Analiza środowiskowa, żywności i leków CHC 0307 l Ćwiczenie : Analiza próbek pochodzenia roślinnego - metale; analiza statystyczna Dobra Praktyka Laboratoryjna w analizie śladowej Oznaczanie całkowitych zawartości wybranych pierwiastków głównych (Ca, Mg) i śladowych (Ba, Cu, Fe, Mn, Ni, Zn) w materiale roślinnym z zastosowaniem atomowej spektrometrii emisyjnej plazmy sprzężonej indukcyjnie (ICP-OES) Przygotowanie badanego materiału do analizy Wysuszony do masy powietrznie suchej materiał roślinny rozdrobnić za pomocą moździerza agatowego. Do trzech zlewek o pojemności 50-00 cm 3 odważyć (z dokładnością do 0,000g) około g próbki i dodać 0 cm 3 stężonego kwasu azotowego(v). W czwartej zlewce przygotować tzw. ślepą próbę. Zlewki przykryć szkiełkami zegarkowymi i ogrzewać w łaźni piaskowej do całkowitego zaniku wydzielania się tlenków azotu. Po odparowaniu do około 0 cm 3, zawartość zlewek ostudzić, dodać kolejną porcję (0 cm 3 ) HNO 3 i ponownie ogrzewać. Pod koniec mineralizacji, roztwory ostudzić, dodać 5 cm 3 30% nadtlenku wodoru i ogrzewać do odbarwienia roztworu próbki (w razie potrzeby dodać kolejne porcje H O ). Po ostudzeniu, zawartość wszystkich zlewek (również ślepą próbę) przenieść ilościowo do kolb miarowych o pojemności 50,00 cm 3. Uzupełnić do kreski wodą destylowaną. Po dokładnym wymieszaniu roztworów, zawartość kolb przenieść do podpisanych pojemników polietylenowych, przesączając roztwory przez twarde sączki, jeżeli w kolbach będzie osad. Roztwory wzorcowe Krzywą kalibracji należy wyznaczyć w oparciu o 5 wielopierwiastkowch roztworów wzorcowych (0; 0,5; ; i 5 ppm), sporządzonych z roztworu wzorca wielopierwiastkowego o stężeniu 000 ppm, zakwaszone kwasem azotowym(v) w taki sposób, aby stężenie kwasu w końcowym roztworze wynosiło ok. 4%. Wyznaczenie zawartości pierwiastków w próbce Oznaczenie pierwiastków przeprowadzone zostanie przy wykorzystaniu sekwencyjnego spektrometru z indukcyjnie sprzężoną plazmą firmy Jobin Yvon JY38S. Spektrometr wyposażony jest w monochromator pracujący w układzie Czerny- Turnera oraz generator o częstotliwości 48,64 MHz i maksymalnej mocy wyjściowej,4 kw. Próbka podawana jest za pomocą pompki perystaltycznej (,0 ml/min) do nebulizera Meinharda umieszczonego w cyklonowej komorze mgielnej. Przepływy gazu plazmowego i chłodzącego wynoszą odpowiednio 3 i 0, l/min (standardowe parametry generowania plazmy). Rejestracja intensywności promieniowania przy wybranych długościach fal odbywa się fotoelektrycznie przy wysokości obserwacji mm nad cewką indukcyjną. W oparciu o intensywności wybranych linii (patrz Tabela zamieszczona na następnej stronie) zarejestrowanych dla roztworów wzorcowych, próbek oraz ślepych prób, wyznaczyć zawartości pierwiastków w mg/kg próbki.
Tabela. Wybrane spektralne linie analityczne oznaczanych pierwiastków Pierwiestek Dł. fali [nm] Ba II 33,57 Ca II 37, 933 Cu I 34,754 Fe II 59,940 Mg II 80,70 Mn II 59,373 Ni II,647 Zn I 3,856 Zastosowanie testu t (Studenta) do porównania dwóch wartości średnich otrzymanych dla Fe i Zn Przed wykonaniem testu t (Studenta), należy zbadać czy odchylenia standardowe obu serii nie różnią się istotnie. W tym celu, na podstawie testu Snedecora (testu F) sprawdza się, czy obliczona na podstawie poniższego wzoru wartość F x nie jest większa od F (P = 0,95; f, f ), gdzie: f, f liczby stopni swobody (f = n ; n - liczba wyników). s F x = s gdzie: s, s - odchylenia standardowe obu serii wyników, s > s Do porównania dwóch wartości średnich (testu t) przystępujemy wówczas, gdy spełniony jest warunek: F x < F (P = 0,95; f, f ). Przy założeniu rozkładu normalnego, w oparciu o test t (Studenta) należy sprawdzić, czy z prawdopodobieństwem P = 0,95 (dla poziomu istotności α = 0,05) i dla liczby stopni swobody f, różnica między dwiema wartościami średnimi jest nieistotna, tzn. czy spełniony jest warunek: t x < t (P = 0,95; f = f + f ), Wartość t x należy obliczyć w oparciu o wzór: gdzie: x x n n n t x = s, n +
x, x - wartości średnie dwóch serii wyników (otrzymane przez dwie grupy badające ten sam materiał roślinny), n, n - liczby wyników, s, - odchylenie standardowe różnicy dwóch wartości średnich, obliczone ze wzoru: s s s, = + n n Uwaga! Wartości krytyczne F i t (P = 95%, f, f ) należy odczytać z tabeli zamieszczonych na końcu instrukcji (Tabele 4 i 5). Przedstawienie wyników Zawartości poszczególnych pierwiastków w każdej próbce materiału badanego X, X, X 3 (w mg/kg) należy obliczyć w oparciu o krzywe wzorcowe wyznaczone metodą regresji liniowej. Wyniki analizy przedstawić w tabeli (Tabela ) w postaci średniej arytmetycznej ( X ) wraz z odchyleniem standardowym (S), w postaci mediany (M x ) oraz podać ich rozstęp (R). Na podstawie testu t (Studenta), dla Fe i Zn, porównać wartości średnie ( X ), otrzymane przez dwie grupy badające ten sam materiał roślinny. Wyniki przedstawić w formie tabeli (Tabela 3). Sprawozdanie powinno obejmować analizę i omówienie wielkości otrzymanych rozstępów wyników, różnic wynikających ze sposobu przedstawienia wyników analizy (w postaci mediany oraz średniej arytmetycznej) oraz wnioski dotyczące testowanych hipotez (test F i test t). Tabela. Przykładowa tabela zawierająca: całkowite zawartości pierwiastków w próbkach (X, X, X 3 ), średnie arytmetyczne wraz z odchyleniami standardowymi ( X ± S), mediany (M x ) oraz rozstępy wyników (R) Pierwiastek Ca Mg Ba Cu Fe Mn Ni Zn [mg/kg] X, X, X 3 X ± S M x R Tabela 3. Przykładowa tabela zawierająca otrzymane wartości F x i t x oraz wartości krytyczne F i t (P = 0,95; f, f ), odczytane z tablic dla odpowiednich stopni swobody f i f Pierwiastek F x F (P = 0,95; f,f ) t x t (P=0,95; f,f ) Fe 3
Zn Zadania do wykonania - SPRAWOZDANIE: ) przygotowanie próbki pochodzenia roślinnego do pomiaru metodą ICP-OES; ) wyniki pomiarów intensywności promieniowania wybranych linii analitycznych dla roztworów wzorcowych, ślepej próby i próbek po mineralizacji analizowanego materiału; 3) analiza i opracowanie wyników: a) wyznaczenie stężeń (w mg/kg) badanych pierwiastków w próbkach, b) przedstawienie wyników w postaci średniej arytmetycznej wraz z odchyleniem standardowym, w postaci mediany oraz określenie wartości rozstępu wyników, c) porównanie wartości średnich arytmetycznych dla Fe i Zn (test Studenta), otrzymanych przez dwie grupy Studentów badające ten sam materiał roślinny, d) proszę wskazać elementy dobrej praktyki laboratoryjnej (ang. Good Laboratory Practice, GLP) zastosowane podczas wykonywania ćwiczenia oraz zaproponować inne działania i sposoby postępowania, które można (należy?) wprowadzić w celu uzyskania wiarygodnych, wysokiej jakości oznaczeń (ta część sprawozdania - jako realizacja Ćwiczenia - stanowi jego integralną część, wpływając na zaliczenie ćwiczenia). UWAGA! Bardzo proszę w obliczeniach uwzględnić dane dotyczące ślepych prób, a końcowe wyniki podać jako średnie arytmetyczne obliczone z danych dla wszystkich przygotowanych prób. LITERATURA:. Cygański A., Metody spektroskopowe w chemii analitycznej, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa 997. Doerffel K., Statystyka dla chemików analityków, Wydawnictwo Naukowo- Techniczne, Warszawa 989 3. Miller J.C., Miller J. N., Statistics for analytical chemistry, Ellis Horwood, New York 996 4. Konieczka P., Namieśnik J., Ocena i kontrola jakości wyników pomiarów analitycznych, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa 007 Tabela 4. Wartości krytyczne testu F (Snedecora) dla poziomu istotności α = 0,05 (wiersz górny) oraz α = 0,0 (wiersz dolny) 4
Tabela 5. Wartości krytyczne testu t (Studenta) dla poziomu istotności α = 0,05 oraz α = 0,0 5