw zarodkowych oraz niezróżnicowane pluripotencjalne komórki macierzyste. Występowanie komórek pnia w części nowotworów uważa się obecnie za niekorzystny czynnik rokowniczy [10, 11]. Płodowe komórki macierzyste (FSCs; fetal stem cells) są z kolei grupą komórek o multipotencjalnym charakterze. Wykazują te same właściwości, co dorosłe komórki macierzyste, ale są zlokalizowane w tkankach płodowych i zawiązkach zarodkowych, takich jak: owodnia, omocznia i pęcherzyk żółtkowy. Wykazują znacznie większą multipotencjalność w porównaniu do dorosłych komórek macierzystych. FSCs zostały podzielone na komórki: krwiotwórcze (znajdujące się we krwi, szpiku kostnym, wątrobie); mezenchymalne (znajdujące się we krwi, wątrobie, szpiku kostnym, płucach, nerkach i trzustce); śródbłonkowe (znajdujące się w szpiku kostnym i łożysku), nabłonkowe (znajdujące się w wątrobie i trzustce) oraz nerwowe (znajdujące się w mózgu i rdzeniu kręgowym). Oczywiście, jedynym źródłem pozyskiwania FSCs stosunkowo możliwym i bezpiecznym dla płodu, jest krew płodowa [12]. Wśród zróżnicowanych komórek w tkankach i narządach znajdują się niewyspecjalizowane pluripotencjalne, multipotencjalne oraz unipotencjalne komórki, określane mianem dorosłych komórek macierzystych, charakteryzujące się zdolnością do samoodnowy oraz różnicowania się w niektóre wyspecjalizowane rodzaje komórek w tkankach i organach. Historia badań nad tym typem komórek rozpoczęła się w latach 50-dziesiątych ubiegłego wieku. Naukowcy odkryli wówczas, że szpik kostny zawiera co najmniej dwie populacje komórek macierzystych. Jedna z nich to populacja, z której wykształciły się wszystkie rodzaje komórek krwi i została określona jako hematopoetyczne komórki macierzyste, druga to komórki macierzyste zrębu szpiku kostnego (Bone Marrow Stroma Stem Cells), określane również jako mezenchymalne komórki macierzyste. Zdolność różnicowania się dorosłych komórek macierzystych jest jednak zdecydowanie mniejsza w porównaniu z płodowymi i embrionalnymi komórkami macierzystymi. Ich podstawowe zadanie to utrzymywanie i naprawa tkanek, w których się znajdują. Naukowcy używają również określenia somatyczne komórki macierzyste, w którym wyraz somatyczny podkreśla pochodzenie komórek z dorosłego organizmu. Dorosłe komórki macierzyste zostały wykryte w wielu narządach i tkankach, takich jak: mózg, krew obwodowa, szpik kostny, mięśnie szkieletowe, zęby, skóra, naczynia krwionośne, serce, wątroba, nabłonek jajnika i jądra. Sugeruje się występowanie tych komórek w specjalnych obszarach, określanych mianem niszy komórek macierzystych (ang. stem cell niche). Dorosłe komórki macierzyste mogą pozostawać przez długi okres czasu w stanie spoczynku do momentu, w którym zostaną aktywowane w trakcie choroby bądź uszkodzenia tkanek, w których występują [4, 13]. Komórki somatyczne mogą zostać przeprogramowane poprzez przeniesienie ich materiału genetycznego do oocytów lub przez fuzję z embrionalnymi komórkami macierzystymi. Dzięki połączeniu czterech wybranych czynników transkrypcyjnych: Oct3/4, Sox2, Klf4/c-Myc, Nanog/ Lin28, naukowcy byli w stanie bezpośrednio w hodowli wygenerować z embrionalnych mysich lub dorosłych fibroblastów pluripotencjalne komórki, które nazwali indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi (ips; induced pluripotent stem cells) [14]. Ukoronowaniem doświadczeń związanych z reprogramowaniem komórek było opublikowanie w 2006 roku przez Yamanakę i Takahashi ego pracy, w której opisali metodę pozyskiwania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych u myszy, a w 2007 roku pozyskiwanie tych komórek z tkanki ludzkiej [15]. Wykazano również, że indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste w swojej morfologii, ekspresji genów, aktywności telomerazy, charakterze pluripotencji oraz występujących markerach powierzchniowych są bardzo zbliżone do embrionalnych komórek macierzystych oraz charakteryzują się podobną zdolnością do samoodnowy i plastycznością. Cechą, która istotnie odróżnia komórki ips od ESCs jest możliwość ich generowania bezpośrednio z autologicznych somatycznych komórek potencjalnego biorcy, co zapobiega niepomyślnej reakcji układu odpornościowego [16]. W 2012 roku Yamanaka wraz z Gurdon em otrzymali nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny za odkrycie możliwości przeprogramowania dorosłych komórek macierzystych do komórek pluripotencjalnych. Zapoczątkowało to nowy kierunek badań stawiających za cel opracowanie nowatorskich metod terapii komórkowych, a także rozbudziło nadzieje na wykorzystanie tych komórek w medycynie regeneracyjnej. Nowotworowe komórki macierzyste W ostatnich latach powszechną akceptację zyskała teoria występowania w masie nowotworu niewielkiej populacji komórek określanej mianem nowotworowych komórek macierzystych (CSCs; Cancer stem cells). Pierwsze doniesienia pojawiły się w 1994 roku, w trakcie badań nad ostrą białaczką szpikową (AML; Acute Myeloid Leukemia) u ludzi. Populacja komórek inicjująca ostrą białaczkę szpikową została zidentyfikowana poprzez przeszczepienie komórek pacjentów chorych na AML myszom z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID; Severe Combined Immunodeficiency). Komórki inicjujące białaczkę wykazywały zwiększoną ekspresję podstawowego markera powierzchniowego komórek macierzystych CD34 + /CD38 -. Podobnie jak nienowotworowe komórki macierzyste, CSCs posiadają zdolność do samoodnowy, namnażania się oraz różnicowania się do dojrzałych komórek. Wykazują także zdolność rozsiewu nowotworowego, co potwierdzono w eksperymentach na modelach zwierzęcych [2, 17]. W 2003 roku ludzkie nowotworowe komórki macierzyste zidentyfikowano w guzach litych, w tym w nowotworze piersi i mózgu. Od tego czasu występowanie CSCs stwierdzono również w takich nowotworach jak: nowotwór jajnika, wątroby, trzustki, prostaty, okrężnicy, płuc, jelita. Nowotworowe komórki macierzyste posiadają swoje specyficzne markery (tab. I). Ekspresja markerów powierzchniowych, takich jak: CD44, CD24, CD29, CD90, CD133, specyficzny antygen nabłonkowy (ESA) oraz dehydrogenaza mleczanowa 1 (LDH1), zostały wykorzystane do izolacji CSCs z różnych guzów nowotworowych [4, 17, 18]. 243

www.diagnostykalaboratoryjna.eu Rodzaj nowotworu Markery nowotworowych komórek macierzystych Ostra białaczka szpikowa CD34 +, CD38 - Nowotwór mózgu CD133 + Nowotwór płuc CD133 + Nowotwór jajnika CD133 +, CD44 +, CD117 + Nowotwór piersi CD24 -, CD44 +, Lin - Nowotwór trzustki CD44 +, CD24 +, ESA +, CD133 + Nowotwór okrężnicy CD133 +, CD44 +, ESA + Nowotwór wątroby CD133 +, CD90 + Nowotwór prostaty CD44 +, α2β1 +, CD133 + Nowotwór głowy i szyi CD44 + Tabela I. Wybrane nowotwory i markery nowotworowych komórek macierzystych (źródło[18]). CD antygen różnicowania komórkowego; ESA specyficzny antygen nabłonkowy Hematopoetyczne (krwiotwórcze) komórki macierzyste. Badania nad wyizolowaniem hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCs; Hematopoietic Stem Cells) zostały zainicjowane w 1961 roku przez dwóch badaczy Till a i McCulloch a. Naukowcy opracowali technikę kolonizacji śledziony, która polegała na wstrzyknięciu myszom, napromienionym dawką promieniowania niszczącą ich układ krwiotwórczy, zawiesiny szpiku zdrowego dawcy. Zaobserwowali, że przeszczepione komórki doprowadziły do wykształcenia się wielokierunkowych kolonii komórek szpiku w śledzionie myszy, określanych jako jednostki tworzące kolonie śledzionowe tzw. CFU-S (Colony Forming Unit-Spleen). Liczba tych kolonii była proporcjonalna do ilości przeszczepionych komórek. Doświadczenie to potwierdziło wielokierunkowy potencjał pojedynczych komórek szpiku. Ich ocena stała się podstawą do izolacji hematopoetycznych komórek macierzystych oraz ich dalszej charakterystyki [19]. Krwiotwórcze komórki macierzyste to nieliczna populacja komórek, stanowiąca mniej niż 0,01 % wszystkich komórek szpiku kostnego. Są to dojrzałe multipotencjalne somatyczne komórki macierzyste pochodzenia mezenchymalnego, które charakteryzują się zdolnością do podziałów, samoodnowy oraz różnicowania się do komórek progenitorowych układu krwiotwórczego, zarówno linii mieloblastycznej, limfoblastycznej, erytroblastycznej, jak i megakarioblastycznej. Wymienione powyżej właściwości HSCs umożliwiają skuteczną hematopoezę przez całe życie człowieka, a także przywrócenie prawidłowego krwiotworzenia po transplantacji krwiotwórczych komórek macierzystych [20]. Wśród hematopoetycznych komórek macierzystych wyróżnić można komórki długookresowe (LT HSCs; long-term hematopoietic stem cells), które są samoodnawialne oraz wykazują zdolność odtwarzania wszystkich komórek układu krwiotwórczego w ciągu kilku miesięcy, jak również komórki krótkookresowe (ST-HSCs; short-term hematopoietic stem cells), które w przeciwieństwie do komórek długookresowych charakteryzują się zdolnością do regeneracji układu krwiotwórczego w krótkim czasie oraz brakiem długookresowej samoodnowy [11]. Hematopoetyczne komórki macierzyste nie posiadają charakterystycznych cech cytomorfologicznych, wielkością i stosunkiem jądrowo-cytoplazmatycznym przypominają limfocyty. Przełomowym etapem w badaniach nad hematopoetycznymi komórkami macierzystymi było zastosowanie w diagnostyce hematologicznej cytometrii przepływowej. Metoda ta pozwoliła na pomiar pojedynczych komórek zawieszonych w roztworze oraz na wyizolowanie ich małej liczby spośród dużej heterogennej populacji. W cytometrii przepływowej stosowane są przeciwciała monoklonalne skoniugowane z fluorochromami w celu jakościowej i ilościowej oceny komórkowych determinant antygenowych, zarówno powierzchniowych, cytoplazmatycznych, jak i jądrowych. Przeciwciała monoklonalne, skierowane przeciwko określonym antygenom leukocytarnym, sklasyfikowano w odpowiednie grupy i przypisano im kod CD (Cluster of Differentiation) [21]. Na ludzkiej niedojrzałej linii blastów odkryto antygen powierzchniowy CD34 +, który w 1984 roku został opisany przez Curta Civina jako marker powierzchniowy krwiotwórczych komórek macierzystych. Sugeruje się, że uczestniczy on w regulacji przylegania HSCs do komórek podścieliska szpiku kostnego. Udowodniono, że ekspresja CD34 na komórkach szpiku kostnego zmniejsza się wraz z postępującym różnicowaniem komórek hematopoetycznych. W szpiku kostnym zdrowych, dorosłych osób ekspresję markera CD34 stwierdza się tylko u 1% do 3% komórek, we krwi obwodowej u 0,01-0,06% komórek krążących, natomiast w przypadku krwi pępowinowej obserwowana jest ona w odsetku mniejszym niż u 0,4% komórek [22, 23]. Hematopoetyczne komórki macierzyste można zidentyfikować również poprzez wykazanie braku na ich powierzchni i w cytoplazmie ekspresji antygenów charakterystycznych dla poszczególnych komórek ukierunkowanych linii mieloidalnej, erytroidalnej, megakariocytarnej oraz limfoidalnej [23, 24, 25]. Rola niszy szpikowej w transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych. W transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych niezwykle istotne są interakcje zachodzące pomiędzy HSCs a niszą szpikową biorcy. Przeszczepione komórki macierzyste muszą przejść z krążenia krwi obwodowej do szpiku kostnego, a następnie zasiedlić się (homing) oraz zakotwiczyć się (lodgement) w jego niszy. Zasiedlanie nisz szpikowych jest procesem wieloetapowym ale stosunkowo szybkim. Przeszczepione komórki HSCs przedostają się do szpiku kostnego w ciągu kilku godzin. Proces zasiedlania jest zależny od interakcji zachodzących pomiędzy macierzą zewnątrzkomórkową szpiku kostnego a komórkami jego zrębu [26]. Pierwszy etap określany jest jako rolling i oznacza adhezję HSCs do komórek śródbłonka naczyń szpiku kostnego biorcy. W proces ten zaangażowana jest L-selektyna, której ekspresja obecna jest na dojrzałych leukocytach, a także wczesnych komórkach krwiotwórczych [27]. Następną fazą jest migracja komórek przez endotelium. W procesie tym główną rolę odgrywa oś SDF-1 (SDF 1; Stromal Derived Factor-1) CXCR4 oraz beta-1 i beta-2 integryny. Proteina CXCR4, nazywana także antygenem CD184 (Chemokine CXC motif receptor 4) należy do rodziny receptorów związanych z białkiem G (GPCR; G Protein-coupled Receptor) oraz stanowi receptor dla SDF-1. Chemokina CXCR4 pełni ważną rolę nie tylko podczas homingu, ale również w trakcie mobilizowania komórek pnia do krwiobiegu. Jej ekspresja występuje głównie 244

Diagn Lab 2014; 50(3): 241-248 na hematopoetycznych komórkach macierzystych, jak również dojrzałych komórkach krwi: monocytach, płytkach krwi, limfocytach [29, 30]. W momencie połączenia chemokiny SDF-1 z receptorem CXCR4, GTP wchodzące w skład podjednostki α białka G podlega wymianie na GDP. Efektem jest rozpad białka G na dwie podjednostki: α oraz βγ, które odpowiadają za zapoczątkowanie szlaku działania fosfolipazy C/PKC, a także kinazy fosfatydyloinozytolowej-3 Rycina 2. Oddziaływanie hematopoetycznej komórki macierzystej z komórkami zrębu szpiku kostnego. Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSCs) oraz komórki zrębu szpiku kostnego wykazują szeroki zakres ekspresji molekuł (PI3K)/AKT, modulującej zarówno adhezyjnych (CAMs). Ich interakcje z odpowiednimi ligandami są odpowiedzialne za prawidłowy proces zasiedlania właściwości adhezyjne, jak i migracyjne [27, 28]. Aktywacja powyż- i zakotwiczania HSCs podczas transplantacji (źródło [31]). szych szlaków wykazuje również działanie antyapoptotyczne. CaSR (CaSR; Calcium Sensing Receptor). Ich brak w niszy szpikowej Dzięki nim możliwa jest proliferacja, którą promują białka należące biorcy uniemożliwia zakotwiczenie HSCs do powierzchni okostnej wewnętrznej, znajdującej się w niszy endostealnej (osteobla- do rodziny kinaz tyrozynowych Src oraz migracja komórek zachodząca pod wpływem gradientu SDF-1. Najważniejszą rolę w migracji krwiotwórczych komórek macierzystych odgrywa jednak hialuronowego (CD44) obecny na powierzchni HSCs. Jego brak stycznej) [30]. Niezwykle ważny jest również receptor dla kwasu proces zahamowania przesyłania sygnału przez receptor CXCR4. wywołuje liczne anomalie w rozmieszczeniu transplantowanych Prowadząc badania na myszach z delecją genu SDF-1 bądź genu krwiotwórczych komórek macierzystych w niszy osteoblastycznej kodującego CXCR4, naukowcy wykazali, że myszy pozbawione [28]. Oprócz cytokin i molekuł adhezyjnych na zasiedlanie szpiku powyższych genów charakteryzują się znacznie obniżoną ilością kostnego przez HSCs wpływa także składowa dopełniacza Cq1, hematopoetycznych komórek macierzystych w szpiku kostnym, odpowiedzialna za zwiększanie odpowiedzi chemotaktycznej co skutkuje wieloma letalnymi defektami rozwojowymi u tych HSCs na SDF-1 [27]. Okazuje się, że los przeszczepionych komórek zwierząt [28, 29]. W procesie migracji biorą udział zarówno β 1 zdeterminowany jest przez złożone, dwukierunkowe interakcje integryny oznaczane jako CD29, jak i β 2 integryny określane jako z komponentami niszy szpikowej [26]. CD18. Do pierwszego rodzaju integryn należą różne cząsteczki VLA (Very Late Antigen) odpowiedzialne m.in. za przyleganie HSCs Źródła hematopoetycznych komórek macierzystych. do składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Najważniejszą Obecnie wyróżnia się trzy źródła hematopoetycznych komórek z nich jest molekuła VLA-5 (α 5 β 1 ), która została oznaczona jako macierzystych, z których możliwe jest pobieranie komórek do antygen CD49e/CD29. VLA-5 odpowiedzialna jest za adhezję transplantacji. Są nimi: szpik kostny, krew obwodowa, oraz krew hematopoetycznych komórek macierzystych do fibronektyny, pępowinowa (tab. II) [31,32, 33]. Pomimo, iż szpik kostny był pierwszym źródłem komórek macierzystych stosowanym w transplan- wchodzącej w skład macierzy zewnątrzkomórkowej. Krwiotwórcze komórki macierzyste CD34 + charakteryzuje również obecność tacji, to wraz z zastosowaniem przeszczepień autologicznych przewagę zyskały transplantacje z wykorzystaniem krwiotwórczych na ich powierzchni integrynowych receptorów VLA-4 (α 4 β 1 ), które zostały opisane jako antygeny CD49d. Ich ligandami są molekuły komórek macierzystych krwi obwodowej. Obecnie najczęściej VCAM-1 (Vascular Adhesion Molecule-1) obecne na komórkach wybieranym źródłem komórek macierzystych do przeszczepień budujących zrąb szpiku kostnego. Interakcje zachodzące pomiędzy VLA-4 a VCAM-1 należą do jednych z głównych reakcji, któ- obwodowa. Wiele randomizowanych badań dotyczących trans- allogenicznych od dawców niespokrewnionych jest również krew re kierują procesem zasiedlania szpiku przez hematopoetyczne plantacji przeprowadzanych między rodzeństwem o identycznych komórki macierzyste. Udowodniono, że brak ekspresji CD49d/ antygenach w układzie HLA, wykazuje, że krwiotwórcze komórki CD29 na HSCs uniemożliwia ich migrację ze szpiku kostnego do macierzyste krwi obwodowej charakteryzuje większa zdolność obwodu oraz gromadzenie się ich we krwi obwodowej biorcy. wszczepienia, w porównaniu z komórkami pochodzącymi ze Na powierzchni hematopoetycznych komórek macierzystych odkryto również obecność molekuły LFA-1 (Lymphocyte Function wystąpienia ostrej bądź przewlekłej choroby przeszczep prze- szpiku kostnego, ale ich podanie zdecydowanie zwiększa ryzyko Antigen-1), oznaczanej jako CD11a/CD18, wchodzącej w skład ciwko gospodarzowi. Wykazano, że hematopoetyczne komórki β 2 integryn. Cząsteczka LFA-1 bierze udział w adhezji dojrzałych macierzyste pobrane z krwi obwodowej znacznie szybciej migrują leukocytów do ICAM-1 (Intercellular adhesion molecule-1) występującej na komórkach śródbłonka (ryc. 2) [27,30]. O sukcesie stymi pochodzącymi bezpośrednio ze szpiku kostnego. Powyższa do szpiku w porównaniu z krwiotwórczymi komórkami macierzy- każdej transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych decyduje proces zakotwiczenia komórek w niszy szpikowej. krofragmentów błonowych pochodzenia płytkowego określanych właściwość wynika m.in. z faktu obecności na ich powierzchni mi- W procesie tym biorą udział m.in. receptory dla jonów wapnia jako PMP (platelet microparticles) Są one kulistymi fragmentami 245

www.diagnostykalaboratoryjna.eu Cechy Szpik kostny Krew obwodowa Krew pępowinowa Średnia zawartość komórek CD34 + w materiale przeznaczonym do przeszczepienia 2,8 x 10 6 /kg mc. 7 x 10 6 /kg mc. (po mobilizacji) 1,7 x 10 5 /kg mc. Ryzyko dla dawcy Obecne Obecne Brak Czas poszukiwania dawcy (miesiące) 3-6 3-6 1 Czynniki ograniczające wszczepienie Dopasowanie układu Dopasowanie układu Zbyt mała liczba komórek zgodności tkankowej zgodności tkankowej w jednej jednostce krwi Minimalne dopasowanie w układzie zgodności tkankowej 9/10 9/10 4/6 Ryzyko wystąpienia GVHD* Ostre GVHD Przewlekłe GVHD Wyższe Niskie Niskie Niskie Możliwość infuzji limfocytów dawcy Obecna Obecna Brak Możliwość immunoterapii Obecna Obecna Brak Tabela II Źródła hematopoetycznych komórek macierzystych i ich charakterystyka (źródło [34]) *GVHD choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi błony komórkowej i zawierają specyficzne markery powierzchniowe, wśród których należy wymienić antygeny różnicowania komórkowego, takie jak: CD41, CD61, CD62 oraz receptory CXCR4 i PAR-1, które umożliwiają ich szybszą migrację [9, 34, 35]. Mobilizacja hematopoetycznych komórek macierzystych. Wyizolowanie wystarczającej ilości hematopoetycznych komórek macierzystych z krwi obwodowej poprzedzone jest procedurą nazywaną mobilizacją HSCs. Istnieje wiele czynników wpływających na skuteczność procesu mobilizacji, m.in.: wiek chorego, płeć, rodzaj zastosowanego do mobilizacji czynnika wzrostu oraz wielkość jego dawki. Chociaż niewielka ilość krwiotwórczych komórek macierzystych krąży we krwi obwodowej przez cały czas, to ich mobilizacja ze szpiku kostnego jest niezbędna, ponieważ liczba HSCs zawartych we krwi obwodowej jest niewystarczająca do transplantacji. Fizjologicznie ilość komórek macierzystych obecnych wśród wszystkich komórek jednojądrzastych we krwi jest około 50-100 razy mniejsza w porównaniu z liczbą HSCs w szpiku kostnym [36]. Kolekcja hematopoetycznych komórek macierzystych rozpoczyna się po zakończonej czwartej bądź piątej dobie podawania czynnika wzrostu G-CSF (Granulocyte Colony- -Stimulating Factor). O rozpoczęciu pobierania krwiotwórczych komórek macierzystych z krwi obwodowej decyduje ilość komórek CD34 +. Minimalna wymagana liczba to 20 komórek CD34 + w 1μl krwi obwodowej [34, 37]. Krwiotwórcze komórki macierzyste krwi obwodowej (PBSC; Peripheral Blood Stem Cells) pobierane są podczas procesu aferezy komórkowej zwanej leukaferezą. Dawca obarczony jest minimalnym ryzykiem, bez konieczności hospitalizacji. Zabieg wykonywany jest w centrach krwiodawstwa bądź w specjalnych szpitalnych punktach. Ze względu na różną objętość opracowywanej krwi dawcy, możemy wyróżnić dwa rodzaje leukaferezy. Pierwszy to leukafereza standardowa, która trwa około 3 godzin i pozwala na opracowanie około 9-12 l krwi dawcy. Liczba zebranych HSCs jest proporcjonalna do ilości krwiotwórczych komórek we krwi obwodowej, oszacowanej przed przeprowadzeniem zabiegu aferezy. Drugi rodzaj leukaferezy tzw. wysokoobjętościowej stosowany jest w sytuacji wymagającej ograniczania liczby procedur, którymi objęty jest dawca HSCs. Za pomocą tego typu aferezy opracowuje się zwykle jednorazowo około 16-25 l krwi, a wielkość kolekcji krwiotwórczych komórek macierzystych może znacznie przekraczać spodziewaną oszacowaną ilość HSCs, wyliczoną na podstawie oznaczenia komórek CD34 + we krwi przed procesem aferezy [28, 33, 34]. Cytometria przepływowa pozwala na identyfikację i określenie liczby komórek HSCs CD34 + oraz ocenę ich żywotności. Preparat krwiotwórczych komórek macierzystych musi zawierać określoną minimalną ilość komórek CD34 + /kg m.c. biorcy. Obecnie zalecaną minimalną dawką do przeszczepu autologicznego jest ilość 2 x 10 6 komórek CD34 + /kg m.c. biorcy, a do przeszczepu allogenicznego 4-5 x 10 6 komórek CD34 + /kg m.c. biorcy. Niezbędnym parametrem kontroli jakości CD34 + jest również ocena potencjalnej kontaminacji drobnoustrojami oraz obecności czynników chorobotwórczych. W przypadku zastosowania preparatów komórek macierzystych do przeszczepień allogenicznych, obowiązkiem jest oznaczenie liczby limfocytów T CD3 +, ponieważ są one odpowiedzialne za reakcję przeszczep przeciwko gospodarzowi, a do przeszczepień autologicznych ocena zanieczyszczenia komórkami nowotworowymi. Dalsza preparatyka polega na dodaniu autologicznego osocza oraz ponownym zawieszeniu komórek CD34 + w sterylnym nośniku i umieszczeniu w worku do mrożenia. Przechowywanie pobranych komórek w stanie płynnym możliwe jest tylko przez 48 godzin od pobrania. Środkiem krioochronnym stosowanym do zamrażania pobranych HSCs jest dimetylosulfotlenek (DSMO). Komórki zamrażane są w temperaturze -100 C, co umożliwia ich długoterminowe przechowywanie w ciekłym azocie do -196 C [28, 37]. Transplantacja hematopoetycznych komórek macierzystych Transplantacja hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT; Hematopoietic Stem Cells Transplantation) jest powszechnie uznaną metodą leczenia wielu wrodzonych oraz nabytych schorzeń, szczególnie dotyczących układu krwiotwórczego. Europejskie Towarzystwo Przeszczepiania Krwi i Szpiku (EBMT; European Group for Blood and Marrow Transplantation) definiuje HSCT, jako każdą procedurę dożylnego przetoczenia krwiotwórczych komórek macierzystych, właściwie przygotowanemu biorcy, niezależnie od rodzaju ich dawcy oraz źródła ich pozyskania. HSCT 246

Diagn Lab 2014; 50(3): 241-248 definiowana jest również jako metoda leczenia mająca na celu całkowitą bądź częściową wymianę lub odbudowę systemu krwiotwórczego biorcy [38, 39]. Ośrodki transplantacyjne w Europie, w których wykonywane są przeszczepienia hematopoetycznych komórek macierzystych zarejestrowane są w Europejskim Towarzystwie Przeszczepiania Krwi i Szpiku, które od 1990 roku systematycznie odnotowuje ich aktywność transplantacyjną. W ośrodkach europejskich przeprowadzanych jest blisko 48% wszystkich transplantacji wykonywanych na całym świecie [34, 40]. W 2010 roku po raz pierwszy odnotowano 30 tysięcy wykonanych przeszczepień, a w 2012 roku ilość ta wzrosła o 6% w porównaniu z rokiem 2011. Zgodnie z raportem EBMT z 2013 roku, w 2012 roku wykonano 37 818 tys. transplantacji u 33 678 tys. pacjentów, w tym liczba pacjentów poddanych allogenicznnej transplantacji HSCs wynosiła 14 165 tys. (42%) a u 19 513 tys. (58%) chorych wykonano przeszczepienie autologiczne [41]. Najczęstszymi wskazaniami do transplantacji HSCs były: zespoły limfoproliferacyjne (chłoniaki nieziarnicze, chłoniak Hodgkina, szpiczak plazmocytowy 19 336 tys. przeszczepień, co stanowiło 57% wszystkich transplantacji (w tym 11 % stanowiły przeszczepienia allogeniczne w tej grupie chorych), białaczki 10 641 tys. przeszczepień, co stanowiło 32% wszystkich transplantacji (w tej grupie chorych odsetek przeszczepień allogenicznych wynosił 95%), niewielki odsetek HSCT dotyczył schorzeń nienowotworowych oraz guzów litych (ryc. 3). Podsumowanie Nieustanny postęp jaki dokonuje się w badaniach nad komórkami macierzystymi umożliwa coraz lepsze zrozumienie procesu rozwoju i regeneracji tkanek. W leczeniu wielu schorzeń nowotworowych, a szczególnie w hematoonkologii terapia z wykorzystaniem hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCs) to już powszechna i dostępna metoda leczenia, dającą szansę na całkowite wyleczenie z białaczki czy chłoniaka. Wciąż odkrywane są nowe molekuły adhezyjne, szlaki przekazywania sygnałów komórkowych jak również identyfikowane są komórki, które stanowią elementy budulcowe niszy szpikowej. Wykazują one istotny wpływ na proliferację, samoodnowę, a także utrzymanie w stanie spoczynku HSCs. Dzięki interakcjom molekuł adhezyjnych z odpowiednimi ligandami przeszczepione krwiotwórcze komórki macierzyste dawcy są zdolne zasiedlić niszę szpikową biorcy. Wraz z wprowadzaniem do transplantologii autologicznego przeszczepiania hematopoetycznych komórek macierzystych, przewagę nad szpikiem kostnym zyskuje krew obwodowa, z której pozyskiwane są krwiotwórcze komórki macierzyste mobilizowane ze szpiku, po wcześniejszej stymulacji farmakologicznej. Mimo niepowodzeń obserwowanych po zabiegach transplantacji HSCs, Rycina 3. Ilość wykonanych przeszczepień hematopoetycznych komórek macierzystych w 2012 roku wg raportu EBMT z 2013 r (źródło [42]). takich jak wznowa choroby, toksyczność narządowa oraz zakażenia, przeszczepienie krwiotwórczych komórek macierzystych w chorobach hematoonkologicznych stanowi najbardziej optymalną opcję terapeutyczną, która stwarza możliwość całkowitego wyleczenia. Piśmiennictwo: 1. Ramalho-Santos M, Willenbring H. On the origin of the term stem cell. Cell Stem Cell 2007; 1: 35 38. 2. Estrov Z. Stem Cells and Somatic Cells: Reprogramming and Plasticity. Clin Lymphoma Myeloma 2009; 9: 319 328. 3. Kolios G, Moodley Y. Introduction to Stem Cells and Regenerative Medicine. Respiration 2013; 85: 3 10. 4. Olszewska-Słonina DM, Styczyński J, Drewa TA, i wsp. Komórki niezróżnicowane źródła i plastyczność. Adv Clin Exp Med 2006; 15: 497 503. 5. De Miguel MP, Fuentes-Julián S, Alcaina Y. Pluripotent Stem Cells: Origin, Maintenance and Induction. Stem Cell Rev 2010; 6: 633 649. 6. Banaś A. Komórki macierzyste perspektywy i zagrożenia. Przegląd Medyczny Uniwersytetu Rzeszowskiego 2010; 2: 117 127. 7. Augello A, Kurth TB, De Bari C. Mesenchymal Stem Cells: a Perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater 2010; 20: 121 133. 8. Gala K, Burdzińska A, Pączek L. Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego a starzenie. Postępy Biologii Komórki 2010; 37: 89 106. 9. Watt FM, Driskell RR. The therapeutic potential of stem cells. Phil Trans R Soc B 2010; 365: 155 163. 10. Glotzbach JP, Ko SH, Gurtner GC, et al. Regenerative Medicine. In: Townsend CM, Beauchamp RD, Evers BM, et al. Sabiston Textbook of Surgery. The Biological Basis of Modern Surgical Practice.19th Edition. Wyd Elsevier, Philadelphia 2012: 178 185. 11. Sikora MA, Olszewski WL. Komórki macierzyste biologia i zastosowanie terapeutyczne. Postepy Hig Med Dosw 2004; 58: 202 208. 12. Lodi D, Iannitti T, Palmieri B. Stem cells in clinical practice: applications and warnings. J Exp Clin Cancer Res 2011; 30: 1 20. 13. Rekomendacje National Institutes of Health (NIH), 2009, www.stemcells.nih. gov/staticresources/info/basics/scprimer2009.pdf 14. Yulin X, Lizhen L, Lifei Z, i wsp. Efficient Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Folia Biol (Praha) 2012; 58: 221 230. 15. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell 2006; 126: 663 676. 247

www.diagnostykalaboratoryjna.eu 16. Kurpisz M. Próby przedkliniczne i kliniczne zastosowania komórek macierzystych do regeneracji mięśnia sercowego. Postępy Biologii Komórki 2010; 37: 209 223. 17. Yu Z, Pestell TG, Lisanti MP, i wsp. Cancer stem cells. Int J Biochem Cell Biol 2012; 44: 2144 2151. 18. Wieczorek K, Niewiarowska J. Nowotworowe komórki macierzyste. Postepy Hig Med Dosw 2012; 66: 629 636. 19. Boisset JC, Robin C. On the origin of hematopoietic stem cells: Progress and controversy. Stem Cell Res 2012; 8: 1 13. 20. Chotinantakul K, Leeanansaksiri W. Hematopoietic stem cell development, niches and signaling pathways. Bone Marrow Res 2012; 12: 1 16. 21. Rekomendacje Bio-Rad Laboratories Inc, 2013, www.static.abdserotec.com/ uploads/flow-cytometry.pdf 22. Park KS, Pang B, Park SJ, et al. Identification and Functional Characterization of Ion Channels in CD34 + Hematopoietic Stem Cells from Human Peripheral Blood. Mol Cells 2011; 32: 181 188. 23. Reszczyńska I, Zieliński M, Niedźwiecki M, i wsp. Wstępna ocena ekspresji antygenu CD34 na komórkach macierzystych krwi obwodowej w przebiegu leczenia ostrej białaczki limfoblastycznej u dzieci. Borgis Nowa pediatria 2011; 3: 55 59. 24. Żydowicz G, Bogdan M. Immunofenotyp komórek w prawidłowej hematopoezie. Postępy Biologii Komórki 2008; 35: 35 44. 25. Król MA, Urbanowska E, Feliksbrot ME, i wsp. Fenotypowa charakterystyka komórek CD34 + uzyskiwanych z krwi pępowinowej i z produktu leukaferezy od zdrowych dawców po mobilizacji czynnikiem wzrostu. Adv Clin Exp Med 2005; 14: 883 890. 26. Kopeć-Szlęzak J. Krwiotwórcza komórka macierzysta w niszy szpikowej. J Transf Med 2011; 4: 129 135. 27. Gieryng A, Bogunia-Kubik K. Znaczenie interakcji między SDF-1 i CXCR4 w hematopoezie i mobilizacji macierzystych komórek hematopoetycznych do krwi obwodowej. Postepy Hig Med Dosw 2007; 61: 369 383. 28. Haas R, Kronenwett R. Biologiczne właściwości i charakterystyka komórek macierzystych. In: Kałwak K. Hematopoetyczne komórki macierzyste pytania i odpowiedzi. Wyd MedPharm Polska, Wrocław, 2009: 13 29. 29. Gębura K, Bogunia-Kubik K. Kliniczne znaczenie receptora chemokinowego CXCR4. Postepy Hig Med Dosw 2012; 66: 252 266. 30. Yin T, Li L. The stem cell niches in bone. J Clin Invest 2006; 116: 1195 1201. 31. Sugiyama T, Nagasawa T. Bone marrow niches for hematopoietic stem cells and immune cells. Inflamm Allergy Drug Targets 2012; 11: 201 206. 32. Demiriz SI, Tekgunduz E, Altuntas F. What Is the Most Appropriate Source for Hematopoietic StemCell Transplantation? Peripheral Stem Cell/BoneMarrow/ Cord Blood. Bone Marrow Res 2012; 2: 1 5. 33. Antoniewicz-Papis J, Pogłód R, Lachert E. Terapia komórkowa ze szczególnym uwzględnieniem mobilizacji i pobierania komórek macierzystych do przeszczepienia. J Transf Med 2010; 3: 99 105. 34. Styczyński J. Bezpieczeństwo dawców krwiotwórczych komórek macierzystych. Hematologia 2012; 3: 58 65. 35. Lam BS, Adams GB. Hematopoietic stem cell lodgment in the adult bone marrow stem cell niche. Int J Lab Hematol 2010; 32: 551 558. 36. Basak GW, Jędrzejczak WW. Mobilizacja krwiotwórczych komórek macierzystych wczoraj i dziś. Hematologia 2012; 3: 9 24. 37. Rosiek A, Antoniewicz-Papis J, Lachert E i wsp. Analiza retrospektywna zabiegów separacji komórek macierzystych krwi obwodowej wykonanych przy zastosowaniu separatorów komórkowych w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii. J Transf Med 2011; 4: 23 31. 38. Wachowiak J. Przeszczepianie allogenicznych macierzystych komórek krwiotwórczych. In: Witt M, Szczepański T, Dawidowska M. Hematologia molekularna Patogeneza, patomechanizmy i metody badawcze. Wyd Ośrodek Wydawnictw Naukowych, Poznań, 2009: 139 149. 39. Hołowiecki J. Wskazania do przeszczepienia komórek krwiotwórczych. Medycyna Praktyczna 2008; 118: 658 663. 40. Passweg JR, Baldomero H, Peters C, et al. Hematopoietic SCT in Europe: data and trends in 2012 with special consideration of pediatric transplantation. Bone Marrow Transplant 2014; 744 750. 41. Rekomendacje Europen Society for Blood and Marrow Transplantation, 2013, www.ebmt.org/contents/resources/library/annualreport/documents/tri- PA_Memoria_EBMT_color.pdf Adres do korespondencji: dr n. med. Iwona Urbanowicz Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu Zakład Hematologii Laboratoryjnej, Katedra Analityki Medycznej 50-556 Wrocław, ul. Borowska 211 A Tel. +48 71 7840630/ +48 71 7840628 e-mail: iwonaurbanowicz@vp.pl Zaakceptowano do publikacji: 2.07.2014 248