Streszczenie rozprawy doktorskiej pt. The Role of Maf1 Protein in trna Processing and Stabilization / Rola białka Maf1 w dojrzewaniu i kontroli stabilności trna mgr Tomasz Turowski, promotor prof. dr hab. Magdalena Rakowska-Boguta U organizmów wyższych za ekspresję genomu odpowiadają trzy polimerazy RNA (Pol): Pol I, która transkrybuje rybosomalny RNA (rrna); Pol II transkrybująca mrna, kodujące funkcjonalne białka (tylko 5% RNA); oraz Pol III której produktami są liczne niekodujące RNA w tym trna stanowiące aż 15% całej puli RNA w komórce. trna dostarcza aminokwasy do aparatu biosyntezy białek, a zwiększenie jego ilości jest obserwowane w wielu typach nowotworów. Podobnie jak inne rodzaje RNA, ilość funkcjonalnego trna jest kontrolowana na poziomie transkrypcji, dojrzewania, transportu w komórce i degradacji. Badania dotyczące transkrypcji u eukaryota skupiały się do tej pory na regulacji syntezy mrna prze polimerazę II RNA (Pol II). W ostatnich latach również mechanizm kontroli Pol I i Pol III stał się przedmiotem badań wielu czołowych laboratoriów na świecie. Kluczowym elementem kontroli Pol III jest białko Maf1, odkryte u drożdży w zespole prof. M. Boguty, znane jako jedyny negatywny regulator Pol III pośredniczący w przekazywaniu zróżnicowanych sygnałów stresowych. Maf1 jest konserwowany w organizmach eukariotycznych. Ludzki homolog białka Maf1 także funkcjonuje jako represor Pol III, choć poza nim transkrypcję trna u ludzi hamują też białka p53 i retinoblastoma, znane jako supresory nowotworzenia. Po transkrypcji wszystkie rodzaje RNA ulegają wieloetapowemu dojrzewaniu, na które w przypadku trna składa się procesowanie 5` i 3` końców, wycinanie intronów i liczne modyfikacje nukleotydów. Ponieważ u drożdży kompleks odpowiedzialny za wycinanie intronów znajduje się na zewnętrznej membranie mitochondriów, pre-trna z dojrzałymi końcami musi zostać wyeksportowane z jądra. Za eksport pre-trna zawierających introny z jądra odpowiedzialne jest białko Los1. Po wycięciu intronów, ostatnich modyfikacjach zachodzących także w cytoplazmie i załadowaniu aminokwasami przez syntazy aminoacylotrna, dojrzałe trna jest gotowe do translacji. Ilość i jakość trna używanego do translacji jest monitorowana przez odpowiednie szlaki degradacji. To właśnie kontrola stabilności RNA jest jedną z podstawowych dróg regulacji poziomu ekspresji genów i tak np. wiele nowosyntetyzowanych transkryptów ulega natychmiastowej
degradacji i nigdy nie dociera do aparatu translacyjnego. Ograniczona ilość informacji dostępnych na temat szlaków degradacji trna i ich regulacji kontrastuje ze szczegółową wiedzą opisującą szlaki degradacji mrna. Jak dotąd, powiązanie transkrypcji i degradacji było opisane tylko w odniesieniu do mrna. Wykazano, że represja transkrypcji Pol II powoduje stabilizację mrna. Powstało więc pytanie, czy analogicznie, represja transkrypcji Pol III przez Maf1 będzie mieć wpływ na dojrzewanie i stabilizację trna. W pierwszej części pracy opisano wpływ Maf1 na obróbkę potranskrypcyjną trna oraz zidentyfikowano eksport pre-trna przez Los1 jako jeden z limitujących etapów w biosyntezie trna. W szczepie pozbawionym białka Maf1 obserwuje się zmianę w proporcjach niedojrzałych form pre-trna oraz nagromadzenie ogólnej puli trna, w szczególności pierwotnych transkryptów. Seria eksperymentów genetycznych i hybrydyzacji RNA typu Northern, a także eksperymenty z wykorzystaniem inhibitora transkrypcji, pozwoliły określić, że wpływ białka Maf1 na dojrzewanie pre-trna jest oparty na wysyceniu czynników procesujących i jest zależne od roli białka Maf1 jako negatywnego regulatora Pol III. Poszukiwanie limitujących etapów biogenezy trna doprowadziły do zidentyfikowania eksportu trna z jądra do cytoplazmy przez białko Los1 jako jeden z limitujących etapów dla biogenezy trna chociaż nie można wykluczyć wysycenia innych etapów dojrzewania trna w sytuacji podwyższenia transkrypcji spowodowanej brakiem białka Maf1. Wyniki te po raz pierwszy ukazują zależność między transkrypcją i dojrzewaniem trna. Najistotniejszym odkryciem opisanym w niniejszej pracy jest rola transkrypcji trna w kontroli stabilności trna. Są to badania nowatorskie w skali światowej nigdy wcześniej nie pokazano wpływu transkrypcji na degradację trna. Badania były prowadzone w układzie drożdżowym w którym komórki pozbawione są dwóch genów TRM4 i TRM8 kodujących transmetylazy modyfikujące trna. Brak genów TRM4 i TRM8 skutkuje brakiem części modyfikacji, co destabilizuje strukturę wybranych trna, w tym trna Val(AAC), i powoduje wrażliwość komórki na podwyższoną temperaturę. Jest to związane z degradacją trna Val(AAC) przez szlak szybkiej degradacji trna (RTD). Podsumowując, szczep trm4δtrm8δ nie rośnie w 37 C i obserwujemy w nim gwałtowne obniżenie poziomu trna Val(AAC) po przeniesieniu do temperatury 37 C. We współpracy z zespołem prof. Eric'a Phizicki'ego, odkrywcy szlaku degradacji RTD, wskazano na rolę białka Maf1 w kontroli stabilności trna. Obserwowano, że nadekspresja genu
kodującego Maf1 przywraca wzrost termowrażliwego szczepu trm4δ trm8δ w podwyższonej temperaturze i jest to związane ze stabilizacją hypomodyfikowanego trna Val(AAC). Ponieważ Maf1 jest jedynym znanym represorem Pol III u drożdży Saccharomyces cerevisiae, wynik ten wydawał się niespójny dlaczego obniżenie transkrypcji miałoby powodować zahamowanie degradacji? Nie powiodły się eksperymenty mające wykazać bezpośrednie oddziaływanie Maf1 w wiązanie trna i jego funkcję ochronną przed degradacją w stosunku do trna, dlatego wykorzystano szereg mutantów ze zmienioną aktywnością Maf1 (wzmocnioną lub osłabioną) lub zmienioną lokalizacją (tylko jądrową lub tylko cytoplazmatyczną). Analizy te wykazały, że stabilizację trna Val(AAC) w trm4δ trm8δ zapewniają tylko mutanty Maf1 o aktywnej lub hiperaktywnej funkcji represora Pol III. Wyniki te sugerowały, że wpływ Maf1 na RTD jest bezpośrednio związany z jego aktywnością jako negatywnego regulatora Pol III. By potwierdzić wpływ obniżenia transkrypcji na stabilizację trna, przygotowano szczep trm4δ trm8δ rpc128-1007 z hypomodyfikowanym trna Val(AAC) i zmniejszoną aktywnością Pol III. Mutacja, w drugiej co do wielkości podjednostce Pol III Rpc128, rpc128-1007 powoduje silne efekty zmniejszając poziom transkrypcji o połowę i obniżającą totalną pulę trna do 75%. W opisanym układzie doświadczalnym obserwowano przywrócenie wzrostu w podwyższonej temperaturze oraz znacznie obniżony poziom degradacji po inkubacji w 37 C. Doświadczenie to powtórzono w drugim układzie doświadczalnym, gdzie poziom innej podjednostki Pol III, Rpc17, był obniżony w szczepie syntetyzującym hypomodyfikowane trna Val(AAC) poprzez zastosowanie regulowanego promotora. Dodanie doksycykliny do pożywki pozwalało obniżyć ekspresję genu RPC17 i obniżyć aktywność Pol III. W tym układzie także obserwowano przywrócenie wzrostu w podwyższonej temperaturze oraz znacząco zmniejszony poziom degradacji trna Val(AAC) w 37 C. Wydawało się, że obniżenie aktywności Pol III i w konsekwencji zmniejszenie poziomu całkowitego trna w komórce, może prowadzić do stabilizacji trna, poprzez bardziej wydajne oddziaływanie z jakimś czynnikiem chroniącym hypomodyfikowane trna przed degradacją. By zidentyfikować domniemany czynnik lub czynniki chroniące niestabilne trna przed RTD wykonano klonowanie genów, które przywracały wzrost szczepu trm4δ trm8δ w podwyższonej temperaturze. Wśród sklonowanych genów dwa kodowały białka wiążące trna syntazę walilo-trna oraz czynnik elongacji translacji eef1a. Syntazy aminoacylo trna katalizują reakcję przyłączania aminokwasu do cząsteczki trna, natomiast eef1a wiąże aminoacylowane-
trna i dostarcza je do rybosomu. W szczepach z nadekspresją każdego z tych genów obserwowano stabilizację hypomodyfikowanego trna Val(AAC). Najprawdopodobniej jest to związane z bezpośrednim oddziaływaniem trna-białko, które chroni niestabilne trna Val(AAC) przed degradacją. Najważniejsze wyniki powtórzono także dla układu tan1δ trm44δ, w którym niestabilne jest trna Ser(CGA) i uzyskano spójne wyniki. Na podstawie przedstawionych wyników zaproponowano powyższy model stabilizacji hypomodyfikowanego trna, w którym stosunek trna do białek wiążących trna jest kluczowy dla bezpośredniej ochrony przez rybonukleazami szlaku RTD. Stabilizację hypomodyfikowanego trna można uzyskać poprzez zmniejszenie stosunku trna do białek wiążących trna. Stabilizacja hypomodyfikowanego trna może zostać osiągnięta dwojako: (1) przez zwiększenie poziomu białek bezpośrednio oddziałujących z niestabilnym trna, co
powoduje fizyczną ochronę przed degradacją lub (2) na drodze obniżenia globalnej puli trna poprzez zmniejszenie aktywności Pol III. W konsekwencji w obu przypadkach dochodzi do zmiany proporcji między trna, a białkami oddziałującymi z trna. Ochrona trna przed degradacją przez białka wiążące trna, szczególne eef1a, nie była wcześniej publikowana.