IV. Streptococcus, Enterococcus ćwiczenia praktyczne Ćwiczenie 1. Ocena wzrostu szczepów paciorkowców na: a. agarze z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej (AK) typ hemolizy morfologia kolonii... gatunek drobnoustroju:. typ hemolizy morfologia kolonii... gatunek drobnoustroju:.. b. podłożu D- coccosel z eskuliną morfologia kolonii......
c. podłożach płynnych 1. bulion cukrowy 2. podłoże bulionowe z 6,5% NaCl 3. podłoże bulionowe o ph=9,6 4. podłoże bulionowe z 40% żółcią Streptococcus pneumoniae 1 2 3 4 Streptococcus pyogenes 1 2 3 4 Enterococcus faecalis 1 2 3 4 Wnioski.....
Ćwiczenie 2. Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama Opis wykonania ćwiczenia przy temacie V. Budowa komórki bakteryjnej i metody barwienia preparat bawiony metodą Grama Opis preparatu: Ćwiczenie 3. Oznaczanie cech biochemicznych paciorkowców a. wykonanie próby na katalazę Opis wykonania ćwiczenia przy temacie VII. Fizjologia bakterii Szczep badany obserwowane wyniki... Wnioski..... b. test wrażliwości na bacytracynę Test różnicuje paciorkowce β-hemolizujące. Szczególną wrażliwość na bacytracynę wykazują paciorkowce grupy A (Streptococcus pyogenes) Na podłoże Muellera-Hintona z dodatkiem 5% krwi baraniej, posiać jałową wymazówką zawiesinę hodowli płynnej badanego szczepu (0,5 w skali Mc Farlanda). Następnie na powierzchnię podłoża nałożyć krążek bibułowy nasączony 0,04u bacytracyny. Całość inkubować w temp. pokojowej 30 minut a następnie w 35 0 przez 18-24 godziny. Jako wynik wrażliwości uznaje się strefę zahamowania wzrostu wokół krążka z bacytracyną 15 mm.
bacytracyna 0,04u Wnioski..... c. test wrażliwości na optochinę Optochina w bardzo małych stężeniach (mniej niż 5µg/ml) w sposób wybiórczy ma zdolność hamowania wzrostu Streptococcus pneumoniae, co różnicuje te dwoinki od innych paciorkowców α-hemolizujących. Na podłoże Muellera-Hintona z dodatkiem 5% krwi baraniej, posiać jałową wymazówką zawiesinę hodowli płynnej badanego szczepu (0,5 w skali McFarlanda). Następnie na powierzchnię podłoża nałożyć krążek bibułowy nasączony optochiną o stężeniu 5µg. Całość inkubować w temp. pokojowej 30 minut a następnie w 35 0 przez 18-24 godziny. Jako wynik dodatni uznaje się pojawienie się strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z optochiną bez względu na wielkość strefy. Przy strefie 14mm, wynik potwierdzić innymi metodami. optochina 5µg
Wnioski..... d. wykrywanie zdolności do redukcji TTC Zdolność redukowania chlorku 2,3,5-trifenylotetrazoliowego umożliwia zróżnicowanie szczepów Enterococcus spp. Próbę tę wykonuje się na podłożu stałym lub płynnym z dodatkiem 0,01% TTC. Badane bakterie posiać na podłoże z dodatkiem 0,01% TTC i inkubować przez 24-48 godzin. Bakterie mające zdolność do redukcji TTC rosną na podłożu stałym w postaci kolonii ciemnoczerwonych, a na podłożu płynnym tworzą strąt zabarwiony na ten kolor....... Wnioski...... e. test CAMP Czynnik CAMP jest białkiem enzymatycznym działającym, jako ko-cytolizyna na częściowo zhemolizowane przez β-hemolizynę gronkowcową krwinki baranie. Wynikiem tego działania jest tzw. synergistyczna hemoliza. 1. Na powierzchnię płytki agarowej z 5% krwią baranią posiać liniowo (przez środek szalki) szczep Staphylococcus aureus ATCC 25923 wytwarzający hemolizę β.
2. Prostopadle do linii posiewu, w bliskiej odległości (ale nie dotykając) posiać badany szczep. 3. Płytkę inkubować przez 18-24 godzin w temperaturze 35 0 C. 4. Wytwarzanie czynnika CAMP objawia się pojawieniem strefy wzmożonej hemolizy w postaci przejaśnienia, często o kształcie jasnego grota strzały, w miejscu gdzie linia posiewu szczepu nachodzi na strefę hemolizy β gronkowca. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Szczep badany Wnioski..... f. Test PYR Test służy do różnicowania rodzajów Enterococcus i Streptococcus. W teście tym wykrywa się obecność enzymu L-pyrolidonyloaryloamidazy. Enzym ten odszczepia β- naftylamid z substratu, którym jest L-pyrolidonylo-β-naftyloamid. Uwolniony związek z barwnikiem diazowym tworzy kompleks o barwie różowoczerwonej. 1. Nasycony substratem krążek bibułowy zwilżyć należy wodą destylowaną i nanieść badaną hodowlę. 2. Po 2 minutach dodać odczynnik diazowy i po ok. 60 sekundach odczytać wynik. 3. Stwierdzenie zmiany zabarwienia na kolor czerwony świadczy o dodatnim wyniku testu. Wnioski....
g. Identyfikacja grup serologicznych paciorkowców β-hemolizujących Badanie można wykonać przy użyciu testu Pastorex STREP (BIORAD) 1. Przygotowanie enzymu do ekstrakcji Do liofilizatu dodać 10 ml wody destylowanej i wymieszać do rozpuszczenia. Roztwór jest stabilny przez 4 miesiące w temp. + 2 do + 8 o C. 2. Wykonanie testu 0,3 mln enzymu do ekstrakcji umieścić w probówce i zawiesić w nim 5 do 10 kolonii świeżej hodowli paciorkowca β-hemolizującego. Inkubować 15 45 minut w temp. pokojowej, lub 10 30 minut w temp. 37 o C Wymieszać wszystkie surowice lateksowe (A,B,C,D,F,G) i nanieść po 1 kropli każdej z nich na oddzielne pola załączonej do testu płytki. Używając jałowej pipety dodać po 1 kropli ekstraktu enzymatycznego badanego szczepu do wszystkich rozpipetowanych surowic na karcie. Wymieszać przy pomocy pałeczek (do każdej kropli oddzielna). Obracając ruchem kolistym płytkę odczytać wynik: reakcja pozytywna przejawia się widoczną aglutynacją występującą w czasie do 1 min. Badanie przeprowadzać zawsze wykonując kontrolę dodatnią. Wnioski.....
Ćwiczenie 4. Interpretacja wyniku badania lekowrażliwości szczepów: szczep. a. Dokonaj pomiaru stref zahamowania wzrostu wokół krążków. Antybiotyk symbol/dawka na krążku Strefa zahamowania wzrostu w mm Interpretacja wyniku b. Uzupełnij tabelkę o informacje dotyczące szczepów: Antybiogram podstawowy Streptococcus spp. Enterococcus spp.
Antybiogram rozszerzony Oznaczane mechanizmy oporności Ćwiczenie 5. Uzupełnij tabele o informacje dotyczące paciorkowców Tab.I. Gatunki paciorkowców najczęściej izolowane od człowieka I grupa gatunki II III IV V VI VII
Tab. II. Grupy serologiczne paciorkowców o znaczeniu klinicznym (podział wg Lancefield) Grupa serologiczna wg Lancefield A gatunek B C D F G Tab. III. Podział paciorkowców w zależności o typu wywoływanej hemolizy Gatunek S. pyogenes, S. agalactiae, S. equisimilis, S. canis, S. equi, S. bovis, S.equinus S. mitis, S. oralis, S. sanguis, S. pneumoniae S. mutans, S. sobrinus S. salivarius S. anginosus, S. intermedius, S. constelatus Enterococcus faecalis, E. faecium Typ hemolizy