MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: 115-123 Zaprojektowanie i optymalizacja metody PCR z detekcją w czasie rzeczywistym do wykrywania DNA wirusa Epsteina-Barr z wykorzystaniem fluorescencyjnej sondy typu TaqMan Development of TaqMan-based real-time PCR assay for detection of Epstein-Barr virus DNA Natalia Żeber 1,2, Maciej Przybylski 2, Tomasz Dzieciątkowski 2, Ramona Andreea Bologa 1,3, Andreia Patrícia Machado Fino 1,4, Grażyna Młynarczyk 2 1 Wydział Ogrodnictwa, Biotechnologii i Architektury Krajobrazu, SGGW w Warszawie 2 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny 3 University of Medicine and Pharmacy of Craiova, Craiova, Rumunia 4 School of Health Sciences of the University of Minho, Braga, Portugalia Celem pracy było zaprojektowanie i optymalizacja metody real-time PCR, która mogłaby zostać wykorzystana do wykrywania i ilościowego oznaczania DNA wirusa Epsteina-Barr, zwłaszcza u osób z poddanych zabiegom przeszczepiania. Czułość i swoistość opracowanej metody, w połączeniu z szybkością oznaczenia, daje możliwość rutynowego jej stosowania, szczególnie u pacjentów narażonych na ryzyko powikłań po zakażeniu EBV. Słowa kluczowe: herpeswirusy, zakażenia potransplantacyjne, diagnostyka molekularna, real-time PCR ABSTRACT Introduction: Epstein-Barr virus (EBV) is a human herpesvirus which infects almost all of the world s population subclinically during childhood and thereafter remains for a life. Immunocompromised persons often show active EBV infection, which may progress to virus-associated lymphoproliferative disorders. Many clinical researches show a strong role for viral load measurement in predicting and monitoring EBV-associated diseases, especially in immunosuppressed patients. The aim of this work was to design and to optimize novel real-time PCR assay for detection and quantification of Epstein-Barr virus DNA. Materials and methods: In described experiment TaqMan chemistry-based primers and probes were designed to specific EBV sequence of BALF5 viral gene. To test laboratory utility
116 N. Żeber i inni Nr 2 of the designed method, 80 sera samples, positive for EBV DNA in routine investigations, were also analyzed and 1 st International WHO WBV Standard was applied for recalculation of the results to internatoional units. Results: Developed real-time PCR assay gave positive result only in the samples containing genetic material of EBV. Mean viral load of the 80 clinical samples tested was 2,838 and 3,241 log 10 copies/ml for analyzed and reference method, respectively. Correction with EBV Standard led to equalization of these results (3,229 and 3,244 log 10 international units/ml respectively). Conclusions: The obtained data indicate that this TaqMan-based qpcr assay is accurate, rapid and reliable method for the diagnosis and monitoring of EBV DNAemia in clinical samples, coming from immunosuppressed individuals. Key words: herpesviruses, post-transplant infections, molecular diagnostics, real-time PCR WSTĘP Wirus Epsteina-Barr (EBV), znany także pod nazwą wirusa ludzkiego herpeswirusa typu 4 (Human herpesvirus 4, HHV-4), zaliczany jest do rzędu Herpesvirales, rodziny Herpesviridae, podrodziny Gammaherpesvirinae i rodzaju Lymphocryptovirus (1). Do pierwotnego zakażenia EBV dochodzi najczęściej drogą powietrzno-kropelkową lub przez kontakt ze śliną, rzadziej drogą parenteralną (2,3). Wirus zakaża komórki nabłonkowe nosogardzieli oraz limfocyty B, które ze względu na stosunkowo długi okres życia stanowią dobry cel dla zakażenia latentnego. Replikacja EBV w pozostałych typach komórkach układu limfatycznego, takich jak limfocyty T czy komórki NK jest rzadka (3). Wyjątek stanowią stany limfohistiocytozy hemofagocytarnej (hemophagocytic lymphohistiocytosis - HLH), gdzie zakażone przez wirusa limfocyty T H1 i/lub makrofagi ulegają niespecyficznej aktywacji. Prowadzi to do wzmożonej produkcji cytokin prozapalnych burzy cytokinowej, a co za tym idzie uszkodzenia wielonarządowego (4). Bezobjawowe zakażenie EBV stwierdza się często we wczesnym dzieciństwie, a jedynym objawem mogą być wówczas podwyższone parametry enzymów wątrobowych (AlAT, AspAT). Typowe objawy zakażenia to gorączka gruczołowa, która pojawia się zazwyczaj u starszej młodzieży lub dorosłych. Szacuje się, że stanowią one około 30-50% wszystkich zakażeń objawowych powodowanych EBV (3,5). Okres inkubacji wynosi 30-50 dni, po czym mogą wystąpić objawy mononukleozy zakaźnej (IM - infectious mononucleosis): gorączka, powiększone węzły chłonne oraz zapalenie i ból gardła (5). Zakażenie obejmuje migdałki podniebienne, które pokrywają się białą wydzieliną. We krwi osób zakażonych wirusem obserwowane są komórki o nieprawidłowej morfologii w skrajnych przypadkach stwierdza się ponad 40% atypowych limfocytów oraz zwiększony poziom komórek CD8 +, odpowiedzialnych za wytwarzanie TNFα, IL-1β i IL-6 (5). Rzadko spotykane jest zakażenie przewlekłe EBV, gdzie wiremia utrzymywać się może do roku po zakażeniu. Sporadycznie mononukleoza może prowadzić do poważniejszych komplikacji, takich jak powiększenie śledziony czy przewlekła limfadenopatia (6).
Nr 2 Real-time PCR do wykrywania DNA wirusa EB 117 Wirus Epsteina-Barr jest patogenem istotnym z punktu widzenia biorców przeszczepów. Poprzeszczepowa choroba limfoproliferacyjna (PTLD - post-transplant lymphoproliferative disorder) występuje u pacjentów, u których dokonano zabiegu przeszczepienia komórek krwiotwórczych (HSCT - hematopoietic stem cell transplantation) albo narządów unaczynionych (SOT solid organ transplantation) (7). Ryzyko wystąpienia PTLD jest zależne od obecności przeciwciał przeciw EBV, rodzaju przeszczepu, rodzaju leczenia immunosupresyjnego oraz prawdopodobnie od współzakażenia wirusem cytomegalii, i dotyczy najczęściej osób po przeszczepieniu jelita oraz komórek krwiotwórczych pozbawionych limfocytów T (7,8). Ważnym problemem związanym z EBV jest jego bezpośredni wpływ onkogenny na zakażoną komórkę, co skutkować może powstawaniem szeregu nowotworów, których pojawienie się zależy od konkretnych czynników genetycznych gospodarza lub stosowania immunosupresji. Dla prawidłowego rozpoznania zakażeń o etiologii EBV niezbędne jest wykonywanie badań serologicznych i/lub wykorzystanie technik biologii molekularnej (3,9,10). Podstawowe badania opierają się na wykrywaniu przeciwciał klasy IgM skierowanych przeciw białkom wirusa oraz nieswoistych (heterofilnych) immunoglobulin M. W celu stwierdzenia obecności heterofilnych przeciwciał IgM stosuje się powszechnie test Monospot (aglutynacja końskich erytrocytów). Ma on jednak liczne wady, gdyż często występują w nim wyniki fałszywie ujemne oraz jest on wiarygodny głównie w grupie pacjentów w wieku ok. 16-24 lat. Sporadycznie w diagnostyce mononukleozy stosowane są także testy aglutynacji lateksowej Jednak dla poprawnej diagnostyki typu zakażenia EBV niezbędne są badania poziomu swoistych przeciwciał w klasach IgM oraz IgG, skierowanych przeciwko antygenowi jądrowemu (EBNA-1), antygenowi kapsydowemu (VCA) oraz antygenom wczesnym (EA). Należy pamiętać, iż przeciwciała w klasie IgG skierowane przeciwko antygenowi jądrowemu i/lub antygenowi kapsydu wirusa występują u około 90% populacji i są wyłącznie wyznacznikiem przebytego zakażenia wirusowego (3,9). Do diagnostyki zakażeń EBV wykorzystywane są także szybkie i czułe metody biologii molekularnej, takie jak PCR (3,10).W porównaniu do klasycznego PCR, technika PCR z detekcją w czasie rzeczywistym (qpcr) odznacza się wyższą czułością i swoistością. Jest także metodą mniej czaso- i pracochłonną, obarczoną znacznie mniejszym ryzykiem kontaminacji laboratorium produktem amplifikacji, umożliwia również precyzyjne określenie liczby kopii wirusowego DNA w materiale badanym (11). Celem pracy było opracowanie metody PCR z detekcją w czasie rzeczywistym do wykrywania DNA wirusa Epsteina-Barr, ustalenie jej podstawowych parametrów analitycznych oraz weryfikacja z użyciem materiału klinicznego. Dodatkowym założeniem pracy było wyznaczenie współczynnika dla przeliczenia uzyskanych wyników ilościowych na jednostki międzynarodowe z użyciem certyfikowanego materiału odniesienia (1st International WHO EBV Standard), co w założeniu ma umożliwić porównywanie uzyskanych wyników oznaczeń ilościowych między laboratoriami korzystającymi z różnych zestawów do wykrywania DNA EBV (12). MATERIAŁ I METODY Swoiste startery PCR oraz sondę hydrolizującą typu TaqMan, użyte w opisywanej metodzie (Tabela I), zaprojektowano przy pomocy oprogramowania LightCycler Probe
118 N. Żeber i inni Nr 2 Tabela I. Sekwencje sondy i starterów użytych w zaprojektowanej metodzie. Sekwencja 5 3 Zawartość par G+C [%] Temperatura topnienia [ 0 C] Starter 1 TCC TGC ACG CAG TAC AT 52.9 60.8 Starter 2 GGG CCA AGA AGG AGG AT 58.8 60.6 Sonda FAM AGA GGC GAG GAA TCT CCT TGT AAT 45.8 65.4 BHQ1 Design Software 2.0 (Roche Diagnostics ). Jako matrycy do wyboru sekwencji starterów i sondy, użyto sekwencji całogenomowego DNA EBV, szczep Dumas (GeneBank: X04370.1). Startery (Oligo ) powielają fragment regionu docelowego BALF5, będącego katalityczną podjednostką wirusowej polimerazy DNA o aktywności egzonukleazy wobec jednoniciowych form DNA. Powielany fragment miał długość 97 par zasad, natomiast komplementarna w obrębie produktu PCR sonda hydrolizująca typu TaqMan została wyznakowana na końcu 5 fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym FAM, a na końcu 3 wygaszaczem BHQ-1 (Oligo ). Reakcję łańcuchowej polimeryzacji w czasie rzeczywistym przeprowadzono w aparacie LightCycler 2.0 (Roche Applied Science ) z użyciem zestawu amplifikacyjnego LightCycler TaqMan Master (Roche Diagnostics ), zawierającego polimerazę DNA, trójfosforany deoksynukleotydów, chlorek magnezu oraz związki buforujące ph. Mieszanina reakcyjna o końcowej objętości 25 µl składała się z 12,5 µl mieszaniny amplifikacyjnej i zawierała po 0,5 µm każdego z dwóch starterów, 260 nm sondy, oraz 10 µl DNA. Parametry reakcji przedstawia tabela II. Pomiar poziomu fluorescencji odbywał się w każdym cyklu reakcji, przy długości fali λ = 530 nm, odpowiedniej dla fluoroforu FAM. Całkowite DNA izolowano przy użyciu aparatu Nuclisens EasyMAG (biomérieux ). Aparat posiada walidację dla referencyjnej metody wykrywania EBV DNA. Izolację przeprowadzono z objętości 200 μl odpowiednich materiałów, z użyciem protokołu Specific B, zgodnie z instrukcją wytwórcy, zawieszając wyizolowane DNA w końcowej objętości 50 μl wody. Ocenę tożsamości produktu PCR przeprowadzono sekwencjonując DNA izolowane z materiałów odniesienia oraz dwóch losowo wybranych szczepów klinicznych, powielonych z użyciem starterów przedstawionych w Tabeli I. Sekwencjonowanie wykonano metodą Sangera, a rozdział i analizę produktów sekwencjonowania przeprowadzono w analizatorze kapilarnym ABI 3130 (Applied Biosystems ). Na etapie sprawdzenia prawidłowości działania metody wykonano badania swoistości analitycznej, czułości analitycznej, powtarzalności, odtwarzalności, zakresu liniowości metody, dolnej granicy wykrywalności oraz dolnej i górnej granicy oznaczalności. Jako materiały odniesienia DNA EBV wykorzystano: (i) międzynarodowy standard EBV (1 st International WHO EBV Standard), (ii) materiał referencyjny pozyskany z Quality Control for Molecular Diagnostics (QCMD) oraz (iii) sztuczny konstrukt plazmidowy obejmujący wstawkę zawierającą kompletny gen BALF5 (Rekom Biotech ). Do oznaczeń swoistości włącznej zaprojektowanej metody użyto standardów DNA EBV opisanych powyżej, zaś jako kontrolę ujemną wykorzystano DNA wyizolowane z próbek surowicy nie zawierających DNA EBV (Negative Control Serum, BioRad). Kontrolami
Nr 2 Real-time PCR do wykrywania DNA wirusa EB 119 Tabela II. Parametry PCR w czasie rzeczywistym Proces Liczba cykli Temperatura [ 0 C] Czas trwania Inkubacja polimerazy DNA typu Hot-Start 1 95 10 min Denaturacja 45 95 10 sekund Hybrydyzacja starterów 60 10 sekund Wydłużanie nici 72 5 sekund Chłodzenie 1 40 60 sekund swoistości reakcji był DNA izolowany z bakterii Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecium, Escherichia coli i Klebsiella oxytoca oraz wirusów opryszczki typu 1 (HSV-1), opryszczki typu 2 (HSV-2), ospy wietrznej/półpaśca (VZV), cytomegalii (CMV), ludzkiego herpeswirusa typu 6 (HHV-6), ludzkiego parwowirusa B19, ludzkich adenowirusów typu 4, 5 i 12 oraz cdna wirusów Coxackie A i B. Granica wykrywalności wykrywalności metody została wyznaczona za pomocą algorytmu opisanego przez Burns i Valdiva (12), z użyciem rozcieńczeń wzorcowego DNA plazmidu zawierającego gen BALF5 EBV w jałowej, redestylowanej wodzie, zawierających 60, 100, 200, 400 i 600 kopii/ml. Zakres liniowości oraz granice oznaczalności wyznaczone zostały zgodnie z metodyką opisaną przez Huberta i wsp. (13), zastosowaniem seryjnych 10-krotnych rozcieńczeń plazmidu zawierającego plazmid BALF5 w zakresie od 6x10 1 do 6x10 6 kopii/ml. Ocenę przydatności metody do wykrywania DNA EBV w materiale klinicznym przeprowadzono z wykorzystaniem 80 próbek surowicy, pobranych od pacjentów Samodzielnego Publicznego Centralnego Szpitala Klinicznego z klinicznymi objawami mononukleozy zakaźnej lub poprzeszczepowej choroby limfoproliferacyjnej, w których wykryto DNA EBV metodą referencyjną (LightCycler EBV Quant Kit, Roche Diagnostics ). Posiadający status certyfikowanego materiału odniesienia, międzynarodowy standard EBV, rozcieńczony do miana 5 x 10 4 jedn. międzynarodowych/ml () w surowicy wzorcowej nie zawierającej EBV (Negative Control Serum, BioRad ), został użyty do wyznaczenia przelicznika umożliwiającego wyrażenie wyników ilościowych w jednostkach międzynarodowych/ml. Standard EBV był oznaczany obiema metodami, badaną i referencyjną, w 16 powtórzeniach. Porównania obu metod (badanej i referencyjnej) dokonano metodą wg. Blanda i Altmana (15). WYNIKI W opracowanej technice, wynik dodatni, wyrażony jako wykładniczy wzrost fluorescencji w mieszaninie reakcyjnej, osiągnięto tylko w próbkach zawierających DNA wyizolowane z materiałów referencyjnych QCMD oraz konstruktu plazmidowego zawierającego gen BALF5 wirusa Epsteina-Barr. W pozostałych próbkach, zawierających DNA ludzkie, DNA bakteryjne i wirusowe oraz cdna enterowirusów nie zaobserwowano wzrostu poziomu fluorescencji, co wskazuje na brak nieswoistej amplifikacji kwasu nukleinowego. Zbadana granica wykrywalności metody (LOD) dla reakcji wykrywającej DNA EBV wyniosła 320 kopii/ml surowicy krwi. Dla porównania, LOD komercyjnego zestawu LightCycler EBV Quant Kit (Roche) stosowanego jako metoda referencyjna, wynosi wg. danych producenta 229 kopii DNA wirusa/ml surowicy krwi oraz 359 kopii DNA wirusa/ml krwi pełnej. Dolna granica oznaczalności metody wyniosła 450 kopii/ml, natomiast górna
120 N. Żeber i inni Nr 2 Tabela III. Wyniki ilościowe dla próbek klinicznych (n=80) uzyskane opracowywaną metodą i metodą referencyjną Parametr Metoda opracowywana Metoda referencyjna Średnia logarytmiczna 2,838 log 10 kopii/ml 3,241 log 10 kopii/ml (liczba kopii/ml) (689 kopii/ml) (1742 kopii/ml) Błąd standardowy średniej 0,151 log 10 kopii/ml 0,088 log 10 kopii/ml 95% przedział ufności dla średniej 0,302 log 10 kopii/ml 0,175 log 10 kopii/ml Teoretyczne miano standardu EBV 4,699 log 10 () (50 000 ) Wyznaczone miano standardu (n=16) () Przelicznik dla wartości logarytmicznych Skorygowana średnia logarytmiczna () Błąd standardowy średniej skorygowanej 95% przedział ufności dla średniej skorygowanej 4,130 log 10 (13 490 ) 4,693 log 10 (49 318 ) 1,138 1,001 3,229 log 10 (1694 ) 3,244 log 10 (1754) 0,172 log 10 0,088 log 10 0,344 log 10 0,176 log 10 Rycina 1. Porównanie wartości uzyskanych przy użyciu metody badanej i referencyjnej; a) wartości przed korekcją za pomocą standardu międzynarodowego EBV; b) wartości skorygowane; linie oznaczone średnia +1,96 SD oraz średnia -1,96 SD reprezentują dolną i górną granicę zgodności dla wartości średnich granica oznaczalności 6 x 10 6 kopii/ml. Metoda zachowywała liniowość w całym zakresie oznaczalności (R 2 =0,979). W opisanych badaniach wykorzystano także materiał kliniczny w postaci DNA wirusa wyizolowanego z 80 próbek surowicy krwi, pochodzących od pacjentów Samodzielnego
Nr 2 Real-time PCR do wykrywania DNA wirusa EB 121 Publicznego Centralnego Szpitala Klinicznego w Warszawie, u których zdiagnozowano zakażenie o etiologii EBV. Najniższa liczba kopii DNA EBV zmierzona w próbkach surowicy za pomocą metody referencyjnej wynosiła 80 kopii/ml, najwyższa 5 241 000 kopii/ml, natomiast dla metody badanej, było to, odpowiednio, 34 i 2 010 000 kopii/ml. Średnia logarytmiczna z oznaczeń wyniosła 2,838 log 10 kopii/ml dla metody badanej (689 kopii/ml) oraz 3,241 log 10 kopii/ml dla metody referencyjnej (1742 kopii/ml). Teoretyczne miano standardu EBV wynosiło 50 000 (4,699 log 10 ), miano wyznaczone za pomocą metody badanej wynosiło 4,130 log10 (13 489 ), a za pomocą metody referencyjnej 4,693 log 10 (49 317 ). Zgodnie z założeniem, zastosowanie współczynników uzyskanych z oznaczeń standardu EBV dla przeliczenia wyników wyrażonych w kopiach/ml na doprowadziło do ujednolicenia wyników metody badanej i referencyjnej. Wyniki oznaczeń dla próbek klinicznych zestawiono w tabeli III. Analiza wg. Blanda i Altmana wykazała zadowalającą zgodność między wynikami uzyskanymi za pomocą obu metod. Różnice wykraczające poza granicę zgodności (±1,96 x odchylenie standardowe) dotyczyły głównie próbek zawierających mniej niż 100, czyli poniżej granic wykrywalności obu metod (Ryc. 1). DYSKUSJA Wirus Epsteina-Barr zaliczany jest do czynników zakaźnych o względnej patogenności, która uzależniona jest od stanu układu immunologicznego osoby zakażonej (2,6). Stanowi on jednak poważne zagrożenie u chorych z niedoborami odporności spowodowanymi zakażeniem HIV lub rozwiniętym AIDS, przeszczepieniem narządów unaczynionych i komórek krwiotwórczych oraz występowaniem chorób o podłożu onkologicznym (3,7,16). Zakażenie wirusem może nastąpić drogą kontaktową, na skutek przeszczepienia narządu albo komórek krwiotwórczych, oraz w wyniku przeniesienia wirusa wraz z narządem, krwią lub jako reaktywacja endogennego patogenu ze stanu latencji (3,16). Immunosupresja wyraźnie wpływa na rozwój zakażeń oportunistycznych, bowiem wśród osób immunokompetentnych zakażenia herpeswirusami, w tym i EBV, przebiegają zazwyczaj bezobjawowo lub łagodnie. W przypadku nieprawidłowo funkcjonującego układu odpornościowego lub silnego osłabienia organizmu, zakażenia takie mogą poważnie zagrażać życiu lub nawet prowadzić do zgonu chorego (3,7). Obserwuje się ponadto trudności związane z odróżnieniem zakażeń pierwotnych i wtórnych od reakcji GvHD (przeszczep przeciwko gospodarzowi). Aktywacja wirusów zapoczątkowuje lub zaostrza odrzucanie przeszczepu oraz, w przypadku EBV, może prowadzić do procesów rozrostowych (8,17). Ponadto obserwowane są trudności związane z leczeniem zakażeń i chorób wirusowych, ponieważ herpeswirusy mogą osiągać stan latencji ( uśpienia ). Leczenie immunosupresyjne lub zastosowanie terapii antyretrowirusowej (ang. highly active antiretroviral therapy, HAART) mogą osłabiać intensywność objawów zakażenia EBV (16). Dlatego ważne jest zaprojektowanie metody, która pozwoliłaby na wykrycie DNA wirusów we wczesnym etapie choroby. Niezbędna jest również prawidłowa optymalizacja warunków działania tej metody, służąca udowodnieniu, iż funkcjonuje ona zgodnie z postawionym jej zamierzeniem, w zadanych warunkach i w sposób powtarzalny, osiągając przy tym wysoką dokładność. Skuteczność techniki real-time PCR do wykrywania
122 N. Żeber i inni Nr 2 DNA EBV we krwi lub surowicy została potwierdzona w badaniach kilinicznych (10, 18); stwierdzono także, że wysoka czułość oraz specyficzność metody jest szczególnie istotna w diagnozowaniu chorób u osób z niedoborami immunologicznymi (3,4,17). Nieprawidłowe funkcjonowanie układu odpornościowego może bowiem wpływać na uzyskiwanie wyników fałszywie ujemnych w przeprowadzanych badaniach serologicznych (3). Na podstawie wymagań założonych przez literaturę dotyczącej metodologii walidacji i optymalizacji technik biologii molekularnej, swoistość metody określono jako stuprocentową. Czułość metody wykrywania EBV spełniła kryteria akceptacji (95%). Metoda daje powtarzalne i odtwarzalne wyniki podczas przeprowadzanych reakcji z DNA EBV. Odporność metody oszacowana na podstawie wartości współczynnika Horwitza (Horwitz ratio) wynosiła 1,179, czyli nieznacznie przekroczyła akceptowalną wartość 1. Rozbieżność jest spowodowana prawdopodobnie zbyt restrykcyjnym doborem skali pomiarów w badaniach odporności metody (±30% zamierzonego błędu w różnicach objętości przygotowywanych mieszanin reakcyjnych). Należy zaznaczyć, że metoda wykazuje większą odporność na błędy manualne w pomiarach prowadzonych z wykorzystaniem wyższych mian DNA EBV. Porównanie wyników oznaczeń ilościowych, uzyskanych w próbkach surowicy zawierających różne miana DNA EBV przy użyciu metody analizowanej i referencyjnej, wykazało znaczącą różnicę w średnich logarytmicznych uzyskanych za pomocą obu metod (P=0,02, test t-studenta). Jednak, jak zakładano, zastosowanie współczynnika uzyskanego z pomiarów standardu EBV WHO umożliwiło usunięcie rozbieżności wyników (P=0,934 w teście t-studenta dla wartości skorygowanych), lecz jednocześnie nie miało wpływu na miarę rozproszenia próby, która w metodzie badanej była zauważalnie wyższa niż w metodzie referencyjnej (Tab. III). Mierzony za pomocą ilościowego qpcr poziom wiremii (DNAemii) EBV jest jednym z podstawowych parametrów pomocnych w rozpoznaniu i monitorowaniu zakażeń tym wirusem u pacjentów z grup ryzyka. Wyznaczenie zależności klinicznej między poziomem wiremii a ryzykiem wystąpienia (nasilenia się, zejścia) objawów jest w tym kontekście zagadnieniem o zasadniczym znaczeniu. Obserwowane różnice w wynikach oznaczeń ilościowych, wynikające z odmiennej metodyki stosowanej w różnych laboratoriach są istotną przeszkodą w uzyskaniu spójnych informacji dotyczących wartości wiremii istotnych z klinicznego punktu widzenia (12). Wprowadzenie do szerokiego użycia standardu międzynarodowego EBV może pomóc w rozwiązaniu tego problemu. Zastosowanie opracowanej metody wykrywania EBV mogłoby być pomocne w trudnych diagnostycznie zakażeniach, za czym przemawiają wyniki uzyskanych parametrów analitycznych. Wykorzystanie w eksperymentach różnorodnych próbek materiału klinicznego pochodzącego od pacjentów z prawdopodobnym zakażeniem wirusem Epsteina-Barr potwierdziłoby dodatkowo wiarygodność techniki. PIŚMIENNICTWO 1. Overview of classification. W: Human herpesviruses. Red. Arvin A. Cambridge University Press, Cambridge 2007, 3-9. Davison AJ. 2. Crawford DH. Biology and disease associations of Epstein-Barr virus. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2001; 356: 461-73. 3. Bocian J, Januszkiewicz-Lewandowska D. Zakażenia EBV - cykl życiowy, metody diagnostyki, chorobotwórczość. Post Hig Med Dosw 2011; 65: 286-98.
Nr 2 Real-time PCR do wykrywania DNA wirusa EB 123 4. Przybylski M, Dzieciątkowski T, Zduńczyk D i inni. Microbiological findings and treatment of EBV-associated hemophagocytic lymphohistiocytosis: a case report. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 2010; 58: 467-72. 5. Balfour HH Jr, Dunmire SK, Hogquist KA. Infectious mononucleosis. Clin Transl Immunology 2015; 4: e33. 6. Murray PG, Young LS. The role of the Epstein-Barr virus in human disease. Front Biosci 2002; 7: 519-40. 7. Grywalska E, Markowicz J, Grabarczyk P i inni. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disorders. Postepy Hig Med Dosw 2013; 67: 481-90. 8. Karst J, Konopka L. Poprzeszczepowa choroba limfoproliferacyjna. Onkol Pol 2005; 8: 209-16. 9. Bruu AL, Hjetland R, Holter E i inni. Evaluation of 12 commercial tests for detection of Epstein- Barr virus-specific and heterophile antibodies. Clin Diagn Lab Immunol 2000; 7: 451-6. 10. Germi R, Lupo J, Semenova T i inni. Comparison of commercial extraction systems and PCR assays for quantification of Epstein-Barr virus DNA load in whole blood. J Clin Microbiol 2012; 50: 1384-9. 11. Rynans S, de Walthoffen SW, Dzieciątkowski T i inni. Zastosowanie real-time PCR w wirusologii. Post Mikrobiol 2015; 1: 75-82. 12. Jenna Rychert J, Danziger-Isakov L, Yen-Liebermanc B i inni. Multicenter comparison of laboratory performance in cytomegalovirus and Epstein Barr virus viral load testing using international standards. Clin Transplant 2014; 28: 1416 1423 13. Burns M, Valdiva H. Modeling the limit of detection in real-time quantitative PCR. Eur Food Res Technol 2008; 226: 1513-24. 14. Hubert P, Nguyen-Huub J, Boulanger B i inni. Harmonization of strategies for the validation of quantitative analytical procedures. A SFSTP proposal part III, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2007, 45, 82 96 15. Bland JM, Altman DG. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet. 1986; 1:307-10 16. Kołacińska A, Jabłonowska E. Nowotwory związane z AIDS w erze skojarzonego leczenia antyretrowirusowego (HAART). Przegl Epidemiol 2007; 61: 529-34. 17. Zawilińska B, Kosz-Vnenchak M, Piątkowska-Jakubas B i inni. Mieszane zakażenia herpeswirusowe u biorców alloprzeszczepów komórek hemopoetycznych. Przegl Epidemiol 2008; 62: 39-46. 18. Kimura H, Morita M, Yabuta Y i inni. Quantitative analysis of Epstein-Barr virus load by using a real-time PCR assay. J Clin Microbiol 1999; 37; 132-6. Otrzymano: 8 V 2015 r Adres Autora: 02-004 Warszawa, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny