Joanna Bereta, Aleksander Ko j Zarys biochemii Seria Wydawnicza Wydziału Bio chemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Copyright by Wydział Bio chemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ Kraków 2009 Wydano przy wsp ółpracy Wydawnictwa EJB ISBN 978-83-88519-77-2 Recenzenci: prof. dr hab. Jadwiga Bryła prof. dr hab. Piotr Laid ler Korekta: Zespół Skład i łamanie: Janusz Bielec L A TEX Pro jekt okładki: EJB Na okładce wykorzystano komputerowo przetworzony obraz ekspresji genów Saccharomyces cerevisiae uzyskany meto dą mikromacierzy. Rysunki w tekście: autorzy Przygotowanie i druk skryptu finansowano ze śro dków Wydziału Bio chemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Wydanie pierwsze Drukarnia Patria, Kraków
Spis treści I Białka i enzymy 13 1 Aminokwasy i struktura białek 15 1.1. Własnościaminokwasów... 15 1.2. Organizacjaprzestrzennapolipeptydów... 17 1.3. Badaniabiałek... 19 1.4. Klasyfikacjabiałek... 22 1.5. Denaturacjabiałekinieprawidłowekonformacjebiałek... 23 2 Hemoglobina białko modelowe 26 2.1. Strukturabiałekwiążącychtlen... 26 2.2. Podjednostkowabudowahemoglobiny... 27 2.3. Krzywedysocjacjitlenudlamioglobinyihemoglobiny... 28 2.4. Własnościallosterycznehemoglobiny... 29 2.5. OdmianystrukturalneHbihemoglobinopatie... 31 3 Enzymy katalizatory białkowe 35 3.1. Krótkahistoriaenzymologii... 35 3.2. Enzymyirybozymy... 36 3.3. Zasadypostępowaniazenzymami... 37 3.4. Aktywnośćenzymuistosowanejednostki... 38 3.5. Zasadyimetodypomiaruszybkościreakcjienzymatycznej... 39 3.5.1. Zasadyoznaczaniaaktywnościenzymów... 39 3.5.2. Metody pomiaru szybkości reakcji enzymatycznych... 40 3.6. Przeciwciaładlaenzymóworazichzastosowanie... 41 3.6.1. WykrywaniebiałektechnikąWesternblotting... 41 3.6.2. Pomiar ilości wybranego białka metodą radialnej immunodyfuzji... 42 3.6.3. Pomiar ilości wybranego białka metodą immunoelektroforezy 43 3.6.4. Oznaczanie ilości wybranego białka techniką ELISA... 43 3.6.5. Wpływ wiązania białka enzymu z przeciwciałem na aktywnośćkatalityczną... 45 3.6.6. Katalityczneprzeciwciałaczyliabzymy... 45 4 Kinetyka i termodynamika reakcji enzymatycznych 47 4.1. Wpływstężeniaenzymunaszybkośćreakcji... 47 4.2. Wpływstężeniasubstratu,stałaMichaelisa... 48 4.3. PraktycznewyznaczaniewartościKm... 51 4.4. Kinetykaenzymówdziałającychnagranicyfaz... 53 4.5. WpływpHnareakcjeenzymatyczne... 54 4.6. Wpływtemperaturynareakcjeenzymatyczne... 56 4.7. Termodynamikareakcjienzymatycznych... 58
4 Spis treści 5 Klasyfikacja i przegląd enzymów 63 5.1. Zasadynazewnictwaiklasyfikacjienzymów... 63 5.2. Przeglądoksydoreduktaz... 64 5.3. Przeglądtransferaz... 65 5.4. Przeglądhydrolaz... 66 5.5. Przykładydziałanialiaz... 68 5.6. Przykładydziałaniaizomeraz... 69 5.7. Przykładydziałaniasyntetaz... 71 6 Budowa enzymów, koenzymy, witaminy 72 6.1. Centrumaktywneenzymu... 72 6.2. Niebiałkowe składniki struktury enzymu i reakcji enzymatycznych. 75 6.3. Witaminyjakoprekursorykoenzymów... 76 6.4. Przeglądkoenzymówiwitamin... 77 6.4.1. Koenzymy przenośnikielektronów:nad +,NADP +,FMN, FAD,liponian,glutation,askorbinian... 77 6.4.2. Koenzymy przenośniki grup funkcyjnych: pirofosforan tiaminy, biotyna, koenzym A, fosforan pirydoksalu, tetrahydrofolian,korynoidy... 81 7 Swoistość enzymów i mechanizmy katalizy 90 7.1. Typyswoistościenzymów... 90 7.2. Przykładyswoistościwśródgłównychgrupenzymów... 91 7.2.1. Swoistośćdehydrogenazitransferaz... 91 7.2.2. Swoistośćegzo-iendopeptydaz... 92 7.2.3. Proteasomirolaubikwityny... 95 7.2.4. Nietypowaliaza cystationaza... 96 7.3. Przykładymechanizmówkatalitycznychenzymów... 97 7.3.1. Działanieoksydoreduktaz... 97 7.3.2. Działaniehydrolazitransferaz... 99 7.3.3. Katalizakowalencyjnaproteinazserynowych... 99 7.3.4. Mechanizmdziałaniasyntetaz... 102 8 Aktywacja i hamowanie aktywności enzymów 104 8.1. Regulacja aktywności enzymów przez modyfikacje potranslacyjne: fosforylacja... 104 8.2. Aktywacja przez ograniczoną proteolizę: proenzymy czyli zymogeny 106 8.3. Kaskadowymechanizmkrzepnięciakrwi... 108 8.4. Inhibitoryenzymów... 111 8.4.1. Inhibitory współzawodniczące czyli kompetycyjne... 112 8.4.2. Inhibitory niewspółzawodniczące czyli niekompetycyjne.. 113 8.5. Przykładyważnychinhibitorów... 116 8.5.1. Czynnikichelatujące... 116 8.5.2. Związkiblokującegrupy SH... 116 8.5.3. Truciznyhemoprotein... 118 8.5.4. Inhibitoryorganofosforowe... 118 8.5.5. Różneinhibitorykompetycyjne... 119 8.6. Białkoweinhibitoryproteinaz... 120
Spis treści 5 9 Różnorodne formy enzymów 123 9.1. Enzymykonstytutywneiindukowane... 123 9.2. Enzymy oligomeryczne oraz mikroheterogeniczność enzymów... 123 9.3. Izoenzymy... 124 9.4. Układywieloenzymowe... 127 9.5. Enzymykluczowe... 130 9.6. Enzymyallosteryczneiichregulacja... 131 10 Subkomórkowe rozmieszczenie enzymów i przedziałowość komórki 135 10.1.Przedziałysubkomórkowe... 135 10.2.Metodykabadań... 137 10.3.Enzymymarkery znacznikifrakcjisubkomórkowych... 140 10.4. Oczyszczanie i własności wybranych frakcji subkomórkowych... 141 10.4.1. Izolowanie i oczyszczanie frakcji jąder komórkowych... 141 10.4.2.Izolowanieiwłasnościmitochondriów... 142 10.4.3.Izolowanieiwłasnościlizosomów... 142 10.4.4.Izolowanieiwłasnościperoksysomów... 145 10.4.5.Izolowanieiwłasnościmikrosomów... 146 11 Enzymy w biotechnologii i medycynie 149 11.1.Enzymytermostabilne... 149 11.2.Enzymyimmobilizowane... 151 11.3.Enzymywdiagnostyceklinicznejiterapii... 153 II Metabolizm 157 12 Metody badania metabolizmu 159 12.1.Definicjeiprzykładyprocesówmetabolicznych... 159 12.1.1.Organizmjakocałośćjestdomenąfizjologii... 160 12.1.2.Narządyizolowane... 160 12.1.3.Skrawkitkankowe... 161 12.1.4.Hodowlekomórkowe... 162 12.1.5.Homogenatytkankoweistrukturysubkomórkowe... 162 12.1.6.Izolowaneukładywieloenzymowe... 163 12.2.Mikrometodywbadaniachmetabolizmu... 163 12.2.1. Nurki Kartezjusza jako przykład mikrometody respirometrycznej... 163 12.2.2. Techniki chromatografii, elektroforezy, spektroskopii ispektrometriimasowej... 164 12.3.Zastosowanieradioizotopówwbiologiiimedycynie... 165 12.3.1.Rozcieńczenieizotopoweipomiarwielkościpuli... 165 12.3.2. Ilościowe pomiary szybkości syntezy i rozkładu białek invivo... 166 12.3.3.Metodaznaczonychatomów... 168 12.3.4. Pośrednie pomiary ilościowe z zastosowaniem radioizotopów 169
6 Spis treści 13 Związki wysokoenergetyczne i znaczenie fotosyntezy dla życia na ziemi 176 13.1.Rolazwiązkówwysokoenergetycznychwmetabolizmie... 176 13.2.Biologicznypotencjałredoks... 179 13.3.Fotosynteza... 180 13.3.1.Strukturachlorofilu... 180 13.3.2.Reakcjeświetlnefotosystemów... 181 13.3.3.AsymilacjadwutlenkuwęglaicyklCalvina(cyklC3)... 183 13.3.4.SzlakC4roślintropikalnych... 185 14 Utlenianie biologiczne 187 14.1.Mitochondrialnyłańcuchoddechowy... 187 14.1.1.KompleksyoddechoweGreena... 187 14.1.2.Mitochondrialneukładychinonu... 188 14.1.3.Białkażelazo-siarkowe... 189 14.1.4.Cytochromy... 191 14.1.5.Inhibitoryłańcuchaoddechowego... 191 14.1.6.Frakcjonowanieskładnikówmitochondriów... 192 14.1.7. Transport metabolitów przez błonę mitochondrialną ikomórkową... 193 14.2.Mechanizmoksydacyjnejfosforylacji... 197 14.2.1.Biochemicznateoriapośredników... 197 14.2.2.TeoriachemiosmotycznaMitchella... 200 14.2.3.TeoriakonformacyjnaBoyera... 202 14.3. Stany czynnościowe łańcucha oddechowego i jego biologiczne odmiany... 203 14.4.Transportelektronówwbłonachmikrosomowych... 206 15 Cykl kwasów trikarboksylowych cykl cytrynianowy 208 15.1.Organizacjaenzymówcyklucytrynianowego... 209 15.2.Regeneracjaszczawiooctanu... 211 15.3. Bilans energetyczny cyklu cytrynianowego jako wspólnej drogi końcowejmetabolizmu... 214 15.4.Bocznicemetabolicznecyklucytrynianowego... 215 15.5.Regulacjacyklucytrynianowego... 217 16 Metabolizm cukrów glikoliza 219 16.1.Budowaibiologicznarolacukrowców... 219 16.2.Odkryciemechanizmuglikolizyifermentacji... 221 16.3.Przebiegglikolizyfosforylującejifermentacji... 223 16.4. Odgałęzienia metaboliczne szlaku glikolizy i procesy regulacji... 226 16.5.Glukoneogeneza... 228 17 Metabolizm cukrów alternatywne szlaki i cykle 230 17.1.Szlakheksozomonofosforanowyicyklpentozowy... 230 17.2.Cyklglukuronowo-gulonowy... 231 17.3.Zestawieniegłównychdrógmetabolizmuglukozy... 232 17.4. Aktywne formy cukrów i ich znaczenie w procesach metabolicznych 234 17.5.Syntezałańcuchówcukrowychglikoprotein... 237
Spis treści 7 18 Metabolizm lipidów 239 18.1.Budowaifunkcjebiologicznelipidów,strukturabłon... 239 18.2.Utlenianiekwasówtłuszczowych... 240 18.3.Biosyntezakwasówtłuszczowych... 244 18.4.Biosyntezalipidów... 246 19 Metabolizm cholesterolu i steroidów 249 19.1.Cholesterolipochodnesteroidy... 249 19.2.Mechanizmiregulacjasyntezycholesterolu... 251 19.3.Rolacholesteroluwmiażdżycy... 253 20 Metabolizm aminokwasów 256 20.1.Biosyntezaaminokwasów... 256 20.2. Degradacja aminokwasów: deaminacja i losy jonów amonowych.. 260 20.3.Losyketokwasów pochodnychaminokwasów... 262 20.4.Funkcjonalnieważnemetabolityaminokwasów... 264 21 Metabolizm nukleotydów purynowych i pirymidynowych 269 21.1.Biosyntezanukleotydówpurynowych... 270 21.2.Biosyntezanukleotydówpirymidynowych... 272 21.3.Powstawaniedeoksyrybonukleotydów... 274 21.4.Degradacjakwasównukleinowych... 276 21.5.Degradacjapuryn... 276 21.6.Degradacjapirymidyn... 278 22 Zaburzenia metabolizmu uwarunkowane genetycznie 279 22.1. Przykłady chorób wywołanych mutacjami pojedynczych genów.. 279 22.2. Główne bloki metaboliczne na szlakach przemian fenyloalaniny ityrozyny... 280 22.2.1.Fenyloketonuria... 280 22.2.2.Tyrozynoza... 282 22.2.3.Alkaptonuria... 282 22.2.4.Kretynizmtarczycowy... 283 22.2.5.Albinizm... 283 22.3.Blokimetaboliczneprzemianróżnychaminokwasów... 283 22.4. Inne przykłady patologii molekularnych uwarunkowanych genetycznie... 283 22.4.1.Mukopolisacharydozy... 283 22.4.2.Zwłóknienietorbielowate... 285 III Informacjabiologiczna 287 23 Informacja biologiczna w epoce genomiki 289 23.1.Złożonycharakterinformacjibiologicznej... 289 23.2.Sekwencjonowaniegenomuieragenomiki... 292 23.3.Niekodująceirepetytywnesekwencjegenomu... 296
8 Spis treści 24 Biosynteza DNA i mechanizm replikacji 298 24.1.Semikonserwatywnymechanizmreplikacji... 298 24.2.Enzymatycznymechanizmreplikacji... 301 24.3.Replikacjatelomerów... 308 24.4.Inhibitoryreplikacji... 311 25 Organizacja chromatyny, cykl komórkowy, apoptoza, naprawa uszkodzeń DNA 313 25.1.Strukturachromatynyirolahistonów... 313 25.2.Cyklkomórkowyijegoregulacja... 315 25.3.Apoptoza:znaczeniebiologiczneimechanizm... 317 25.4.UszkodzeniainaprawaDNA... 320 26 Transkrypcja i dojrzewanie RNA 324 26.1.TransferinformacjigenetycznejzDNAnaRNA... 324 26.2.Transkrypcjawkomórkachprokariotycznych... 324 26.3.Transkrypcjawkomórkacheukariotycznych... 328 26.4.Inhibitorytranskrypcji... 331 26.5.RybosomowyRNA... 332 26.6.PrzenośnikowyRNA... 333 26.7.MatrycowyRNAijegodojrzewanie... 337 27 Translacja: mechanizm i regulacja 341 27.1.Kodgenetyczny... 341 27.2.Mechanizmtranslacji... 345 27.2.1.Zapoczątkowanietranslacji... 347 27.2.2. Wydłużanie łańcucha peptydowego i zakończenie translacji 352 27.3.Inhibitorytranslacji... 356 28 Potranslacyjne modyfikacje białek i ich losy w komórce 359 28.1. Wewnątrzkomórkowy transport białek oraz ich wydzielanie... 359 28.2.Potranslacyjnemodyfikacjebiałek... 362 29 Regulacja ekspresji genów 367 29.1.Strategieregulacyjne... 367 29.2.Regulacjaekspresjigenówubakterii... 368 29.2.1.Koncepcjaoperonu... 368 29.2.2.Ryboprzełączniki... 371 29.3.Regulacjaekspresjigenówueukariontów... 372 29.3.1.Adaptacjastrukturychromatyny... 372 29.3.2.Rolaczynnikówtranskrypcyjnych... 374 29.3.3.AktywacjaczynnikaNF-κB... 377 29.3.4.RegulacjastabilnościmRNAiprocesutranslacji... 379 29.3.5.RolaregulatorowychformRNAwekspresjigenów... 381 30 Immunoglobuliny model specyficznej regulacji ekspresji genów 384 30.1.Strukturaimmunoglobulin... 384 30.2.Mechanizmygenerująceróżnorodnośćprzeciwciał... 384
Spis treści 9 31 Integracyjna funkcja hormonów i cytokin 390 31.1.Hierarchicznastrukturaukładuendokrynnego... 390 31.2.Molekularnymechanizmdziałaniahormonówicytokin... 397 31.2.1.Działaniehormonówlipofilowych... 397 31.2.2.Działaniehormonówhydrofilowych... 399 31.2.3.Działaniecytokin... 405 32 Przekaz sygnału w komórce zwierzęcej 407 32.1. Rola struktur błonowych komórki w przekazie informacji biologicznej... 407 32.2. Sygnalizacja biologiczna wykorzystująca receptory błony komórkowej... 408 32.2.1.PrzekazsygnałuprzyudzialebiałekG... 408 32.2.2.Rolatlenkuazotuwprzekaziesygnału... 414 32.2.3. Produkty hydrolizy fosfolipidów w przekazie sygnału... 416 32.2.4. Metabolity kwasu arachidonowego w przekazie sygnału.. 416 32.2.5.Rolakinazbiałkowychwprzekaziesygnału... 420 33 Przekaz sygnału w systemie nerwowym 425 33.1.Dwojakicharakterimpulsunerwowego... 425 33.2.Główneneuroprzekaźniki... 427 33.3.Receptoryneuroprzekaźników... 428 33.4. Terapeutyczne efekty agonistów i antagonistów neuroprzekaźników 431 Skorowidz rzeczowy 432 Skorowidz nazwisk 456