Prezentuje: Magdalena Jasińska
W którym momencie w rozwoju embrionalnym myszy rozpoczyna się endogenna transkrypcja? Hipoteza I: Endogenna transkrypcja rozpoczyna się w embrionach będących w stadium 2-komórkowym Hipoteza II: Endogenna transkrypcja rozpoczyna się w embrionach będących w stadium 1-komórkowym Warto wiedzieć: α-amanityna - organiczny związek chemiczny. Należy do najsilniej działających toksyn w grzybach. Silnie wiąże się z polimerazą RNA II, blokując elongację podczas syntezy RNA, a także duże stężenie wpływa na polimerazę RNA III, Polimeraza RNA I jest niewrażliwa na jej działanie.
Hipoteza I: Endogenna transkrypcja rozpoczyna się w embrionach będących w stadium 2-komórkowym Wykazano, że: Wykrycie specyficznych dla pierwszych stadiów rozwoju białek jest możliwe we wczesnym i w późnym stadium 2-komórkowym Traktowanie α-amanityną embrionów w stadium 1-komórkowym nie wpływa na ich rozwój aż do osiągnięcia późnego stadium 2-komórkowego Wykrycie syntezy białek dziedziczonych od ojca jest możliwe od momentu osiągnięcia przez embrion stadium 2-komórkowego
Hipoteza II: Endogenna transkrypcja rozpoczyna się w embrionach będących w stadium 1-komórkowym Wykazano, że: Znajdujące się w przedjądrzach embrionu 1-komórkowego heterogenne jądrowe poli(a)-rna inkorporują na niskim poziomie [H 3 ]adenozynę Cytoplazma pochodząca z wyjądrzonego embrionu 1-komórkowego wzmacnia transkrypcję genów w jądrze pochodzącym z traktowanego α-amanityną embrionu 2-komórkowego Przejściowa ekspresja genu reporterowego wprowadzonego do przedjądrza męskiego metodą mikroiniekcji zachodzi na niskim poziomie w embrionach znajdujących się w późnym stadium 1-komórkowym Przynajmniej jeden gen ulega ekspresji w stadium 1-komórkowym (analiza bibliotek cdna z preimplantacyjnych zarodków)
MATERIAŁY I METODY C57/CBA X C57/CBA Wiek: 4-8 tygodni Indukcja hormonalna: PMSG, hcg Zapłodnienie - ok 12 hphcg Izolacja embrionów 17 hphcg Oczyszczenie w hialuronidazie (1mg/ml) Hodowla in vitro w pożywce Whitten s medium (Wm)
Embriony użyte do eksperymentu: Mikroiniekcja wybranych embrionów 100 mm BrUTP (ph 7.4, 140mM KCl) 1-5% objętości komórki Inkubacja 15 lub 60 minut (Temp. 37⁰C, 5%CO 2 ) Utrwalenie komórek i inkubacja z przeciwciałami
Przebieg eksperymentu Fig.1. Przebieg eksperymentu ukazany na osi czasu. Za referencję uznano moment indukcji hcg; Strzałkami oznaczono kolejne mikroiniekcje;
Przebieg eksperymentu Zapłodnienie Izolacja embrionów na odpowiednich stadiach rozwojowych Inkubacja w pożywce Wm α-amanityna Mikroiniekcja BrUTP Inkubacja 15 lub 60 minut w pożywce Wm Utrwalenie w 2%PFA w PBS (20min) Płukanie w PBS Permeabilizacja w PBS z 0,2% tritonem (15min) Rnaza A (400μg/ml) Płukanie w PBS lub Dnaza I (100μg/ml) Blokowanie w PBS z 2% BSA (1h) Płukanie w PBS Inkubacja z I-rzędowym, monoklonalnym przeciwciałem anty-brdu(3h) Płukanie w PBS Inkubacja z II-rzędowym przeciwciałem (1h) Płukanie w PBS Płukanie w PBS z Hoechst 33342 Ponowne utrwalenie w PBS z 2% PFA Płukanie w PBS
10μm Wyniki
10μm Wyniki
Zdjęcia preparatów zrobionych na fakultecie Embriologia Eksperymentalna 2006/2007
Podsumowanie wyników:
Podsumowanie wyników: W niektórych embrionach w późnym stadium 2-komórkowym po traktowaniu α-amanityną zaobserwowano fluorescencję w jąderkach Spośród 160 poddanych mikroiniekcji embrionów w późnym stadium 1-komórkowym: - 62% wykazywało jednolitą fluorescencję w obu przedjądrzach - 28% nie wykazywało żadnej specyficznej fluorescencji - 10% zygot wykazywało aktywność transkrypcyjną tylko w przedjądrzach męskich Spośród poddawanych mikroiniekcji embrionów pochodzących z tej samej myszy co godzinę w przedziale czasu 25-29 hphcg najwyższą proporcję zygot wykazujących aktywność transkrypcyjną tylko w męskim przedjądrzu odnotowano w stadium odpowiadającym 27hphCG (29%). Zygot wykazujących aktywność jedynie w żeńskm przedjądrzu nie zaobserwowano.
Wnioski Endogenna transkrypcja przez polimerazę II RNA rozpoczyna się w embrionach znajdujących się w późnym stadium 1-komórkowym prawdopodobnie podczas późnej fazy S lub G2 pierwszego cyklu komórkowego Miejsca transkrypcji rozmieszczone są w postaci licznych kropek na obszarze całej nukleoplazmy, co wskazuje na podobną do występującej w komórkach somatycznych przestrzenną organizację domen transkrypcyjnie aktywnych w chromatynie Męskie przedjądrze jako pierwsze rozpoczyna endogenną transkrypcję w embrionach jednokomórkowych Transkrypcja RNA w stadium 1- komórkowym nie prowadzi do uruchomienia genomu zarodkowego, ponieważ nie towarzyszy jej pojawienie się nowych białek syntetyzowanych w wyniku ekspresji genomu zarodkowego.
Dziękuję za uwagę!!