Tok badania bakteriologicznego. Klasyczne metody stosowane w diagnostyce bakteriologicznej (identyfikacja bakterii i oznaczanie lekowrażliwości).

Transkrypt

1 Tok badania bakteriologicznego. Klasyczne metody stosowane w diagnostyce bakteriologicznej (identyfikacja bakterii i oznaczanie lekowrażliwości). Mgr Kornelia Jasińska

2 Stwierdzenie obecności drobnoustrojów i ich identyfikacja w badanym materiale pobranym od zakażonego człowieka, zwierzęcia lub też w próbce pobranej ze środowiska stanowi cel badania mikrobiologicznego. Diagnostyka mikrobiologiczna to zespół postępowań przedlaboratoryjnych i laboratoryjnych, mających na celu identyfikację drobnoustrojów oraz oznaczenie ich lekowrażliwości.

3 Procedury przedlaboratoryjne obejmują: Wyznaczenie rodzaju materiału podlegającego analizie, Sposób pobrania materiału klinicznego, Warunki przechowywania i transportu. Pobieranie materiału: Badany materiał powinien być pobrany z miejsca, gdzie toczy się proces chorobowy, Ilość materiału powinna być wystarczająca do przeprowadzenia analizy mikrobiologicznej, Próbka powinna być dostarczona do laboratorium w jak najszybszym czasie, Materiał powinno się dobrze oznakować i dołączyć kompletną dokumentację, Próbka materiału klinicznego powinna zostać pobrana przed zastosowaniem leczenia, a w przypadku gdy jest to niemożliwe należy podać informację o lekach podawanych pacjentowi.

4 Postępowania laboratoryjne Badanie mikroskopowe preparatu bezpośredniego, Posiew materiału na odpowiednie podłoże, celem otrzymania czystych hodowli, Obserwacje morfologiczne makro i mikroskopowe otrzymanych hodowli, Badanie właściwości fizjologicznych czystych hodowli, Badania immunologiczne, Określenie wrażliwości na substancje przeciwdrobnoustrojowe, w tym leki.

5 Tok izolacji i identyfikacji nieznanego drobnoustroju: 1. Badanie mikroskopowe Preparat wykonany bezpośrednio z materiału klinicznego pobranego od pacjenta (PREPARAT BEZPOŚREDNI) Przykład: plwocina- w przypadku gruźlicy, wymaz z pochwy- ocena stopnia czystości płyn mózgowo-rdzeniowy Preparat wykonany z wyhodowanych na podłożach sztucznych kolonii bakterii

6 PREPARAT BEZPOŚRENI WYKONUJEMY OBOWIĄZKOWO Z NASTĘPUJĄCYCH MATERIAŁÓW KLINICZNYCH skóra i tkanka podskórna wydzielina z kanału szyjki macicy, pochwy, cewki moczowej płyn mózgowo-rdzeniowy plwocina, BAL, aspiraty z oskrzeli i płuc wymazy z oka płyn z opłucnej, otrzewnej

7 PREPARAT BEZPOŚREDNI NIE WYKONUJEMY Z NASTĘPUJĄCYCH MATERIAŁÓW KLINICZNYCH wymaz z gardła WYJĄTKI: podejrzenie zakażenia błonicą anginy Plauta-Vincenta podejrzenie zakażenia grzybiczego kał WYJĄTKI: kał od noworodków podejrzenie zakażenia kampylobakteriozą podejrzenie zakażenia cholerą

8 2. Posiew materiału na odpowiednie podłoże, celem otrzymania pojedynczych kolonii potrzebnych do uzyskania czystych hodowli: Posiew redukcyjny na odpowiednie podłoże stałe. Seryjne rozcieńczenie badanego materiału. 3. Obserwacja makro i mikroskopowa morfologii otrzymanych hodowli. Morfologia kolonii na płytce. Preparaty mikroskopowe (rodzaje barwienia).

9 4. Badanie właściwości fizjologicznych czystych hodowli: Próby hodowlane, Próby biochemiczne. Metody biochemiczne polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji lub rozkładu określonych związków chemicznych. Narzędziem najnowszej generacji wykorzystywanym w mikrobiologii klinicznej do identyfikacji mikroorganizmów jest spektrometria mas, tzw. MALDI-TOF MS (ang. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry). System dokonuje klasyfikacji i identyfikacji mikroorganizmów przez automatyczną analizę ich profilu białkowego i porównanie ze spektrofotometrycznymi wzorami referencyjnymi zgromadzonymi w bazie danych.

10 Przykłady testów w toku diagnostycznym: Test na katalazę. Katalaza jest enzymem, który rozkłada toksyczny dla komórki H 2 O 2 do H 2 O i tlenu. Na szkiełko podstawowe należy nanieść kroplę 3% roztworu H 2 O 2 i zawiesić w niej pobraną kolonię; pęcherzyki gazu wskazują na obecność katalazy.

11 Test na koagulazę. Oznaczenie wykonuję się metodą probówkową. Osocze królicze miesza się w probówce z hodowlą i inkubuje w temp.37 C przez 1-4godzin. Jako wynik dodatni przyjmuje się powstanie wyraźnego skrzepu plazmy. Wykonuje się też oznaczanie koagulazy związanej tzw. CF-clumping factor, tj. ścinania fibrynogenu bez udziału aktywatora koagulazy. Test przeprowadza się metodą szkiełkową poprzez zmieszanie drobnoustrojów zawieszonych w kropli jałowej wody z kroplą króliczego osocza. Wynik odczytuje się po 30 sekundach. Wystąpienie aglutynacji to wynik dodatni.

12 5. Badania immunologiczne Metody niehodowlane Metody bezpośrednie (do wykrywania antygenów) Metody pośrednie (do wykrywania przeciwciał) Odczyny immunologiczne: precypitacji aglutynacji immunofluorescencji immunoenzymatyczne (ELISA)

13 AGLUTYNACJA LATEKSOWA Mikrocząsteczki lateksu opłaszczone są znanymi przeciwciałami, które wiążą się ze specyficznymi antygenami. Powstaje widoczna gołym okiem AGLUTYNACJA. brak aglutynacji wynik negatywny aglutynacja wynik dodatni

14 Paciorkowce Grupy serologiczne wg schematu Lancefield A - S. pyogenes, nieliczne szczepy S. anginosus i S. constelatus B - S. agalactiae, C - S. dysgalactiae subsp. equisimilis, S. equi subsp. equi, S. equi subsp. zooepidemicus D - S. bovis (=equinus), Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus avium F - niektóre paciorkowce grupy S. millieri G - m.in. zwierzęce paciorkowce ropotwórcze (S. canis)

15 Klasyfikacja i nazewnictwo bakterii Salmonella Rodzaj Salmonella podzielony jest na dwa gatunki: 1. Salmonella enterica, w obrębie którego wyróżniono sześć podgatunków (subspecies): S. enterica subsp. enterica (serowary Typhimurium, London, Paratyphi B, Typhi, Enteritidis, Hadar, Mbandaka, Newport) S. enterica subsp. salamae S. enterica subsp. arizonae S. enterica subsp. diarizonae S. enterica subsp. houtenae S. enterica subsp. indica 2. Salmonella bongori. Podstawą do podziału jest zróżnicowanie antygenów somatycznych (antygen O) i rzęskowych (antygen H).

16 Źródło: _01.pdf

17 Metoda immunoenzymatyczna- ELISA Oparta na znakowaniu, czyli związaniu antygenu lub przeciwciała z enzymem. Powstający kompleks antygen-przeciwciało-enzym jest wykrywany po dodaniu bezbarwnego substratu, który trawiony enzymem daje barwny produkt. Reakcja barwna jest odczytywana wizualnie lub w spektrofotometrze. Przykłady: - Wykrywanie antygenów HBV - Oznaczanie przeciwciał swoistych przeciwko HIV, HBV, HCV, diagnostyka kleszczowego zapalenia mózgu - Oznaczanie miana przeciwciał swoistych przeciwko Legionella pneumophila, Borrelia burgdorferii

18 METODY MOLEKULARNE Poszukiwanie kwasów nukleinowych w materiale klinicznym lub hodowli drobnoustrojów. metoda łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) hybrydyzacja kwasów nukleinowych przy użyciu sond molekularnych

19 6. Określenie wrażliwości na substancje przeciwdrobnoustrojowe, w tym leki. Działanie antybiotyków polega na powodowaniu śmierci komórki bakteryjnej (działanie bakteriobójcze) lub wpływaniu w taki sposób na jej metabolizm, aby ograniczyć jej możliwości rozmnażania się (działanie bakteriostatyczne). Mechanizm działania antybiotyków: Blokowanie syntezy DNA Blokowanie polimerazy RNA Blokowanie biosyntezy białka Blokowanie biosyntezy ściany komórkowej Uszkodzenie błony protoplazmatycznej Konkurencyjne wnikanie w łańcuch metaboliczny

20 Mechanizmy oporności bakterii na antybiotyki 1. Błona zewnętrzna bakterii Gram-ujemnych 2. Enzymatyczna inaktywacja antybiotyków 3. Aktywne wypompowywanie antybiotyków z cytoplazmy- EFLUKS 4. Modyfikacja celów działania antybiotyków 5. Regulacja ekspresji genów oporności 6. Transfer genów oporności Mutacje istniejących genów Nabycie nowych genów (w obrębie jednego gatunku) Międzygatunkowy i międzyrodzajowy transfer genów oporności

21 1 B-laktamy 2 Aminoglikozydy 3 Tetracykliny 4 Makrolidy/ketolidy 5 Linkozamidy 6 Streptograminy 7 Oksazolidynony 8 Glikopeptydy 9 Chloramfenikol 10 Polimiksyny 11 Rifamycyny 12 Sulfonamidy 13 Nitroimidazole 14 Nitrofurany 15 Chinolony 16 Kwas fusydowy 17 Leki przeciwgrzybicze 18 Leki przeciwwirusowe Spektrum działania antybiotyków: Wąskie (ograniczone do jednego typu drobnoustrojów np. do ziarenkowców): wankomycyna Szerokie (antybiotyk działa zarówno na bakterie Gram(+) i Gram(-)): cefalosporyny, karbapenemy

22 Oznaczanie lekowrażliwości: 1. Metoda półilościowa- ATB, 2. Metoda dyfuzyjno-krążkowa- nasączone antybiotykiem krążki bibuły, 3. Metoda ilościowa- E-testy, 4. Metoda ilościowa- systemy automatyczne

23 E- test- metoda służąca do ustalenia najmniejszego stężenia antybiotyku (MIC) hamującego wzrost drobnoustroju. Wykorzystuje się paski nasycone antybiotykiem w gradiencie stężeń. ATB- pasek pozwala na określenie wrażliwości badanych bakterii na antybiotyki w półpłynnym podłożu. Metoda dyfuzyjno-krążkowa- najczęściej używana metoda, oparta jest na dyfuzji antybiotyku zawartego w krążku do podłoża. Antybiotyk dyfunduje promieniście, tworząc gradient stężeń.

24 Szczepy alarmowe W trakcie pobytu pacjenta w szpitalu może dojść do rozwinięcia zakażenia, które jest bezpośrednim wynikiem hospitalizacji. Może się ono ujawnić po opuszczeniu szpitala oraz dotyczyć personelu medycznego bądź osób odwiedzających. Czynnikami etiologicznymi zakażeń szpitalnych mogą być zarówno bakterie, jak i wirusy, a także grzyby i pasożyty.

25 Lista czynników alarmowych stanowiąca załącznik nr 1 do Rozporządzenia Ministra Zdrowia z dn. 23 grudnia 2011r. w sprawie listy czynników alarmowych, rejestrów zakażeń szpitalnych i czynników alarmowych oraz raportów o bieżącej sytuacji epidemiologicznej szpitala (Dz. U nr 294 poz. 1741) 1. Gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus) oporny na metycylinę (MRSA) lub glikopeptydy (VISA lub VRSA) lub oksazolidynony. 2. Enterokoki (Enterococcus spp.) oporne na glikopeptydy (VRE) lub oksazolidynony. 3. Pałeczki Gram-ujemne Enterobacteriaceae spp. wytwarzające beta-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (np. ESBL,AMPc,KPC) lub oporne na karbapenemy lub inne dwie grupy leków lub polimyksyny. 4. Pałeczka ropy błękitnej (Pseudomonas aeruginosa) oporna na karbapenemy lub inne dwie grupy leków lub polimyksyny. 5. Pałeczki niefermentujące z rodzaju Acinetobacter spp. oporne na karbapenemy lub inne dwie grupy leków lub polimyksyny. 6. Szczepy chorobotwórcze laseczki beztlenowej Clostridium difficile oraz wytwarzane przez nie toksyny A i B.

26 7. Laseczka beztlenowa Clostridium perfringens. 8. Dwoinka zapalenie płuc (Streptococcus pneumoniae) oporna na cefalosporyny III generacji lub penicylinę. 9. Grzyby Candida oporne na flukonazol lub inne leki z grupy azoli lub kandyn. 10. Grzyby Aspergillus. 11. Rotawirus (rotavirus). 12. Norowirus (norovirus). 13. Wirus syncytialny (RSV) 14. Wirus zapalenia wątroby typu B 15. Wirus zapalenia wątroby typu C. 16. Wirus nabytego niedoboru odporności u ludzi (HIV). 17. Biologiczne czynniki chorobotwórcze izolowane z krwi lub płynu mózgowo-rdzeniowego, odpowiedzialne za uogólnione lub inwazyjne zakażenia.