Kompleks powierzchniowy Kardiomiocyt - aktyna - miozyna Kompleks powierzchniowy Konglomerat wzajemnie powiązanych ze sobą systemów regulacyjnych zakotwiczonych w błonie komórkowej, obejmujących receptory macierzy zewnątrzkomórkowej (np. integryny), i czynników wzrostowych, białka adhezji międzykomórkowej (np. kadheryny) oraz determinanty bezpośredniej międzykomórkowej wymiany informacji (np. koneksyny) 1
Mutacje genów powodujących nadaktywność ścieŝek zaleŝnych od czynników wzrostowych powodują zanik zaleŝności wzrostu od przyczepienia komórki do podłoŝa Mutacje genu kodującego białko Ras powodują zanik wraŝliwości komórek na fizyczny kontakt z mikrośrodowiskiem Collaborative cancerous signalling Comoglio et al., 2003 2
Wpływ aktywności receptorów czynników wzrostowych na ruchliwość komórek HGF i EGF regulują ruchliwość komórek poprzez wpływ na status funkcjonalny kompleksów cytoszkieletarnych związanych z integrynami Comoglio et al., 2003 3
Płytki przylegania (ang. adherens junctions; łac. zonula adherens) Kadheryny Moreno, 2003 4
Interakcje między szlakami sygnałowymi zaleŝnymi od czynników humoralnych a białkami adhezji międzykomórkowej z rodziny kadheryn Comoglio, 2003 5
Nisza jako mikrośrodowisko komórek pozostające z nimi w stanie ciągłej wymiany informacji P1 1 1 2 Mediatory wymiany informacji między komórką a niszą : - czynniki humoralne (np. czynniki wzrostowe i cytokiny oddziaływania krynne S P2 2 - adhezja komórkowa (ścieŝki sygnałowe zaleŝne od integryn, kadheryn etc. Wnts Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: 167-174 P3 3 3 - wymiana bodźców mechanicznych (za pośrednictwem białek adhezji międzykomórkowej i receptorów ECM) -bezpośrednia wymiana metabolitów (złącza szczelinowe)
Patologiczna nadaktywnośćścieŝek zaleŝnych od HGF i EGF powoduje wzrost ruchliwości komórek Collaborative cancerous signalling HGF, EGF i TNF-alfa wpływają na inwazyjność komórek nowotworowych poprzez wpływ na status funkcjonalny kompleksów cytoszkieletarnych związanych z integrynami Comoglio et al., 2003 7
Przejście epitelialno-mezenchymalne Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) Radisky, D. C. J Cell Sci 2005;118:4325-4326 1. EMT regulowane jest przez szlaki sygnałowe zaleŝne od β-kateniny, oraz białek z rodziny Snail i Slug a regulowane przez szereg cytokin i czynników wzrostowych np. HGF, TGF, EGF, FGF, Wnt itd. W jego wyniku obserwowane są: 2. Zmiany morfologiczne m. in. polaryzacja komórki góra-dół zastępowana jest przez polaryzację przódtył 3. Związana z tym indukcja ruchliwości komórek oraz: 4. Zmiany ekspresji genów kodujących białka adhezji komórkowej, m.in. z rodziny integryn i kadheryn Radisky, D. C. J Cell Sci 2005;118:4325-4326 Komórki o morfologii mezenchymalnej cechuje zwiększony poziom ekspresji N-kadheryny i integryny αvβ3 A549 Epi Int Mes
Promocja i progresja nowotworu Primary tumour Lymphocyte Platelets TSC Secondary tumour Clonal expansion, proliferation, heterogeneity, angiogenesis Tissue invasion Intravasation Capillary arrest Extravasation EMT: epithelial-mesenchymal transition (przejście epitelialno mezenchymalne) - zmiany morfologiczne - aktywacja białek z rodziny Snail - zmiany ekspresji genów (E-cadherin -> N-cadherin) Oddziaływania z komórkami ukladu odpornościowego -limfocyty -płytki krwi -Monocyty/makrofagi Angiogenesis Metastasis
Immune system in carcinogenesis (-) Increased risk of cancer after: a) Immunosuppression b) Chronic inflammation (+) Presence of monocytes in solid tumours: a) monocytes migrating to tumours undergo phenotypic transition into tumour-infiltrating macrophages (TIMs) b) TIMs may constitute up to 80% of the tumour mass c) TIMs (M2) represent a tumour-promoting phenotype i.e. secrete factors promoting cancer expansion Monocytes in cancer progression: - Monocytes induce the invasion of mammary and hepatoma cancer cells by means of EGF (Wyckoff et al., 2004; Lin et al. 2002; Condeelis and Pollard, 2006) - Microglia-derived TGF-β is an inducer of glioma cell invasion (Śliwa et al., 2007; Wesołowska et al.. 2008)
Pętle parakrynne między makrofagami a nowotworem Condeelis&Pollard, 2006
Komórki HPC-4 (rak trzustki) HPC-4 cells - Linia ustalona w 1993 (Siedlar et al., 1994 - fenotyp epithelioidalny - linia inwazyjna in vivo - komórki HPC- indukują sekrecję cytokin prozapalnych przez monocyty/makrofagi, w tym IL-12 i TNF-α (Zembala et al., 1993) Jak monocyty wpływają na ruchliwość ko mórek HPC-4 w ko-hodowli?
Metodyka N Non-polarised N N N Polarised P P P P Morfometria Videomikroskopia Mikroskopia fluorescencyjna
Adhezja i ruchliwość monocytów w kohodowli z komórkami HPC-4 50 Monocyte adhesiveness Control Mo + HPC-4 % of adhered cells 40 30 20 actin vinculin 10 0 Control Mo + HPC Mo +cond. - indukcja adhezji - polaryzacja przód-tył monocytów (PBM)
Adhezja i ruchliwość monocytów w obecności medium warunkowanego 50 Monocyte adhesiveness Control Mo + CM % of adhered cells 40 30 20 actin vinculin 10 0 Control Mo + HPC Mo +cond. Monocyte-macrophage transition Czyz, J, Siedlar M.,(unpublished)
Zachowanie komórek HPC-4 w kohodowli z monocytami krwi obwodowej Control Co-culture
Wpływ monocytów/macrofagów na ruchliwość komórek HPC-4 70 60 TLCD VCM 70 60 Control TLCD [um/h] 50 40 30 20 10 50 40 30 20 10 VCM [um/h] 0 Control HPC + Mo 0 HPC-4 + Mo Baran, B., Bechyne, I., Siedlar, M., Szpak, K., Mytar, B., Sroka, J., Laczna, E., Madeja, Z., Zembala, M., and Czyz, J. Eur. J. Cell Biol. 88 (2009) 743-752.
Effect of monocytes/macrophages on the morphology of HPC-4 cells Control HPC-4 + Mo - induction of motility - islet dissipation - rear-front polarisation } EMT??? Baran, B., Bechyne, I., Siedlar, M., Szpak, K., Mytar, B., Sroka, J., Laczna, E., Madeja, Z., Zembala, M., and Czyz, J. Eur. J. Cell Biol. 88 (2009) 743-752.
Mediatory wymiany informacji między komórkami HPC-4 i makrofagami Monocyty/macrofagi aktywowane przez komórki HPC-4 wydzielają TNF-alpha (Szaflarska, 2004) TNF [pg/ml] 2000 1500 1000 500 MO MO+LPS MO+neo 0 W zaleŝności od kontekstu komórkowego TNF-alfa moŝe hamować lub promować rozwój nowotworu
Mediatory wymiany informacji między komórkami HPC-4 i makrofagami Inhibitory TNF-inhibitors obniŝają reaktywność komórek HPC-4 na obecność monocytów/macrofagów
Egzogenny TNF indukuje ruchliwość komórek HPC-4 Baran, B., Bechyne, I., Siedlar, M., Szpak, K., Mytar, B., Sroka, J., Laczna, E., Madeja, Z., Zembala, M., and Czyz, J. Eur. J. Cell Biol. 88 (2009) 743-752.
Egzogenny TNF indukuje ruchliwość komórek HPC-4 Control TNF
Morfologia i architektura cytoszkieletu komórek HPC-4 w obecności TNF HPC-4 + Mo HPC-4 + TNF Baran, B., Bechyne, I., Siedlar, M., Szpak, K., Mytar, B., Sroka, J., Laczna, E., Madeja, Z., Zembala, M., and Czyz, J. Eur. J. Cell Biol. 88 (2009) 743-752.
Funkcja czynników transkrypcyjnych z rodziny Snail
EMT? Control 10 u/ml TNF 100 u/ml TNF 1000 u/ml TNF TNF-alpha induces expression of Snail-1
Wnioski Monocyty wspomagają proces progresji nowotworu trzustki TNF jest zaangaŝowany w pętle parakrynne regulujące te współzaleŝność TNF indukuje EMT w komórkach nowotworowych
Model inwazji nowotworowej GUZ PIERWOTNY TSC Ekspansja klonalna, wzrost, dywersyfikacja, angiogeneza Właściwości komórek nowotworowych Limfocyt Płytki krwi Inwazja tkanki i intrawazacja Oddziaływania z komórkami limfatycznymi 1. Brak zaleŝności wzrostu od lokalnej adhezji i funkcji czynników wzrostowych 2. Zanik wraŝliwości na czynniki hamujące proliferację komórek 3. Zanik zdolności do apoptozy GUZ WTÓRNY Adhezja do śródbłonka i błony podstawnej 4. WzmoŜona ruchliwość Ekstrawazacja (Hanahan&Weinberg, 2000) Angiogeneza Błona podstawna Macierz zewnątrzkomórkowa Proliferacja 27
Przejście epitelialno-mezenchymalne Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) Radisky, D. C. J Cell Sci 2005;118:4325-4326
Strategie migracji komórek Cancer Science Volume 96, Issue 7, pages 379-386, 29 JUL 2005 DOI: 10.1111/j.1349-7006.2005.00062.x http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1349-7006.2005.00062.x/full#f2
Sztywność Cross et al. 2008
AFM Ostrze noŝa Mikroskop AFM Wnętrze głowicy
Principle of AFM 1 min Cytospin 12 h Culture Komórki uzyskano 2 metodami; 1 min Cytospin, 12 h Culture Cross et al. 2008
AFM L Dioda lasera Wiązka lasera Ostrze noŝa Preparat
ORIENTACJA WIĄZEK MIKROFILAMENTÓW DECYDUJE O KIERUNKU SIŁ MECHANICZNYCH GENEROWANYCH PRZEZ KOMÓRKI
Regulacja ruchu komórek nowotworowych poprzez reorganizację aktyny Cancer Science Volume 96, Issue 7, pages 379-386, 29 JUL 2005 DOI: 10.1111/j.1349-7006.2005.00062.x http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1349-7006.2005.00062.x/full#f1
Wizualizacja sił mechanicznych wywieranych na podłoŝe przez komórki PodłoŜa elastyczne 36
Tensegrity Integryny i kadheryny łącząc domeny cytoszkieletarne sąsiadujących komórek za pośrednictwem adhezji międzykomórkowej Tensegralność Alberts et al., 2005 pośredniczą w tworzeniu wielokomórkowych kontinuów mechanochemicznych 37
Adhezja komórkowa za pośrednictwem kompleksów białkowych związanych z cytoszkieletem aktyna winkulina białka strukturalne białka funkcjonalne Kontakty zogniskowane to wyspecjalizowane kompleksy białkowe uczestniczące w stabilizacji adhezji komórkowej ale równieŝ w generowaniu i detekcji bodźców mechanicznych
Mutacje genów powodujących nadaktywność ścieŝek zaleŝnych od czynników wzrostowych powodują zanik zaleŝności wzrostu od przyczepienia komórki do podłoŝa CHF B16 Collaborative cancerous signalling Comoglio et al., 2003 39
Tensegralny model architektury cytoszkieletu komorek HSF B16
Pętle sprzęŝenia zwrotnego między sztywnością podłoŝa a aktywnością mechaniczną cytoszkieletu komórek nowotworowych Elastyczność sub-populacji komórek DU-145 M. Sarna, J. Czyz, in prep.. Jaalouk et al., 2011
Nisza jako mikrośrodowisko komórek pozostające z nimi w stanie ciągłej wymiany informacji P1 1 1 2 Mediatory wymiany informacji między komórką a niszą : - czynniki humoralne (np. czynniki wzrostowe i cytokiny oddziaływania krynne S P2 2 - adhezja komórkowa (ścieŝki sygnałowe zaleŝne od integryn, kadheryn etc. Wnts Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: 167-174 P3 3 3 - wymiana bodźców mechanicznych (za pośrednictwem białek adhezji międzykomórkowej i receptorów ECM) -bezpośrednia wymiana metabolitów (złącza szczelinowe)
Oddziaływania autobaryczne i parabaryczne Banes et al,, 1995
Biomechaniczna kontrola morfogenezy Nisza 3 5 Prog. Biophys. Mol. Biol. (2008) 97: 163 44