Spis treści 1. WSTĘP... 1 2. CEL I ZAKRES PRACY... 2 3. OMÓWIENIE WYNIKÓW BADAŃ... 3 3.1. Synteza i charakterystyka termowrażliwych polimerów... 3 3.1.1. Pochodne poliglicydolu... 3 3.1.2. (Ko)polimery 2-podstawionych-2-oksazolin... 4 Krystaliczność poli(2-izopropylo-2-oksazoliny) w roztworze... 4 3.2. Synteza i charakterystyka termowrażliwych warstw polimerowych na podłożach... 6 3.2.1. Synteza i charakterystyka termowrażliwych warstw poliglicydolu... 6 3.2.2. Synteza i charakterystyka termowrażliwych warstw (ko)poli(2-podstawionych-2- oksazolin)... 8 3.3. Oddziaływanie polimerów i warstw polimerowych z fibroblastami... 11 3.3.1. Cytotoksyczność termowrażliwych polimerów... 11 3.3.2. Adhezja, proliferacja i odczepianie fibroblastów od termowrażliwych warstw polimerowych... 12 Adhezja i proliferacja fibroblastów... 12 Warstwy poli(glicydolu-co-etylokarbaminianu glicydylu)... 12 Warstwy poli[(2-podstawionych-2-oksazolin)]... 13 Odczepianie fibroblastów... 14 Warstwy poli(glicydolu-co-etylokarbaminianu glicydylu)... 14 Warstwy poli[(2-etylo-2-oksazoliny)-co-(2-nonylo-2-oksazoliny)]... 14 Warstwy poli(2-izopropylo-2-oksazoliny)... 15 Narzędzia do wspomagania odczepiania i przenoszenia arkuszy fibroblastów... 16 4. PODSUMOWANIE I WNIOSKI... 18 5. LITERATURA... 20 6. DOROBEK NAUKOWY DOKTORANTA... 21
1. WSTĘP W ostatnich latach duże zainteresowanie wzbudzają polimery wrażliwe na bodźce środowiska, tak zwane polimery inteligentne. Wśród nich szczególnie interesującą grupą są polimery termoczułe, których właściwościami fizykochemicznymi można odwracalnie sterować wykorzystując zmiany temperatury. Polimery mogą wykazywać termoczułość, gdy są rozpuszczone w odpowiednim rozpuszczalniku (roztwory), gdy zostały usieciowane (żele) lub naszczepione na podłożu stałym (warstwy). Termowrażliwy polimer naniesiony na podłoże stałe tworzy warstwę, której właściwości fizykochemiczne można kontrolować wykorzystując zmiany temperatury otoczenia. Takie warstwy umieszczone w wodzie pęcznieją i wykazują właściwości hydrofilowe. Zmiana konformacji łańcuchów na podłożu, spowodowana podwyższeniem temperatury, prowadzi do odwracalnej dehydratacji łańcuchów i ich kurczenia się, przez co warstwa polimerowa zmniejsza swoją zwilżalność i przylega do podłoża. Szczególne zainteresowanie wzbudzają warstwy polimerowe przyczepione do podłoża za pomocą wiązań kowalencyjnych. Mogą być one otrzymane na drodze polimeryzacji monomeru inicjowanej grupą funkcyjną, która znajduje się na podłożu (tak zwana metoda szczepienia od ) lub poprzez immobilizację na podłożu wcześniej zsyntetyzowanych łańcuchów polimerowych (metoda szczepienia do ). W zależności od metody, możliwe jest otrzymanie warstw o grubości od nano- do mikrometrów, o określonej gęstości szczepienia czy też pożądanej temperaturze przejścia fazowego. Termoczułe, biokompatybilne polimery w postaci warstw są coraz szerzej badane pod kątem ich wykorzystania w medycynie i biotechnologii. Od 1990 roku termowrażliwe warstwy polimerowe na podłożach stałych badane są jako rusztowania dla hodowli komórkowych i bezinwazyjnego odczepiania komórek w postaci arkusza. Udowodniono, że stosowanie arkuszy komórek może przyspieszać proces gojenia uszkodzonej tkanki, w porównaniu do stosowanej standardowo zawiesiny komórek. Hodowla komórkowa na termoczułych warstwach polimerowych prowadzona jest w temperaturze powyżej przejścia fazowego polimeru, kiedy podłoże jest hydrofobowe. Komórki ulegają wtedy adhezji, dzielą się i proliferują tworząc integralną monowarstwę spojoną przez tak zwaną macierz zewnątrzkomórkową, wypełniającą przestrzeń między nimi. Obniżenie temperatury poniżej temperatury przejścia powinno, dzięki zmianie właściwości warstwy na hydrofilową, doprowadzić do odczepienia arkusza. Do otrzymania termowrażliwych powierzchni, stosowanych do hodowli i uwalniania komórek, wykorzystywany jest przede wszystkim poli(n-izopropyloakrylamid) (PNIPAM) i jego pochodne. Warstwy PNIPAM uzyskuje się głównie poprzez radiacyjne szczepienie tego polimeru na powierzchniach modyfikowanego polistyrenu, rzadziej na szkle. Otrzymywanie arkuszy komórkowych, możliwe dzięki termoczułym podłożom, otwiera drogę do hodowli tkanek koniecznej w terapii narządów. Obecnie prowadzone są badania zmierzające do stworzenia narzędzi, które wspomagałyby odczepianie komórek i umożliwiały transport arkusza w miejsce docelowe. 1
2. CEL I ZAKRES PRACY Celem badań jest opracowanie nowych, osadzonych na stałym podłożu termoczułych warstw polimerowych do hodowli komórek skóry i bezinwazyjnego odczepiania tych komórek w postaci arkusza. Do otrzymania warstw wybrano termoczułe (ko)polimery glicydolu i oksazolin ze względu na ich nietoksyczność względem komórek skóry, łatwość sterowania właściwościami i łatwość immobilizacji do podłoża. Założono, że warstwy tych polimerów na podłożu stałym zostaną otrzymane techniką szczepienia do, która pozwala na otrzymanie warstwy o dobrze zdefiniowanych właściwościach. Istotne dla potrzeb pracy jest sprawdzenie, czy poprzez kontrolę warunków podczas syntezy polimerów i ich szczepienia do podłoża można wpływać na właściwości warstw, zwłaszcza na termowrażliwość. Konieczne jest zbadanie, które właściwości warstwy i w jaki sposób wpływają korzystnie na adhezję i odczepianie fibroblastów w postaci arkusza, a także które właściwości i dlaczego nie sprzyjają hodowli. Taka analiza pozwoli na weryfikację otrzymanych warstw pod kątem ich przydatności w medycynie w stosunku do powierzchni stosowanych dotychczas. Osiągnięcie tych celów wymaga: syntezy, charakterystyki i zbadania cytotoksyczności wrażliwych na temperaturę polimerów opartych na glicydolu i 2-podstawionych-2-oksazolinach immobilizacji termowrażliwych polimerów na funkcjonalizowanym podłożu stałym (szklanym i krzemowym) charakterystyki warstwy polimerowej (badanie morfologii, powinowactwa do wody, grubości, reakcji na zmiany temperatury) hodowli fibroblastów na otrzymanych powierzchniach oraz próby ich odczepienia w postaci arkusza w obniżonej temperaturze określenia wpływu właściwości podłoża na adhezję, proliferację i odczepianie komórek skóry 2
3. OMÓWIENIE WYNIKÓW BADAŃ 3.1. Synteza i charakterystyka termowrażliwych polimerów Do otrzymania termowrażliwych warstw polimerowych na podłożach stałych użyto (ko)polimerów glicydolu i oksazolin, ze względu na ich biokompatybilność, łatwość sterowania właściwościami i łatwość immobilizacji do podłoża. 3.1.1. Pochodne poliglicydolu Liniowy poliglicydol otrzymano na drodze polimeryzacji koordynacyjnej eteru 2,3- epoksypropylo-(1-etoksy)etylowego, inicjowanej częściowo zhydrolizowanym dietylocynkiem (ZnEt 2 /H 2 O, 1:0.8). Grupy etoksyetylowe, zabezpieczające grupy hydroksylowe podczas polimeryzacji glicydolu, zostały usunięte przez hydrolizę w środowisku kwaśnym. Masa molowa otrzymanego poliglicydolu wyznaczona techniką chromatografii żelowej z detektorem wielokątowego rozpraszania światła GPC-MALLS wynosiła M n = 2 200 000 g/mol (M w /M n = 1,3). Poliglicydol nie wykazuje termowrażliwości. Hydrofobowa modyfikacja poliglicydolu grupami octanowymi i etylokarbaminowymi prowadzi do otrzymania polimerów termowrażliwych [1]. Przeprowadzono reakcję modyfikacji grup hydroksylowych poliglicydolu izocyjanianem etylu, wprowadzając do łańcucha grupy etylokarbaminowe. Opierając się na wcześniejszych badaniach [1] poszczególne reagenty dobierano w taki sposób, aby otrzymać kopolimery glicydolu i etylokarbaminianu glicydylu o stopniu podstawienia grup hydroksylowych 40 % (mpgl_a) i 32 % (mpgl_b). Reakcja modyfikacji poliglicydolu przebiegała w DMF i była katalizowana dilaurynianem dibutylocyny. Strukturę i skład otrzymanych kopolimerów glicydolu i etylokarbaminianu glicydylu potwierdzono techniką 1 H NMR. Oznaczony eksperymentalnie skład obu kopolimerów był zgodny z założeniami teoretycznymi. Zmiana transmitancji roztworów mpgl_a i mpgl_b w wodzie i pożywce do hodowli komórek w funkcji temperatury potwierdziła, że otrzymane kopolimery glicydolu i etylokarbaminianu glicydylu są termowrażliwe (Tab. 1). Tab. 1. Charakterystyka otrzymanych kopolimerów glicydolu i etylokarbaminianu glicydylu Symbol polimeru Podstawienie T CP w wodzie T CP w pożywce grup OH [%] [ºC] [ºC] mpgl_a 40 25 23 mpgl_b 32 46 44 Temperatury zmętnienia kopolimerów rozpuszczonych w pożywce nieznacznie różnią się od temperatur przejścia w wodzie, co jest spowodowane efektem wysolenia polimeru poprzez substancje małocząsteczkowe znajdujące się w pożywce. 3
3.1.2. (Ko)polimery 2-podstawionych-2-oksazolin Przeprowadzono kationową polimeryzację z otwarciem pierścienia 2-izopropylo-2-oksazoliny (IPOx) oraz kopolimeryzację 2-etylo- (EOx) i 2-nonylo-2-oksazoliny (NOx) w obecności 4- nitrobenzenosulfonianu metylu jako inicjatora, zgodnie z procedurą opisaną w literaturze [2,3]. Skład, masy molowe oraz punkty zmętnienia liniowych homopolimerów 2-izopropylo-2- oksazoliny (PIPOx) oraz bezładnych kopolimerów 2-etylo- i 2-nonylo-2-oksazoliny (PENOx) przedstawiono w tabeli 2. Tab. 2. Charakterystyka otrzymanych termowrażliwych polimerów 2-oksazolin (Ko)polimer poli[2-(etylo 130 /nonylo 10 ) -2-oksazolina] poli[2-(etylo 155 /nonylo 15 ) -2-oksazolina] poli[2-(etylo 135 /nonylo 5 ) -2-oksazolina] poli[2-(etylo 200 /nonylo 10 ) -2-oksazolina] poli[2-(etylo 137 /nonylo 3 ) -2-oksazolina] poli(2-izopropylo-2- oksazolina) 150 poli(2-izopropylo-2- oksazolina) 200 poli(2-izopropylo-2- oksazolina) 370 Symbol M teoret. [g/mol] DP teoret. % mol NOx teoret PENOx1 15 000 140 10 PENOx2 21 000 200 8 PENOx3 14 700 140 6 PENOx4 21 000 200 6 PENOx5 14 300 140 3 PIPOx1 15 000 135 -- PIPOx2 20 000 175 -- PIPOx3 40 000 350 -- M n [g/mol] (M w /M n ) 15 000 (1,04) 18 000 (1,27) 14 000 (1,27) 21 800 (1,33) 14 500 (1,24) 17 000 (1,19) 22 500 (1,02) 42 000 (1,06) DP % mol NOx (NMR) T CP woda [ C] T CP pożywka [ C] 140 14 22 20 170 14 22 20 140 10 31 29 200 10 31 29 150 3 48 46 150 -- 38 36 200 -- 37 35 370 -- 36 34 Krystaliczność poli(2-izopropylo-2-oksazoliny) w roztworze W literaturze szeroko opisywane są zagadnienia krystalizacji PIPOx w wodzie oraz w roztworach wodnych z dodatkiem glikolu etylenowego lub tetrahydrofuranu [4]. Krystalizacja PIPOx w tych rozpuszczalnikach jest indukowana przejściem fazowym polimeru powyżej LCST, a więc jest ściśle związana z tak zwaną luką rozpuszczalności. Podczas ogrzewania (minimum 2 godziny [5]) wodnego roztworu PIPOx powyżej LCST zanika sfera solwatacji i łańcuchy polimeru przechodzą z konformacji typu gauche i trans głównie w konformację typu trans. Ta konformacja ułatwia powstawanie trwałych, międzyłańcuchowych oddziaływań pomiędzy fragmentami łańcuchów zawierających grupy amidowe, co w konsekwencji prowadzi do porządkowania łańcuchów, zarodkowania i krystalizacji. Proces krystalizacji poli(2-izopropylo-2-oksazoliny) został szczegółowo zbadany i wyjaśniony przez grupę Schlaada [4] i Winnik [6]. Krystaliczność polimeru może mieć istotny wpływ na morfologię i właściwości warstwy. W pracy polimeryzację 2-izopropylo-2-oksazoliny prowadzono w acetonitrylu. W literaturze brak jest informacji o możliwości krystalizacji poli(2-oksazolin) w roztworach, w których nie 4
przepływ ciepła [W/g] Intensywność występuje separacja fazowa związana z termowrażliwością, a więc w rozpuszczalnikach organicznych. Zbadano zatem krystalizację PIPOx w acetonitrylu (ACN) i rozpuszczalnikach o podobnym momencie dipolowym: dimetylo sulfotlenku (DMSO) i węglanie propylenu (PC). Roztwory o różnych stężeniach ogrzewano w temperaturze 50 ºC. Stwierdzono, że długotrwałe (minimum 2 dni) ogrzewanie poli(2-izopropylo-2-oksazoliny) w tych rozpuszczalnikach powodowało wytrącenie krystalicznego osadu. Szybkość krystalizacji zależała od stężenia polimeru oraz użytego rozpuszczalnika. Większe stężenie polimeru przyspieszało zarodkowanie i krystalizację. Spośród użytych rozpuszczalników krystalizacja PIPOx zachodziła najszybciej w DMSO i PC. Frakcję krystaliczną po wydzieleniu i oczyszczeniu poddano analizie termicznej i rentgenograficznej oraz obrazowano z wykorzystaniem mikroskopii SEM. Przykładowe krzywe DSC i XRD oraz zdjęcie SEM dla PIPOx2 krystalizowanej z acetonitrylu (stężenie 30 %, w/v) przedstawiono na rysunku 1. A B C 0-1 T g =70 O C -2-3 T m =209 O C H=35 J/g 50 100 150 200 temperatura [ O C] Rys. 1. Krzywa DSC (fioletowa linia pierwszy bieg, czerwona linia drugi bieg po schłodzeniu, pomiar 10 C/min) (A), krzywa dyfrakcyjna (B) i zdjęcie SEM dla PIPOx2 krystalizowanej w ACN, stężenie 30 % (w/v) Analiza rentgenograficzna wykazała, że PIPOx krystalizowany z rozpuszczalników organicznych ma taką samą komórkę elementarną jak PIPOx krystalizowany z wody. Morfologia frakcji krystalicznej PIPOx w rozpuszczalnikach organicznych bez dodatku wody różni się wyraźnie od PIPOx w wodzie. Frakcja krystaliczna PIPOx w rozpuszczalnikach organicznych składa się z przeplatających się fibrylarnych struktur. Struktura ta jest inna niż tworzona przez PIPOx w wodzie, gdzie krystaliczne fibryle organizują się w sferyczne skupiska [4,5,7]. Przeprowadzone w pracy badania dowiodły, że możliwa jest krystalizacja PIPOx w rozpuszczalnikach organicznych. Do tego celu nie jest konieczne powstanie bogatej w polimer fazy. Mechanizm krystalizacji PIPOx w rozpuszczalniku organicznym jest podobny do procesu zachodzącego po dehydratacji łańcuchów w wodzie powyżej T CP [6], ponieważ prowadzi do takiej samej komórki elementarnej. 5
3.2. Synteza i charakterystyka termowrażliwych warstw polimerowych na podłożach W pracy termowrażliwe warstwy otrzymano metodą szczepienia do. W wypadku termowrażliwego poliglicydolu przeprowadzono reakcję grup funkcyjnych łańcucha polimeru z komplementarnymi grupami funkcyjnymi podłoża, wprowadzonymi na powierzchnię. W wypadku polioksazolin żyjący koniec łańcucha polimeru terminowano grupami funkcyjnymi podłoża. Funkcjonalizacja podłoży obejmowała hydroksylację (Rys. 2A), aminosililowanie (Rys. 2B) oraz immobilizację tzw. warstwy pośredniej poli(etylenu-alt-bezwodnika maleinowego) (PE-MA) (Rys. 2C). A B C Rys. 2. Etapy modyfikacji podłoża: hydroksylacja (A), aminosililowanie (B), wprowadzenie warstwy poli(etylenu-alt-bezwodnika maleinowego) (C) Po każdym etapie modyfikacji obecność grup funkcyjnych na podłożach potwierdzono techniką spektroskopii fotoelektronów w zakresie promieniowania X (XPS) lub spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR). Wraz z postępem modyfikacji obserwowano wzrost chropowatości i zwilżalności podłoża. Grupy aminowe na podłożu (Rys. 2B) pozwoliły na kowalencyjne związanie termowrażliwych polimerów 2-oksazolin. Natomiast warstwa poli(etylenu-alt-bezwodnika maleinowego) (Rys. 2C) służyła do związania z podłożem termowrażliwej pochodnej poliglicydolu. 3.2.1. Synteza i charakterystyka termowrażliwych warstw poliglicydolu Część grup bezwodnikowych warstwy pośredniej kopolimeru PE-MA nie przereagowała z grupami aminowymi podłoża, były więc one dostępne do reakcji z grupami hydroksylowymi glicydolu (Rys. 3). Rys. 3. Schemat szczepienia poli(glicydolu-co-etylokarbaminianu glicydylu) do funkcjonalizowanego podłoża 6
Roztwory poli(glicydolu-co-etylokarbaminianu glicydylu) w metanolu o stężeniach: 0,25 % (mpgl_a1), 0,5 % (mpgl_a2), 1 % (mpgl_a3) i 10 % (mpgl_a4) nanoszono na funkcjonalizowane podłoża techniką rozwirowania. W wyniku tak zwanej "melt reaction" [8,9] utworzyły się wiązania kowalencyjne pomiędzy polimerem i podłożem pod wpływem podwyższonej temperatury. Warstwy polimeru miały strukturę gładkiego, regularnego filmu o grubości od 20 do 60 nm (Rys. 4). Średnie kwadratowe odchylenie chropowatości przekroju powierzchni RMS zawierało się w granicach od 0,09 nm do 0,18 nm. Ze wzrostem stężenia roztworu polimeru zwiększała się chropowatość powierzchni oraz grubość warstwy. Dla roztworu 10 % w/v otrzymano warstwę (mpgl_a4) o nieregularnym ukształtowaniu powierzchni (RMS od 0,6 do 1,3 nm) i grubości wahającej się od 24 do 60 nm. A B Rys. 4. Zdjęcia AFM i profil chropowatości powierzchni warstw mpgl_a3 (A) i mpgl_a4 (B) Aby zbadać, czy otrzymane warstwy poli(glicydolu-co-etylokarbaminianu glicydylu) wykazują termowrażliwość, mierzono ich grubość i powinowactwo do wody w temperaturach poniżej i powyżej T CP polimeru (Tab. 3). Tab. 3. Grubość i zwilżalność warstw poli(glicydolu-co-etylokarbaminianu glicydylu) suchych i inkubowanych w wodzie w temperaturze 20 i 40 C Grubość [nm] Warunki pomiaru warstwa sucha, 20 C warstwa inkubowana w wodzie mpgl_a1 (0,25 %) mpgl_a2 (0,5 %) mpgl_a3 (1 %) mpgl_a4 (10 %) 20±0,7 28±0,5 34±0,5 24-60 - 20 C 30±0,5 31±0,4 38±0,4 27-60 - 40 C 34±0,5 33±0,4 41±0,5 47±0,5 - PGl warstwa sucha, 20 C warstwa inkubowana w wodzie 1sek 30sek 62 57 5 60 53 7 20 C 60 55 50 30 50 40 C 68 65 70 55 51 1sek - kąt zwilżania zarejestrowany w pierwszej sekundzie pomiaru, 30sek - kąt zwilżania zarejestrowany w trzydziestej sekundzie pomiaru, - różnica pomiędzy 1sek i 30sek, PGl - warstwa pokryta poliglicydolem niewykazującym termowrażliwości 60 47 13 50 26 24 58 46 12 7
Wszystkie warstwy inkubowane w wodzie w temperaturze 20 C wykazywały zwiększone powinowactwo do wody w porównaniu z warstwami suchymi. Woda przenika w obszary międzycząsteczkowe polimeru i solwatuje łańcuchy, w wyniku czego warstwa polimeru adsorbuje wodę i pęcznieje. Reakcja warstwy mpgl na wzrost temperatury była nietypowa. Wzrost temperatury do 40 C, czyli powyżej punktu zmętnienia polimeru powodował dalszy, choć nieznaczny wzrost grubości warstw. Zazwyczaj grubość termowrażliwej warstwy spada ze wzrostem temperatury bo łańcuchy ulegają dehydratacji i kurczą się [10]. Doniesienia te dotyczą głównie warstw o strukturze szczotek [11]. Badany w pracy termowrażliwy łańcuch kopolimeru zawierający wiele grup funkcyjnych wiąże się z podłożem w wielu miejscach (Rys. 5A). Taka warstwa może zupełnie inaczej reagować na zmiany temperatury niż warstwy o strukturze szczotek. Aczkolwiek, podobnie jak szczotki, warstwy mpgl w temperaturze powyżej T CP ulegają dehydratacji i zmieniają swoją filowość, to jednak usuwaniu wody z wnętrza warstwy poliglicydolu towarzyszy nieznaczne zwiększenie grubości (Rys. 5B). A B Rys. 5. Łańcuch polimerowy przyczepiony do podłoża w wielu miejscach (A) i zaproponowany schemat usuwania wody z wnętrza warstwy utworzonej przez takie polimery (B) 3.2.2. Synteza i charakterystyka termowrażliwych warstw (ko)poli(2-podstawionych-2- oksazolin) Termowrażliwe kopolimery 2-etylo- i 2-nonylo-2-oksazoliny (PENOx) (Tab. 2) oraz homopolimery 2-izopropylo-2-oksazoliny (PIPOx) szczepiono do aminosililowanego podłoża. Żyjące centra wzrostu w postaci kationów oksazoliniowych na końcu łańcucha zostały poddane reakcji terminacji grupami aminowymi wprowadzonymi na podłoże, w wyniku czego utworzone zostało wiązanie kowalencyjne (Rys. 6). Otrzymane warstwy mają strukturę szczotek: jeden koniec łańcucha POx jest kowalencyjnie związany z podłożem, a drugi pozostaje swobodny. Rys. 6. Schemat szczepienia POx do aminosililowanego podłoża 8
Stosując kopolimer PENOx otrzymano warstwy o chropowatej strukturze (Rys. 7). Rys. 7. Zdjęcia AFM warstw PENOx1 Na powierzchniach warstw PIPOx występowały zarówno gładkie obszary, jak i podłużne struktury pojedyncze lub połączone w większe skupiska, kształtem przypominające fibryle (Rys. 8A). Wykazano, że te fibrylarne struktury to krystality PIPOx zaadsorbowane na powierzchni warstwy. Zawartość krystalitów na powierzchni można kontrolować (Rys. 8B) poprzez czas ogrzewania PIPOx w acetonitrylu. Wydłużanie czasu ogrzewania powoduje zwiększenie ilości krystalicznego osadu w roztworze, który następnie nanoszony jest na funkcjonalizowane podłoże. Możliwe jest również całkowite usunięcie krystalitów z powierzchni przez stopienie (ogrzewanie powyżej T m ), schłodzenie i wymycie (Rys. 8C). A B C Rys. 8. Zdjęcia AFM warstw PIPOx2 o zawartości krystalitów 15 % (A), 70 % (B) i po usunięciu krystalitów (C) Ze wzrostem masy molowej immobilizowanego kopolimeru PENOx oraz zawartości krystalitów na powierzchni PIPOx obserwowano zwiększanie grubości warstwy. Powinowactwo warstw PENOx do wody zależało od zawartości molowej 2-nonylo-2- oksazoliny w łańcuchu immobilizowanego kopolimeru. Komonomer ten jest hydrofobowy i większa jego zawartość w łańcuchu powoduje, że warstwa miała mniejsze powinowactwo do wody. W wypadku warstw PIPOx zwilżalność zależy od stopnia pokrycia ich powierzchni krystalitami i zwiększa się wraz ze zmniejszającą się ilością krystalitów na powierzchni. Podczas inkubacji warstw w wodzie o temperaturze 20 C obserwowano zwiększenie się grubości warstw (ko)poli(2-podstawionych-2-oksazolin). W ciągu 60 minut grubość warstw PENOx i PIPOx zwiększyła się o około 2-6 nm. Obserwowane zwiększenie grubości było konsekwencją solwatacji łańcuchów polimerowych przez wodę i ich rozciągania w wyniku penetracji cząsteczek wody do wnętrza warstwy. Największe pęcznienie obserwowano dla warstw poli(2-izopropylo-2-oksazoliny) o zawartości krystalitów na powierzchni do 40 %. Podobnie, inkubacja warstw PENOx i PIPOx w wodzie przez dwie godziny w temperaturze pokojowej powodowała spadek wartości kąta zwilżania. 9
Z wydłużaniem czasu inkubacji w temperaturze powyżej T CP zmniejszyła się grubość warstw wywołana kurczeniem się łańcuchów na powierzchni. Największą zmianę grubości obserwowano w wypadku warstw PIPOx o zawartości krystalitów do 40 %. Podwyższenie temperatury powyżej T CP powodowało zmniejszenie powinowactwa warstw (ko)poli(2- podstawionych-2-oksazolin) do wody. Powyżej temperatury przejścia fazowego woda usuwana jest z wnętrza warstwy, czemu towarzyszy podwyższenie kąta zwilżania. Obserwowane zmiany kątów zwilżania i grubości warstwy pod wpływem temperatury potwierdziły, że otrzymane warstwy są termowrażliwe (Tab. 4, Tab. 5). Tab. 4. Wartości kątów zwilżania dla warstw poli[(2-etylo-2-oksazoliny)-co-(2-nonylo-2-oksazoliny)] i poli(2- izopropylo-2-oksazoliny) WarstwaPENOx PENOx1 PENOx2 PENOx3 PENOx4 Warstwa PIPOx Immobilozowany kopolimer 15 000 g/mol, 14 % NOx 21 000 g/mol, 14 % NOx 14 700 g/mol, 10 % NOx 21 000 g/mol, 10 % NOx Pokrycie krystalitami 1 [ ] (suche, 20 C) 2 [ ] (woda, 20 C) 3 [ ] (woda, 40 C) [ ] 76 55 70 15 70 56 66 10 67 56 60 4 55 50 52 2 1 [ ] (suche, 20 C) 2 [ ] (woda, 20 C) 3 [ ] (woda, 40 C) [ ] PIPOx1 40 % 69 55 69 14 PIPOx3 70 % 72 61 64 3 PIPOx2 15 % 65 54 64 10 PIPOx2 35 % 68 58 67 9 PIPOx2 40 % 69 58 68 10 PIPOx2 70 % 72 60 64 4 PIPOx2_12 AMORF * *Warstwa PIPOx2, z której usunięto krystality 0 % 60 54 63 9 Tab. 5. Grubość warstw poli[(2-etylo-2-oksazoliny)-co-(2-nonylo-2-oksazoliny)] i poli(2-izopropylo-2- oksazoliny) Symbol warstwy d [nm] suche, 20 O C woda, 20 O C woda, 40 O C PENOx1_12 5 7 6 PENOx2_12 6 8 7 PENOx3_12 4 6 5 PENOx4_12 7 11,5 9 PIPOx1_12 7 13 9 PIPOx2_12 9 13 11 PIPOx3_12 11 16 13 10
3.3. Oddziaływanie polimerów i warstw polimerowych z fibroblastami Istotna w leczeniu oparzeń jest możliwość stosowania arkuszy komórek spojonych macierzą zewnątrzkomórkową, a nie zawiesiny pojedynczych komórek. Wyhodowanie in vitro komórek naskórka lub skóry właściwej w postaci płata i jego nałożenie bezpośrednio na ranę to alternatywa, która mogłaby znacznie skracać proces gojenia. W pracy przeprowadzono hodowlę i próby odczepiania arkusza komórek skóry - fibroblastów, z wykorzystaniem termowrażliwych powierzchni mpgla, PENOx i PIPOx. W pierwszym etapie badań konieczne było zbadanie wpływu tych polimerów na żywotność komórek. 3.3.1. Cytotoksyczność termowrażliwych polimerów W pracy do oceny przeżywalności fibroblastów w obecności termowrażliwych pochodnych poliglicydolu i polioksazolin zastosowano test metaboliczny Alamar Blue. W tym teście używana jest resazuryna, będąca indykatorem oksydacyjno-redukcyjnym, który w kontakcie z żywymi komórkami pod wpływem dehydrogenaz komórkowych ulega redukcji do fluorescencyjnej resorufiny. Stopień redukcji mierzony jest spektro- lub fluorymetrycznie [219]. Do badań cytotoksyczności wybrano takie polimery, które maja T CP wyższe niż temperatura, w której prowadzona jest hodowla (37 C). Do badań użyto poli(glicydol-coetylokarbaminian glicydylu) oznaczonego jako mpgl_b (T CP =44 C), natomiast spośród polioksazolin użyto kopolimeru 2-etylo- i 2-nonylo-2-oksazoliny oznaczonego jako PENOx5 (T CP =46 C). Na rysunku 9 przedstawiono wynik badania biozgodności mpgl_b i PENOx5 względem fibroblastów, dla różnych stężeń i czasów hodowli. A mpgl_b B PENOx5 Rys. 9. Cytotoksyczność mpgl_b i PENOx5 względem fibroblastów Badane polimery nie są toksyczne w stosunku do fibroblastów w szerokim zakresie stężeń, co pozwala na ich wykorzystanie do hodowli tych komórek. W wypadku zastosowanego najwyższego stężenia mpgl_b (10 mg/ml) żywotność komórek jest obniżona najprawdopodobniej ze względu na dużą masę molową polimeru, mogącą powodować barierę osmotyczną. 11
3.3.2. Adhezja, proliferacja i odczepianie fibroblastów od termowrażliwych warstw polimerowych Hodowla fibroblastów na termowrażliwych warstwach polimerowych była prowadzona w temperaturze powyżej T CP polimeru. W takich warunkach jest on dehydratowany. Po porośnięciu przez komórki powierzchni wzrostowej naczynia hodowlanego (osiągnięciu pełnej konfluencji) temperaturę obniżano poniżej T CP polimeru. Warstwa ulega wtedy hydratacji, a komórki mogą być łatwo oddzielone. Adhezja i proliferacja fibroblastów Komórki wysiewano na warstwy mpgl, PENOx i PIPOx w temperaturze 37 C. Po określonych czasach hodowli obliczano odsetek komórek, które uległy adhezji do termowrażliwej warstwy kopolimeru. Próbę kontrolną stanowiła hodowla fibroblastów na podłożu stosowanym standardowo w laboratoriach medycznych i biologicznych, modyfikowanym polistyrenie (TCPS). Warstwy poli(glicydolu-co-etylokarbaminianu glicydylu) Na rysunku 10 przedstawiono profil rozpłaszczania fibroblastów wysiewanych w temperaturze 37 C na warstwach poli(glicydolu-co-etylokarbaminianu glicydylu) oraz zdjęcia fibroblastów na tych warstwach po 72 godzinach hodowli. A B Rys. 10. Dynamika rozpłaszczania fibroblastów na warstwach poli(glicydolu-co-etylokarbaminianu glicydylu) w stosunku do kontroli (A), fibroblasty po 72 godzinach prowadzenia hodowli (B) W temperaturze prowadzenia hodowli fibroblasty ulegały adhezji i rozpłaszczaniu. Po 2,5 godzinach jedynie na warstwie mpgl_a1 fibroblasty uległy adhezji w takim samym stopniu jak na warstwie TCPS. Na pozostałych warstwach adhezja wynosiła od 25 do 80% w porównaniu do kontroli. Po 12 godzinach fibroblasty na wszystkich warstwach mpgl wykazywały taką samą adhezję jak w próbie kontrolnej. Na zdjęciach wykonanych po 72 godzinach hodowli widać, że cała powierzchnia wzrostowa warstw mpgl_a1, mpgl_a2 i mpgl_a3 jest porośnięta przez komórki (osiągnięta została pełna konfluencja). Fibroblasty utworzyły jednolity arkusz, w obrębie którego komórki ściśle przylegają do siebie i są połączone macierzą zewnątrzkomórkową. Jedynie w wypadku mpgl_a4 obserwowano zarówno nieporośnięte miejsca, jak i skupiska komórek. Morfologia powierzchni tej warstwy jest nierówna i pofałdowana (Rys. 4B), a fibroblasty najprawdopodobniej gromadziły się w zagłębieniach powierzchni. 12
Warstwy poli[(2-podstawionych-2-oksazolin)] Na rysunku 10 przedstawiono profil adhezji fibroblastów do warstw PENOx o różnej zawartości hydrofobowej 2-nonylo-2-oksazoliny i do warstw PIPOx o różnej zawartości krystalitów na powierzchni. A B Rys. 10. Dynamika rozpłaszczania fibroblastów na warstwach PENOx (A) i PIPOx (B) Po 8 godzinach hodowli fibroblasty wykazywały taką samą adhezję na warstwach PENOx jak w próbie kontrolnej. Nie widać różnic w adhezji komórek do warstw różniących się zawartością hydrofobowej 2-nonylo-2-oksazoliny. Na wszystkich warstwach fibroblasty utworzyły zwarty, konfluentny arkusz po 12 godzinach hodowli. Na warstwach PIPOx już po 2,5 godzinach hodowli około 80-90 % fibroblastów wykazywało taką samą adhezję jak na TCPS. Obecność krystalitów na warstwach PIPOx sprzyjała adhezji komórek. Po 24 godzinach hodowli wydajność adhezji fibroblastów rosła ze wzrostem krystaliczności warstwy. Krystality nadają warstwom PIPOx hydrofobowy charakter, co sprzyja adhezji i proliferacji fibroblastów. Ponadto fibrylarne krystality podobne są kształtem do włóknistych białek macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen, elastyna, fibronektyna czy laminina, przez co mogą imitować naturalne warunki wzrostu komórek. Fibrylarna sieć krystalitów, na której rosną fibroblsaty może dodatkowo ułatwiać przepływ substancji odżywczych do komórek oraz metabolitów z komórek do macierzy, co sprzyja proliferacji komórek. 13
Odczepianie fibroblastów Okano [13] podzielił proces odczepiania komórek od termowrażliwych warstw polimerowych na dwa etapy. Pierwszy etap to tak zwana faza pasywna, gdzie następuje hydratacja łańcuchów polimerowych warstwy, będąca bodźcem dla znajdujących się na niej komórek. Drugi etap odczepiania komórek z termowrażliwych powierzchni to tak zwana faza aktywna, która jest związana z procesami metabolicznymi komórki, zachodzącymi pod wpływem sił rozciągających cytoszkieletu [13,14]. Cytoszkielet komórki jest elastyczny potrafi się szybko przebudować zgodnie z potrzebami komórki. Najprawdopodobniej pod wpływem fizykochemicznych zmian właściwości podłoża, na którym znajdują się komórki (hydratacji łańcuchów polimerowych), siły rozciągające cytoszkieletu komórki powodują zmianę kształtu komórki z wrzecionowatego na elipsoidalny. Jednocześnie zmienia się charakter oddziaływań białek i innych składników ECM z podłożem. Zatem hydratacja łańcuchów polimerowych pod wpływem zmiany temperatury jest koniecznym bodźcem zapoczątkowującym proces odczepiania arkusza komórek od termowrażliwego podłoża. Po osiągnięciu przez fibroblasty pełnej konfluencji przeprowadzono indukowane termicznie próby odczepienia jednolitego arkusza fibroblastów od termowrażliwych warstw. Do tego celu obniżono temperaturę hodowli do 20 C w wypadku warstw mpgl i PIPOx oraz do 15 C w wypadku warstw PENOx. W tych warunkach warstwy są dehydratowane, jak pokazano we wcześniejszych badaniach. Warstwy poli(glicydolu-co-etylokarbaminianu glicydylu) Dla żadnej z badanych warstw mpgl po obniżeniu temperatury hodowli do 20 C nie zaobserwowano efektu samoczynnego odczepiania arkusza fibroblastów. Gdy polimery tworzące powierzchnię przyczepione są do niej jednym końcem tak zwane szczotki polimerowe, wówczas obniżeniu temperatury poniżej T CP immobilizowanego polimeru towarzyszy hydratacja łańcuchów oraz zwiększenie grubości warstwy. Taka zmiana właściwości podłoża stymuluje oddzielenie arkusza komórek. Warstwy mpgl powstały w wyniku przyczepienia polimeru do podłoża poprzez reakcję grup funkcyjnych znajdujących się wzdłuż łańcucha. Po zmniejszeniu temperatury poniżej T CP warstwy ulegały hydratacji, ale, jak opisano wcześniej równocześnie kurczyły się (Rys. 5). Zmiany, jakim ulegała warstwa mpgl nie doprowadziły do odczepienia się fibroblastów od podłoża. Na rysunku 106 przedstawiono arkusz fibroblastów na powierzchni mpgl_a3 w momencie obniżenia temperatury do 20 C oraz po 2 godzinach inkubacji w tej temperaturze. Warstwy poli[(2-etylo-2-oksazoliny)-co-(2-nonylo-2-oksazoliny)] W wypadku warstwy PENOx1 (M n immobilizowanego polimeru = 15 000 g/mol, NOx = 14%, Tab. 2), po 2 godzinach od momentu obniżenia temperatury zaobserwowano odczepienie się fragmentu arkusza fibroblastów kilka milimetrów od brzegu płytki. Po kolejnych 2,5 godzinach inkubacji w temperaturze 15 C zaobserwowano dalsze odczepianie arkusza komórek. Po całonocnej inkubacji podłoża PENOx1, fibroblasty uległy niemalże całkowitemu odklejeniu, tworząc zwinięty arkusz (Rys. 11). W wypadku pozostałych warstw poli[(2-etylo- 14
2-oksazoliny)-co-(2-nonylo-2-oksazoliny)] po całonocnej inkubacji w temperaturze 15 C jedynie niewielka część arkusza odczepiła się przy brzegu płytki. 1 min. 2 godz. 4,5 godz. 12 godz. Rys. 11. Odklejanie arkusza fibroblastów od warstwy PENOx1 w ciągu 12 godzin oraz zdjęcie arkusza fibroblastów odczepiającego się od warstwy PENOx1 Warstwa PENOx1, od której arkusz odczepiał się, charakteryzowała się najbardziej chropowatą powierzchnią RMS = 0,8-1 nm) oraz najmniejszym powinowactwem do wody ( = 76 ) spośród wszystkich otrzymanych warstw PENOx. Ponadto warstwa wykazywała największą różnicę w kątach zwilżania pomiędzy stanem hydratowanym a dehydratowanym ( = 15 ), przy jednoczesnym zmniejszeniu grubości. Te właściwości warstwy najprawdopodobniej odpowiadają za najefektywniejsze odczepienie komórek w postaci arkusza. Warstwy poli(2-izopropylo-2-oksazoliny) W wypadku warstwy PIPOx1 i PIPOx2 o stopniu pokrycia krystalitami 40 %, natychmiast po obniżeniu temperatury zaobserwowano odczepianie się fragmentu arkusza fibroblastów. Po około 15 minutach fibroblasty uległy całkowitemu odczepieniu, tworząc oddzielony, zwinięty arkusz, co przedstawiono na rysunku 12 dla PIPOx1. 15
1 min. 5 min. 10 min. 12 min. 15 min Rys. 12. Odklejanie arkusza fibroblastów od warstwy PIPOx1_12 w temperaturze 20 C oraz zwinięty arkusz fibroblastów odczepiający się od tej warstwy Podczas odczepiania z warstwy PIPOx arkusz fibroblastów ulegał rolowaniu. W wypadku warstw PIPOx2 i PIPOx3 o stopniu pokrycia krystalitami 70 %, a także warstwy PIPOx2, z powierzchni której usunięto krystality, nawet po całonocnej inkubacji w temperaturze 20 C nie obserwowano efektu odczepiania arkusza fibroblastów. Zaobserwowano, że doszło jedynie do odklejenia pojedynczych komórek i fragmentów arkusza około 2-3 mm od brzegu płytki. Przeprowadzone badania wskazują, że obecność pewnej liczby krystalitów sprzyja odczepianiu arkusza. Arkusz nie chce się samoczynnie odkleić ani od w pełni amorficznej warstwy PIPOx, ani wtedy, gdy na powierzchni znajduje się zbyt wiele hydrofobowych krystalitów. Narzędzia do wspomagania odczepiania i przenoszenia arkuszy fibroblastów Aby zapobiec zwijaniu się arkusza fibroblastów podczas jego odczepiania z termowrażliwych warstw polimerowych, użyto narzędzi do wspomagania odczepiania. Zastosowano trzy różne opatrunki biologiczne w postaci membran: krążek kolagenowy, syntetyczny naskórek "Suprathel" składający się z kopolimeru laktydu, węglanu trimetylenu i ε-kaprolaktonu oraz opatrunek hydrożelowy "Aqua-Gel", w skład którego wchodzą poliwinylopirolidon, glikol polietylenowy i agar (Rys. 13). 16
A B C Rys. 13. Membrany do transferu arkuszy fibroblastów: Suprathel (A), Aqua-Gel (B), krążek kolagenowy (C) Membrany nanoszono na arkusz fibroblastów wyhodowany w temperaturze 37 C na warstwie PIPOx2 o stopniu pokrycia krystalitami 40 %. Po przyczepieniu się komórek do danej membrany obniżono temperaturę hodowli poniżej T CP. Po 15 minutach podnoszono membranę z przyczepioną warstwą komórek i przenoszono arkusz do wyjałowionych naczyń hodowlanych. Na rysunku 14 przedstawiono procedurę odczepienia i przenoszenia fragmentu arkusza fibroblastów z badanej powierzchni z wykorzystaniem membrany Suprathel. A B C Rys. 14. Naniesienie membrany Suprathel na fragment arkusza fibroblastów, wyhodowanych na warstwie PIPOx2 (A), warstwa PIPOx2 po usunięciu membrany z fragmentem arkusza fibroblastów (B), przeniesiony fragment arkusza fibroblastów (C) Doświadczenia z wykorzystaniem membran dowiodły, że ich użycie ułatwia odczepienie i umożliwia przeniesienie nieposklejanego arkusza fibroblastów. Fragment arkusza fibroblastów wyhodowany na warstwie polimerowej przyczepił się do membrany (Rys. 14A). Po usunięciu membrany widoczny jest ubytek fragmentu arkusza fibroblastów w miejscu, do którego przyłożono membranę (Rys. 14B). Membrana kolagenowa i Suprathel były najwydajniejsze w odczepianiu i przenoszeniu arkuszy komórek. 17
4. PODSUMOWANIE I WNIOSKI W ramach pracy opracowano termowrażliwe warstwy poliglicydolu i polioksazolin na podłożach stałych do hodowli i bezinwazyjnego odczepiania komórek skóry w postaci arkusza. Otrzymano termowrażliwe kopolimery glicydolu i etylokarbaminianu glicydylu, 2-etylo- i 2- nonylo-2-oksazoliny oraz homopolimery 2-izopropylo-2-oksazoliny, które nie wykazywały toksyczności względem fibroblastów. Polimery immobilizowano na funkcjonalizowanym podłożu stałym (szkło, krzem) metodą szczepienia do. Funkcjonalizacja powierzchni krzemu i szkła pozwoliła na wprowadzenie na podłoże reaktywnych grup funkcyjnych, zdolnych do reakcji z polimerem. W wyniku reakcji hydroksylowanego podłoża ze związkiem silanowym zawierającym ugrupowanie aminopropylowe, na podoże wprowadzono grupy aminowe dostępne do dalszych reakcji. Naniesienie na tak modyfikowane podłoże kopolimeru bezwodnika prowadziło do otrzymania warstwy z grupami karboksylowymi, które w wyniku dehydratacji przekształcono w reaktywne grupy bezwodnikowe. Postęp funkcjonalizacji podłoża potwierdzono wyznaczając procentowy udział pierwiastków na powierzchni oraz badając zmiany morfologii i powinowactwa powierzchni do wody. W wyniku reakcji grup bezwodnikowych podłoża z grupami hydroksylowymi termowrażliwego poli(glicydolu-co-etylokarbaminianu glicydylu) utworzona została stabilna warstwa, która nie ulegała odczepieniu pod wpływem wymywania i traktowania ultradźwiękami. Warstwa ta składała się z łańcuchów polimerowych, przyczepionych do podłoża w wielu miejscach wzdłuż łańcucha. Termowrażliwe (ko)polimery 2-podstawionych-2-oksazolin zostały kowalencyjnie związane z podłożem poprzez terminację żyjących centrów wzrostu na końcu łańcuców za pomocą grup aminowych wprowadzonych na podłoże. Warstwy POx miały strukturę szczotkową. Ustalono jak struktura powierzchni warstwy poliglicydolu zależy od sposobu nanoszenia i stężenia roztworu polimeru. Grubość warstw wahała się od 20 do 60 nm i była zależna od stężenia nanoszonego roztworu poliglicydolu. O chropowatości warstw kopolimerów 2-etylo- i 2-nonylo-2-oksazoliny i ich powinowactwa do wody decydowała zawartość hydrofobowej NOx w łańcuchu. Warstwy poli(2-izopropylo-2-oksazoliny) były pokryte zaadsorbowanymi krystalitami w kształcie fibryli, a ich ilość zależała od czasu wygrzewania PIPOx w acetonitrylu. Możliwe było otrzymanie warstwy PIPOx o pożądanym stopniu pokrycia krystalitami oraz ich łatwe usunięcie przez stopienie, zamorfizowanie i wymycie. Powinowactwo warstw PIPOx do wody zmniejszało się ze zwiększającą ilością krystalitów na podłożu. Wykazano, że poli(2-izopropylo-2-oksazolina) jest zdolna do krystalizacji w rozpuszczalnikach organicznych: acetonitrylu, dimetylo sulfotlenku i węglanie propylenu. 18
Wszystkie otrzymane nanometrowe warstwy były termowrażliwe i wykazywały zmiany właściwości z hydrofilowych na hydrofobowe wraz ze wzrostem temperatury powyżej temperatury zmętnienia immobilizowanych (ko)polimerów. Najsilniej na zmianę temperatury reagowała warstwa poli(glicydolu-co-etylokarbaminianu glicydylu) o najmniejszej grubości, warstwy 2-etylo- i 2-nonylo-2-oksazoliny o największej zawartości hydrofobowej NOx oraz warstwy poli(2-izopropylo-2-oksazoliny) o stopniu pokrycia krystalitami od 15 do 40 %. Poniżej temperatury przejścia objętościowego warstwy poli(glicydolu-co-etylokarbaminianu glicydylu), poli[(2-etylo-2-oksazoliny)-co-(2-nonylo-2-oksazoliny)] oraz poli(2-izopropylo-2- oksazoliny) inkubowane w wodzie pęczniały w wyniku absorpcji wody do wnętrza i solwatacji łańcuchów warstwy. Po podwyższeniu temperatury następowała dehydratacja łańcuchów a szczotkowe warstwy POx kurczyły się, najbardziej warstwa poli(2-izopropylo-2-oksazoliny), na której powierzchni znajdowało się około 40 % krystalitów. Natomiast łańcuchy poli(glicydolu-coetylokarbaminianu glicydylu) przyczepione w wielu miejscach do podłoża nieznacznie zwiększały grubość. Takie zachowanie przypisano częściowemu rozciąganiu się łańcuchów polimeru. Termowrażliwe warstwy zostały wykorzystane jako podłoża do hodowli i odczepiania komórek skóry. W temperaturze 37 C fibroblasty dokonywały adhezji do wszystkich warstw, które w tych warunkach były hydrofobowe. Po 2,5 godzinach prowadzenia hodowli adhezja fibroblastów do podłoży była porównywalna do próby kontrolnej, prowadzonej na niewykazującym termowrażliwości, modyfikowanym polistyrenie. W ciągu 24 godzin fibroblasty tworzyły jednolity, zwarty arkusz, w obrębie którego ściśle przylegały do siebie i były połączone macierzą zewnątrzkomórkową. Po obniżeniu temperatury poniżej T CP, gdy warstwa wykazywała właściwości hydrofilowe, arkusz fibroblastów samoczynnie odczepił się od warstw (ko)polioksazolin. Najszybciej (w czasie 15 minut od obniżenia temperatury) arkusz fibroblastów odczepiał się od warstwy poli(2-izopropylo-2-oksazoliny), której powierzchnia była w 40 % pokryta krystalitami. W wypadku warstw PIPOx pokrytych w mniejszym stopniu krystalitami arkusz komórek odczepiał się samoczynnie od podłoża w postaci dużych fragmentów. Przeprowadzone badania świadczą, że obecność pewnej liczby krystalitów sprzyja odczepianiu arkusza fibroblastów od warstw poli(2-izopropylo-2-oksazoliny). Arkusz nie odczepia się samoczynnie ani od w pełni amorficznej warstwy PIPOx, ani wtedy, gdy na powierzchni znajduje się zbyt wiele hydrofobowych krystalitów. Nie obserwowano samoczynnego odczepiania arkusza fibroblastów od warstw poli(glicydoluco-etylokarbaminianu glicydylu), pomimo zmian zwilżalności podłoża. Stwierdzono, że do wspomagania odczepiania i przenoszenia arkuszy fibroblastów dobrze jest użyć narzędzi w postaci syntetycznego naskórka, opatrunku hydrożelowego lub krążka kolagenowego. Zapobiegają one zwijaniu się arkuszy i ułatwiają odczepienie fibroblastów od podłoży. Odczepianie arkuszy komórek z użyciem opatrunków biologicznych wymaga dalszej optymalizacji. 19
5. LITERATURA [1] M. Jamróz-Piegza, A. Utrata-Wesołek, B. Trzebicka, A. Dworak, Eur. Polym. J. 42, 2497-2506 (2006) [2] K. Aoi, M. Okada, Prog. Polym. Sci. 21, 151-208 (1996) [3] M.W.M. Fijten, J.M. Kranenburg, H.M.L. Thijs, R.M. Paulus, B.M. van Lankvelt, J. de Hullu, M. Springintveld, D.J.G. Thielen, C.A. Tweedie, R. Hoogenboom, K.J. Van Vliet, U.S. Schubert, Macromolecules 40, 5879-5886 (2007) [4] A. Levent Demirel, M. Meyer, H. Schlaad, Angew. Chem. Int. Ed. 46, 8622-8624 (2007) [5] C. Diehl, P. Cernoch, I. Zenke, H. Runge, R. Pitschke, J. Hartmann, B. Tierschc, H. Schlaad, Soft Matter 6, 3784-3788 (2010) [6] Y. Katsumoto, A. Tsuchiizu, X.P. Qiu, F.M. Winnik, Macromolecules 45, 3531-3541 (2012) [7] M. Meyer, M. Antonietti, H. Schlaad, Soft Matter 3, 430-431 (2007) [8] S. Minko, S. Patil, V. Datsyuk, F. Simon, K.J. Eichorn, M. Motornov, Langmuir 18, 289-296 (2002) [9] I. Luzinov, D. Julthongpiput, H. Malz, J. Pionteck, V.V. Tsukruk, Macromolecules 33, 1043-1048 (2000). [10] K. Nagase, J. Kobayashi, T. Okano, J.R. Soc. Interface 6, S293-309 (2009) [11] T. Chen, R. Ferris, J. Zhang, R. Ducker, S. Zauscher, Prog. Polym. Sci. 35, 94-112 (2010) [12] J. O Brien, I. Wilson, T. Orton, F. Pognan, Eur. J. Biochem. 267, 5421-5426 (2000) [13] T. Okano, N. Yamada, M. Okuhara, H. Sakai, Y. Sakurai, Biomaterials 16, 297-303 (1995) [14] M. Yamato, C. Konno, A. Kushida, M. Hirose, M. Utsumi, A. Kikuchi, T. Okano, Biomaterials 21, 981-986 (2000) 20
6. DOROBEK NAUKOWY DOKTORANTA Publikacje A. Utrata-Wesołek, N. Oleszko, B. Trzebicka, J. Anioł, M. Zagdanska, M. Lesiak, A.L. Sieroń, A. Dworak "Modified polyglycidol based nanolayers of switchable philicity and their interactions with skin cells" European Polymer Journal 49, 106-117 (2013) A. Dworak, A. Utrata-Wesołek, N. Oleszko, W. Wałach, B. Trzebicka, J. Anioł, A.L. Sieroń, A. Klama-Baryła, M. Kawecki "Poly(2-substituted-2-oxazoline) surfaces for dermal fibroblasts adhesion and detachment" J Mater Sci: Mater Med 25, 1149-1163 (2014) N. Oleszko, A. Utrata-Wesołek, W. Wałach, M. Libera, A. Hercog, U. Szeluga, M. Domański, B. Trzebicka, A. Dworak "Crystallization of poly(2-isopropyl-2-oxazoline) in organic solutions" Macromolecules - DOI: 10.1021/ma502586x Publikacje będące w przygotowaniu N. Oleszko, A. Utrata-Wesołek, W. Wałach, A. Kowalczuk, B. Trzebicka, A. Klama- Baryła, D. Hoff-Lenczewska, M. Kawecki, M. Lesiak, A.L. Sieroń, A. Dworak "Semi-crystalline thermoresponsive surfaces of poly(2-isopropyl-2-oxazoline) for human dermal fibroblasts culture and detachment" B. Trzebicka, E. Haladjova, Ł. Otulakowski, N. Oleszko, W. Wałach, M. Libera, S. Rangelov, A. Dworak "PIPOx/PNIPAM mixed mesoglobules and their stabilization with cross-linked polymer shell" Patent europejski "Method for preparation a thermosensitive coating substrate, the substrate with a thermosensitive coating and its application", EP 2574664 A1 Zgłoszenie patentowe w UP RP Sposób wytwarzania podłoża z powłoką termoczułą, podłoża z powłoką termoczułą oraz jego zastosowanie nr P.396476 Uczestnictwo w projektach badawczych projekt DERMOSTIM, UDA-POIG.01.03.01-00-088/08, Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego projekt POLYCELL, PBS1/B9/10/2012, Narodowe Centrum Badań i Rozwoju projekt PRELUDIUM, DEC-2012/07/N/ST5/00261Narodowe Centrum Nauki 21
Stypendia naukowe Europejski Fundusz Społeczny w ramach projektu Regionalny Fundusz Stypendiów Doktoranckich Akademicki Inkubator Przedsiębiorczości w ramach projektu Naukowe Stypendia szansą na rozwój województwa śląskiego finansowanego z EFS, POKL.08.02.01-24-019/11 Praca magisterska Opieka nad pracą magisterską inż. Anny Badury Termoczułe podłoża polioksazolinowe do hodowli komórek, praca wykonana na Wydziale Chemicznym Politechniki Śląskiej we współpracy z Centrum Materiałów Polimerowych i Węglowych PAN Komunikaty na konferencjach krajowych i zagranicznych N. Oleszko, M. Jamróz-Piegza, B. Trzebicka, A. Dworak Polieterowe nanożele do enkapsulacji substancji małocząsteczkowych BioMedTech Silesia, Zabrze, marzec 2009 N. Oleszko, A. Utrata-Wesołek, B. Trzebicka, A. Dworak Nowe termowrażliwe powierzchnie do hodowli i uwalniania komórek skóry BioMedTech Silesia, Zabrze, 12.03.2010 N. Oleszko, A. Utrata-Wesołek, B. Trzebicka, A. Dworak "New polymer surfaces with thermoresponsive properties obtained by chemical reactions" BYPOS, Tatrzańskie Teplice, Słowacja, 7-10.06.2010 N. Oleszko Nowe termowrażliwe powierzchnie oparte na pochodnych poliglicydolu V Ogólnopolska Konferencja Naukowa Nauka i Przemysł, Kraków, 26.11.2010 N. Oleszko Nowe termowrażliwe powierzchnie polimerowe do hodowli i uwalniania komórek skóry Spotkanie Regionalnego Funduszu Stypendiów Doktoranckich, Katowice, 27.05.2011 A. Dworak, B. Trzebicka, A. Utrata-Wesołek, W. Wałach, A. Kowalczuk, D. Szweda, N. Oleszko, A. Marcinkowski "Thermosensitive polymers for growth of skin cell sheet" Polymers 2012, XVII National Symposium Open to International Participation, Ribaritsa, Bułgaria, 31.05-02.06.2012 N. Oleszko, A. Utrata-Wesołek, W. Wałach, B. Trzebicka, A. Dworak, J. Anioł, A.L. Sieroń, A. Klama-Baryła, M. Kawecki Właściwości termowrażliwych powierzchni i ich wpływ na hodowlę komórek skóry 55 Zjazd PTChem i SITPChem, Białystok, 16-20.09.2012 N. Oleszko, A. Utrata-Wesołek, W. Wałach, B. Trzebicka, A. Dworak "Polymer surfaces for dermal fibroblasts adhesion and detachment" Workshop of Young European Scientists YES, Kraków, 07-11.09.2014 22
Postery na konferencjach krajowych i zagranicznych N. Oleszko, M. Jamróz-Piegza, B. Trzebicka, A. Dworak "Polyethers nanogels for encapsulation of hydrophobic nanoparticles" Career in Polymers, Praga, 5-7.07.2009 N. Oleszko, A. Utrata-Wesołek, W. Wałach, A. Dworak "Temperature-responsive poly(2-oxazoline) surfaces" Polimery nad Odrą (POLYOR), Opole, 6-7.03.2011 A. Marcinkowski, W. Wałach, N. Oleszko, A. Utrata-Wesołek, A. Dworak Analiza AFM termowrażliwych powierzchni poli(2-izopropylo-2-oksazoliny) 55 Zjazd PTChem i SITPChem, Białystok, 16-20.09.2012 N. Oleszko, W. Wałach, A. Utrata-Wesołek, B. Trzebicka, A. Dworak, J. Anioł, A.L. Sieroń, A. Klama-Baryła, M. Kawecki "Poly(2-substituted-2-oxazoline) surfaces with controlled properties for cell sheet engineering" Precision Polymer Materials (P2M) Summer School, San Feliu de Guixols, Hiszpania, 24-28.09.2012 N. Oleszko, A. Utrata-Wesołek, W. Wałach, B. Trzebicka, A. Dworak, J. Anioł, A.L. Sieroń, A. Klama-Baryła, M. Kawecki "Surfaces of temperature-responsive (co)poly(2-oxazoline)s a way to cell sheet engineering" Frontiers in Polymer Science, Sitges, Hiszpania, 21-23.05.2013 N. Oleszko, A. Utrata-Wesołek, W. Wałach, B. Trzebicka, A. Dworak, J.Anioł, A.L. Sieroń, A. Klama-Baryła, M. Kawecki "Novel thermoresponsive poly(2-oxazoline) surfaces obtained via grafting to method" Soft Control, Darmstadt, Niemcy, 22-24.09.2013 B. Trzebicka, Ł. Otulakowski, E. Haladjova, N. Oleszko, W. Wałach, S. Rangelov, A. Dworak "PIPOx/PNIPAM mixed mesoglobules covered with PNIPAM shell" Precision Polymer Materials (P2M) Winter school, Zakopane, 13-17.01.2014 E. Haladjova, Ł. Otulakowski, N. Oleszko, W. Wałach, S. Rangelov, A. Dworak, B.Trzebicka "Preparation of stable PIPOx/PNIPAM mixed mesoglobules and their use as core-templates" EUPOC 2014 on Precision Polymers, Gargnano - Lake Garda, Włochy, 25-29.05.2014 N. Oleszko, A. Utrata-Wesołek, W. Wałach, M. Libera, U. Szeluga, M. Domański, B. Trzebicka, A. Dworak "Crystallization of poly(2-isopropyl-2-oxazoline) in organic solutions" POLYMAT 60 (Silesian Meetings On Polymer Materials), Zabrze, 30.06-1.07.2014 B. Trzebicka, Ł. Otulakowski, E. Haladjova, N. Oleszko, W. Wałach, S. Rangelov, A. Dworak Nanocząstki o powłoce PNIPAM i rdzeniu z mezoglobul PNIPAM/PIPOx 57 ZJAZD PTCHEM I SITPCHEM, Częstochowa, 14-18.09.214 N. Oleszko, A. Utrata-Wesołek, W. Wałach, B. Trzebicka, A. Dworak "Polyglycidol and poly(2-substituted-2-oxazoline) surfaces, their properties and applications" 8th ECNP International Conference on Nanostructured Polymers and Nanocomposites, Drezno, Niemcy, 16-19.09.2014 B. Trzebicka, Ł. Otulakowski, E. Haladjova, N. Oleszko, W. Wałach, S. Rangelov, A. Dworak "PNIPAM/PIPOx mesoglobules as cores of thermoresponsive nanoparticles" POLYMAT60 (Silesian Meetings On Polymer Materials), Zabrze, 30.06-1.07.2014 23
A. Utrata-Wesołek, N. Oleszko, W. Wałach, B. Trzebicka, A. Klama-Baryła, D. Hoff- Lenczewska, M. Kawecki, A. Dworak "Thermoresponsive poly(2-isopropyl-2-oxazoline) based semi-crystalline surfaces for skin cell culture" POLYMAT60 (Silesian Meetings On Polymer Materials), Zabrze, 30.06-1.07.2014 24