Rola chromatyny w regulacji ekspresji genów Monika Zakrzewska-Płaczek monika.z@ibb.waw.pl
Co oznacza epigenetyka? Epigenetyczna regulacja ekspresji genów = zmiana ekspresji genu, która zachodzi bez zmiany sekwencji DNA Dosłownie, słowo epigenetyka oznacza powyżej genetyki Transkrypcja Jest to informacja pozagenowa, nie dotycząca samej sekwencji, ale kowalencyjnych modyfikacji DNA i zmian struktury chromatyny wyciszanie epigenetyczne komórki (organizmy) identyczne genetycznie Różne epigenetyczne modyfikacje prowadzą do różnych wzorów ekspresji genów różne fenotypy W praktyce, epigenetyka opisuje zjawiska, dzięki którym w identycznych genetycznie komórkach lub organizmach dochodzi do różnego sposobu ekspresji genów czego efektem są różnice fenotypowe. 2
Struktura chromatyny ~147 bp DNA jest owinięty wokół oktameru białek histonowych + 50bp DNA łącznikowego + histon H1 ~ 147 bp DNA + 8 histonów: 2x H2A H2B H3 H4 3
Struktura chromatyny struktury 3 (oddziaływania między włóknami chromatyny) struktury 2 maksymalnie upakowane (np. włókno 30nm) struktury 2 H2A H4 H3 nukleosomy H2B DNA Caterino & Hayes (2007) Nature 4
Struktura chromatyny: W mitozie cały DNA występuje jako heterochromatyna CENTROMER heterochromatyna konstytutywna stale obecna w komórce, nie zawiera genów (obszary centromerów i telomerów) fakultatywna pojawia się w jądrze okresowo i tylko w niektórych komórkach, prawdopodobnie zawiera geny nieaktywne w czasie niektórych faz cyklu komórkowego euchromatyna luźno upakowana forma chromatyny, zawierająca geny aktywne transkrypcyjnie 5
Heterochromatyna i euchromatyna tworzą obszary o różnej gęstości w jądrze komórkowym Euchromatin DAPI merge heterochromatyna centromerowa i przycentromerowa Immunolokalizacja z przeciwciałem anty-h2a.z w komórkach liści A. thaliana 6 Deal, R.B., Topp, C.N., McKinney, E.C., and Meagher, R.B. (2007) Plant Cell
Mechanizmy epigenetyczne kontroli ekspresji genów metylacja DNA potranslacyjne modyfikacje histonów przebudowa chromatyny zależna od ATP warianty histonów ncrna histony chromatyna DNA Dulac C. (2010) Nature 7
Metylacja DNA metylacja DNA potranslacyjne modyfikacje histonów przebudowa chromatyny zależna od ATP warianty histonów ncrna histony chromatyna DNA Dulac C. (2010) Nature 8
Metylacja DNA NH2 N N O ~ cytozyna NH2 N N O ~ CH3 5-metylocytozyna DNA może być kowalencyjnie modyfikowany w reakcji metylacji cytozyny: wyst. u ssaków i roslin, ale nie u niższych zwierzat czy drożdży 5-metylocytozyna TTCGCCGACTAA Rola metylacji DNA: imprinting, inaktywacja chromosomu X, rozwój embrionalny, represja sekwencji powtórzonych i transpozonów 9
Metylotransferazy DNA u Arabidopsis thaliana MET1 (METHYLTRANSFERASE1) 5'-CG-3 i 5 -CNG-3 wyciszanie transpozonów, powtórzeń DNA, piętnowanie niektórych genów CMT3 (CHROMOMETHYLASE3) 5'-CHG-3' (H= A, C lub T) specyficzna dla roślin może być rekrutowana przez metylotransferazę histonową SUVH4 (KYP), a więc odpowiadać na modyfikację białek histonowych DRM1/ DRM2 (DOMAINS REARRANGED 1/2) 5'-CHH-3' metylacja de novo DRM2 metylacja powtórzeń DNA wyciszanych przez sirna 10
Metylotransferazy DNA (DNMT) metylotransferaza DNA 1 de novo: metylotransferaza DNA 3A metylotransferaza DNA 3B 11
Usuwanie grup metylowych - demetylacja Law & Jacobsen (2010) Nat Rev Genet 12
Metylacja CG (symetryczna) może być przenoszona podczas replikacji DNA 5 A T G C G T A C T A T G C G T A C T T A C G C A T G A MET1 A T G C G T A C T T A C G C A T G A 3 T A C G C A T G A A T G C G T A C T METYLACJA ZACHOWAWCZA A T G C G T A C T T A C G C A T G A T A C G C A T G A 13
Asymetryczne miejsca metylacji: CHH (H= A, C lub T) A T G C A A A C T 5 A T G C A A A C T 3 T A C G T T T G A T A C G T T T G A A T G C A A A C T T A C G T T T G A } konieczna jest dodatkowa informacja do ponownej metylacji DNA Metylacje w miejscach asymetrycznych są utrzymywane (i inicjowane) dzięki informacji zawartej w odpowiednich modyfikacjach białek histonowych, na drodze mechanizmu metylacji DNA zależnej od RNA (RNA-directed DNA Methylation, RdDM) 14
Metylacje cytozyny w niektórych miejscach są utrzymywane przez sirna RdDM A T G C A A A C T 5 A T G C A A A C T 3 T A C G T T T G A T A C G T T T G A A T G C A A A C T T A C G T T T G A A T G C A A A C T T A C G T T T G A sirna DRM2 15
Głównym celem metylacji cytozyn jest wyciszenie transpozonów i powtórzeń DNA Nie wszystkie transpozony są wyciszane na drodze mechanizmu RNAi GENY A. thaliana TRANSPOZONY demetylaza H3K9 KYP (SUVH4) H3K9 metylotransferaza DDM1 ATPaza z rodziny SNF2; przebudowa chromatyny Do zmetylowanego DNA przyłączają się białka z domeną MBD (methyl-cpg binding domain), do których z kolei wiąże się kompleks deacetylazy histonowej, co prowadzi do kondensacji chromatyny i represji ekspresji genów; mogą się również przyłączać metylotransferazy histonowe 16 Texeira & Colot (2009) EMBO J.
Potranslacyjne modyfikacje białek histonowych metylacja DNA potranslacyjne modyfikacje histonów przebudowa chromatyny zależna od ATP warianty histonów ncrna histony chromatyna DNA Dulac C. (2010) Nature 17
Modyfikacje białek histonowych wpływają na zmiany struktury chromatyny DNA oktamer histonowy NUKLEOSOM Końce N białek histonowych (tzw. ogony histonowe) wystają poza nukleosom, są dostępne dla enzymów modyfikujących 18
Modyfikacje białek histonowych wpływają na zmiany struktury chromatyny DNA oktamer histonowy Modyfikacje histonów: (kod histonowy) acetylacja (Ac) metylacja (Me) fosforylacja (P) ubikwitynacja (Ub) sumoilacja (Su) W zalezności od miejsca w/w modyfikacji mogą one przyczyniać się do aktywacji lub inaktywacji transkrypcji 19
Modyfikacje białek histonowych wpływają na zmiany struktury chromatyny S/T kinazy fosfatazy -P S/T fosforylacja K acetylotransferazy histonowe (HAT) deacetylazy histonowe (HDAC) -COCH3 K acetylacja K/R metylotransferazy demetylazy -CH3 K/R metylacja 20
Known post-translational modifications and the amino acid residues they modify 21 Latham J. A., Dent S. Y. R. (2007) Nat. Struct. Mol. Biol.
Acetylacja lizyny białek histonowych seria acetylo-lizyn (bardziej obojętne niż dodatnio naładowane lizyny) na ogonach histonów osłabia interakcje elektrostatyczne miedzy histonami a DNA, co pozwala na rozluźnienie struktury chromatyny inne funkcje: regulacja naprawy DNA poprzez przebudowę chromatyny; acetylowane lizyny są wtedy miejscami przyłączenia dla białek przebudowujących chromatynę (poprzez bromodomenę) + NH3 lizyna (K) N O CH3 acetylowana lizyna (KAc) za acetylację odpowiedzialne sa acetylotransferazy (HAT), a donorem grupy acetylowej jest acetylo-coa acetylacja jest odwracalna; deacetylację przeprowadzaja deacetylazy (HDAC) K acetylotransferazy histonowe (HAT) deacetylazy histonowe (HDAC) -COCH3 K 22
Metylacja białek histonowych metylacja lizyny powoduje zwiekszenie hydrofobowego i kationowego charakteru tej reszty aminokwasowej; w zależnosci od enzymu lizyna może byc mono, di lub trimetylowana. metylowana lizyna Mono (Kme1) Di (Kme2) + NH2 + NH CH3 CH3 CH3 za metylację odpowiedzialne są metylotransferazy (HMT) zawierające domenę SET, a donorem grupy metylowej jest S-adenozylometionina (SAM) lub S- adenozylohomocysteina (AdoHcy); metylacja H3K79 katalizowana jest przez Dot1 spoza rodziny Set Tri (Kme3) + N CH3 CH3 CH3 usuniecie grup metylowych: wymiana nukleosomów, modyfikacje chemiczne zmetylowanych reszt lub enzymatyczna demetylacja K/R metylotransferazy demetylazy -CH3 K/R 23
Fosforylacja białek histonowych Fosforylacje seryn H3S10 i H3S28 niezbedne są do kondensacji chromosomów i prawidłowej mitozy; także pozytywna rola w aktywacji transkrypcji: hamuje metylację H3K9 i promuje acetylację lizyn położonych w jej sąsiedztwie Zidentyfikowano ufosforylowane seryny na wszystkich histonach (fosforylacja wariantu H2A niezbedna jest w aktywacji naprawy DNA i regulacji cyklu komórkowego po uszkodzeniu DNA) S/T kinazy fosfatazy -P S/T 24
Przykład modyfikacje H3 H3 Me Me P Ac Me Ac Ac Me Me P A R T K Q T A R K S T G G K A P R K Q L A T K A A R K S 4 9 10 14 1718 23 262728 Koniec N histonu H3 jest często modyfikowany (w jednym lub kilku miejscach), co przyczynia się do aktywacji lub inhibicji transkrypcji. 25
Przykład modyfikacje H3 H3 Me Me P Ac Me Ac Ac Me Me P A R T K Q T A R K S T G G K A P R K Q L A T K A A R K S 4 9 10 14 1718 23 262728 Koniec N histonu H3 jest często modyfikowany (w jednym lub kilku miejscach), co przyczynia się do aktywacji lub inhibicji transkrypcji. Lizyna może być acetylowana lub mono-, di-, lub tri-metylowana + NH3 lizyna (K) N O CH3 acetylowana lizyna (KAc) metylowana lizyna Mono (Kme1) Di (Kme2) Tri (Kme3) + NH2 + NH + N CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 26
Modyfikacje białek histonowych zmieniają strukturę chromatyny H3 Me P Ac K4 S10 K14 H3 Me K9 Me P K27 S28 27
Mechanizm działania modyfikacji potranslacyjnych białek histonowych Działanie bezpośrednie: zmiany w oddziaływaniach histon-dna i histon-histon Działanie pośrednie: rekrutacja białek rozpoznających określone modyfikacje histonów Kozaurides 2007 28
Inne modyfikacje białek histonowych występują w sekwencjach genów kodujących białka, inne w sekwencjach transpozonowych Analiza typu ChIP-chip gen mrna H3K4me metylacja H3K4 występuje w genach aktywnie transkrybowanych H3K9me Me-C transpozon metylacja H3K9 jest związana z metylowanym DNA (Me-C) i transpozonami czerwony = silna korelacja zielony = słaba korelacja Lippman, Z., Gendrel, A.-V., Black, M., Vaughn, M.W., Dedhia, N., McCombie, W.R., Lavine, K., Mittal, V., May, B., Kasschau, K.D., Carrington, J.C.,Doerge, R.W., Colot, V., Martienssen, R. (2004) Nature 29
30 Barth T. K., Imhof A. (2010) Trends in Biochemical Science
H3K27me3: w genach kodujących białka Analiza typu ChIP-chip niebieski = geny czerwony = powtórzenia DNA H3K27me3 u A. thaliana występuje w rejonach bogatych w sekwencje kodujące zielony = H3K27me3 fioletowy = metylocytozyna 31 Zhang, X., Clarenz, O., Cokus, S., Bernatavichute, Y.V., Pellegrini, M., Goodrich, J., Jacobsen, S.E. (2007) PLoS Biol.
Metylacja H3K27me3: kompleks PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) Polycomb Repressive Complex 2 H3K27me3 geny aktywne geny wyciszone 32
Białka rdzenia kompleksu PRC2 u Drosophila PRC2 u D. melanogaster: 4 zakonserwowane ewolucyjnie białka E(Z) ESC SU(Z)12 NURF55 Enhancer of zeste (E(Z)) Extra sex comb (ESC) Suppressor of zeste 12 (SU(Z)12) NURF55 33 Simon J. A., Kingston R. E. 2013 Mol Cell
Białka rdzenia kompleksu PRC2 u Arabidopsis Drosophila PRC2 E(Z) (methylase) ESC SU(Z)12 NURF55 Arabidopsis PRC2 CURLY LEAF (CLF) MEDEA (MEA) SWINGER (SWN) FERTILIZATION INDEPENDENT ENDOSPERM (FIE) FERTILIZATION- INDEPENDENT SEED 2 (FIS2) EMBRYONIC FLOWER 2 (EMF2) MULTICOPY SUPPRESSOR OF IRA1 (MSI1,2,3,4,5) VERNALIZATION 2 (VRN2) 34
U roślin: różne kompleksy PRC2 odgrywają różne role MEA + FIS2 kiełkowanie indukcja kwitnienia CLF/SWN + VRN2 CLF/SWN + EMF2 rozwój kwiatów 35
Metylacja H3K27me3 u zwierząt jest utrzymywana przez PRC1 Polycomb Repressive Complex 2 Polycomb Repressive Complex 1 H3K27me3 H3K27me3 geny aktywne geny wyciszone geny stabilnie wyciszone 36 Simon J. A., Kingston R. E. 2013 Mol Cell
PRC1-like u roślin działa podobnie Polycomb Repressive Complex 2 PRC1-like H3K27me3 LHP1 H3K27me3 geny aktywne geny wyciszone geny stabilnie wyciszone LHP1 wiąże specyficznie H3K27me3 37
LHP1 występuje razem z metylacją H3K27me3 Analiza typu ChIP-chip silna korelacja występowania LHP1 i H3K27me3 38 Turck F, Roudier F, Farrona S, Martin-Magniette M-L, Guillaume E, et al. 2007 PLoS Genet
LHP1 występuje razem z metylacją H3K27me3 Analiza typu ChIP-chip transpozon metylowany H3K9me2! 39 Turck F, Roudier F, Farrona S, Martin-Magniette M-L, Guillaume E, et al. 2007 PLoS Genet
Mechanisms of repression by PRC1 family complexes 40 Simon J. A., Kingston R. E. 2013 Mol Cell
Przebudowa chromatyny zależna od ATP (chromatin remodelling) metylacja DNA potranslacyjne modyfikacje histonów przebudowa chromatyny zależna od ATP warianty histonów ncrna histony chromatyna DNA Aktywność kompleksów przebudowujących chromatynę zależy od ATP, w wyniku ich działania zmienia się sposób oddziaływania histon-dna. Kompleksy remodelujące zaangażowane są zarówno w aktywację, jak i represję transkrypcji. Dulac C. (2010) Nature 41
Przebudowa chromatyny: przesunięcie oktameru histonowego usunięcie oktameru histonowego odsłonięcie DNA rozwinięcie nici DNA zamiana dimeru H2A-H2B na H2A.Z-H2B (Htz1 u S. cerevisiae) usunięcie dimerów H2A-H2B zmiana składu oktameru histonowego 42 Clapier C. R., Cairns B. R. 2009 Annu Rev Biochem
Wyróżniamy cztery rodziny kompleksów odpowiedzialnych za przebudowę chromatyny: SWI2: zawieraja bromodomenę, wszystkie rodzaje przebudowy chromatyny ISWI: przesuwanie nukleosomów CHD: zawieraja chromodomene, regulacja transkrypcji INO80/SWR: wymiana histonów 43 Clapier C. R., Cairns B. R. 2009 Annu Rev Biochem
Kompleksy przebudowujące chromatynę składają się z wielu białkowych podjednostek Drożdżowy SWI/SNF: 11 białek potrzebny do ekspresji genów decydujących o typie koniugacyjnym drożdży (switching), oraz ekspresji genów regulujących metabolizm sacharozy (sucrose non-fermenting) 44
DDM1 (decrease in DNA methylation1) : ATPaza z rodziny SWI/SNF u A. thaliana DDM1 jest specyficznie zaangażowana w metylację transpozonów GENY A. thaliana TRANSPOZONY demetylacja H3K9 KYP (SUVH4) H3K9 metylotransferaza DDM1 ATPaza z rodziny SNF2; remodeling chromatyny DDM1 jest kluczowym czynnikiem łączącym przebudowę chromatyny i wprowadzanie/utrzymywanie metylacji DNA 45 Texeira & Colot (2009) EMBO J.
Warianty histonów metylacja DNA potranslacyjne modyfikacje histonów przebudowa chromatyny zależna od ATP warianty histonów ncrna histony chromatyna DNA Za wymianę różnych wariantów histonów w oktamerze histonowym odpowiadają kompleksy przebudowujące chromatynę z rodziny INO80/SWR Dulac C. (2010) Nature 46
Warianty histonów: X-inactivation Talbert & Henikoff (2010) Nat Rev Mol Cell Biol 47
Histon H2A.Z: aktywacja transkrypcji gen nieaktywny gen aktywny kompleks SWR1/ SRCAP Obecność odmiany histonu H2 - H2A.Z sprzyja transkrypcji. Kompleks SWR1/SRCAP zamienia histon H2A na H2A.Z 48
Histon CENH3: centromery CENH3 H3 nukleosomy w centromerach zawierają wariant histonu H3: CENH3 (CENP-A u zwierząt) centromery zawierające CENH3 są otoczone obszarem bogatym w metylacje H3K9me2 (heterochromatyna przycentromerowa) 49 Jiang, J., Birchler, J.A., Parrott, W.A., and Dawe, R.K. (2003) Trends Plant Sci. Elsevier. Zhang, W., Lee, H.-R., Koo, D.-H., and Jiang, J. (2008) Plant Cell
Epigenetyczna regulacja ekspresji genów przez ncrna metylacja DNA potranslacyjne modyfikacje histonów przebudowa chromatyny zależna od ATP warianty histonów ncrna histony chromatyna DNA RNA jest jedynym jak dotąd poznanym czynnikiem inicjującym dziedziczenie epigenetyczne i odróżniającym sekwencje, które mają zostać wyciszone lub aktywowane Dulac C. (2010) Nature 50
Epigenetyczna regulacja ekspresji genów przez lncrna u ssaków niektóre lncrna (transkrypty polimerazy RNA II) rekrutują kompleksy wyciszające transkrypcję do odpowiednich rejonów genomu, zarówno in cis, jak in trans PcG- Polycomb group proteins G9a- metylotransferazy histonowe /H3K9/H3K27 XIST inaktywacja chromosomu X u ssaków (dosage compensation: wyrównanie poziomu ekspresji genów chromosomów X) 51 Chen & Carmichael (2010) Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA
Inaktywacja chromosomu X: wyciszanie epigenetyczne X XX X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X W każdej komórce ssaków płci żeńskiej, jedna kopia chromosomu X jest inaktywowana epigenetycznie. dosage compensation: wyrównanie poziomu ekspresji genów chromosomów X Kolor futra u kotów jest częściowo determinowany przez gen orange, zlokalizowany na chromosomie X. Heterozygotyczna kotka posiada mozaikowe zabarwienie futra: zależnie od chromosomu X podlegającego inaktywacji, w melanocytach dochodzi do ekspresji określonej formy melaniny: eumelanina czarno-brązowa feomelanina żółto-czerwona Photo credit: DrL 52
Inaktywacja chromosomu X: wyciszanie epigenetyczne Mus musculus: u samic od wczesnego etapu rozwoju zarodkowego na aktywnym chromosomie X ekspresja Tsix, na nieaktywnym ekspresja Xist John E. Froberg, Lin Yang, Jeannie e T. Lee (2013) Journal of Molecular Biology 17kb (u myszy; ludzki 19kb) ncrna XIST opłaszcza chromosom X tzw. ciałko Barra: skondensowana forma chromosomu X, głównie w postaci heterochromatyny 53
Inaktywacja chromosomu X: wyciszanie epigenetyczne RepA: 1,6kb ncrna zawierający sekwencje rejonu 5 transkryptu XIST bezpośrednio wiąże kompleks PRC2 54 John E. Froberg, Lin Yang, Jeannie T. Lee (2013) Journal of Molecular Biology
Inaktywacja chromosomu X: wyciszanie epigenetyczne XIST ncrna uruchamia zmiany epigenetyczne, które zapewniają pamięć komórkową stanu nieaktywnego: zamiana histonu H2A na makroh2a metylacja histonu H3: H3K9 H3K27 deacetylacja histonu H4 (?) metylacja DNA /już po inaktywacji chromosomu Ferrari F., Alekseyenko A.A., Park P.J., Kuroda M.I. (2013) Nat. Struct. Mol. Biol. 55
Epigenetyczna regulacja ekspresji genów przez ncrna kompensacja dawki chromosomów płciowych (dosage compensation) u Drosophila melanogaster rox rox1/rox2 ncrna inicjują modyfikacje histonów u samców Drosophila zwiększenie aktywności chromosomu X acetylacja histonów demetylacja H3K9 56 Ferrari F., Alekseyenko A.A., Park P.J., Kuroda M.I. (2013) Nat. Struct. Mol. Biol.
Transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS): hc-sirna małe RNA mogą hamować transkrypcję określonych genów poprzez kowalencyjne modyfikacje DNA lub białek histonowych transkrypcja białka histonowe Ten rodzaj wyciszenia jest często związany ze stale nieaktywnym transkrypcyjnie DNA, włączając rejony centromerowe i transpozony, ale również zachodzi w genach. DNA wyciszenie 57
Model mechanizmu metylacji DNA zależnej od RNA (RdDM- RNA-directed DNA methylation) chromatin remodelling GW/WG chromatin remodelling DDR elongation factor dsrna-binding protein 58
Epigenetyczne programowanie pomaga kontrolować zmiany faz rozwojowych u roślin zmiana fazy rozwojowej zmiana fazy rozwojowej rozwój zarodkowy rozwój wegetatywny rozwój generatywny Ekspresja FLC jest regulowana przez RdDM regulacja ekspresji FLC: antysensowny RNA komplementarny do rejonu 3 genu FLC transkrypcja antysens z 3 UTR prawdopodobnie przez polimerazę RNA IV regulacja ekspresji FLC: wymaga obecności DCL3, RDR2 i polimerazy RNA IV, transkrypcja przez polimerazę IV substrat dla DCL3 do produkcji sirna, które rekrutują kompleksy modyfikujące histony wyciszenie ekspresji genu FLC 59
DNA demethylation DNA methylation Histone acetylation Histone deacetylation Histone (de) methylation Histone (de) methylation Histone variants 60