Przegląd budowy i funkcji białek - od enzymów do prionów -

Przegląd budowy i funkcji białek - od enzymów do prionów - Zakład Biologii Molekularnej Instytut Biochemii, Wydział Biologii UW Takao Ishikawa

Kontakt Imię i nazwisko: Takao Ishikawa Mail: takao@biol.uw.edu.pl Slajdy: takao.pl Twarzą w twarz: pok. 105/D, Wydział Biologii UW ul. Miecznikowa 1 Telefon: 22-5543105

Co piszą o białkach? Wyraz wprowadzony przez Jönsa J. Berzeliusa w 1883 r. w celu podkreślenia znaczenia tej grupy związków. Termin pochodzi od greckiego słowa proteios, które oznacza pierwszorzędny. Białko to liniowa sekwencja aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniem peptydowym.

Funkcje energetyczne Funkcje komunikacyjne Funkcje mechaniczne i transportowe Funkcje magazynujące i wydalnicze

Funkcje białek zależą od ich KSZTAŁTU = KONFORMACJI

Funkcje białek Ochronne Hormony Strukturalne Ruchowe Enzymatyczne Transportowe

Organizacja budowy białek Struktura pierwszorzędowa Struktura drugorzędowa Struktura trzeciorzędowa Struktura czwartorzędowa

Struktura pierwszorzędowa >gi 386828:25-110 insulin [Homo sapiens] FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEG SLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN >sp P11387 DNA topoisomerase 1 [Homo sapiens] MSGDHLHNDSQIEADFRLNDSHKHKDKHKDREHRHKEHKKEKDREKSKHSNSEHKDSEKK HKEKEKTKHKDGSSEKHKDKHKDRDKEKRKEEKVRASGDAKIKKEKENGFSSPPQIKDEP EDDGYFVPPKEDIKPLKRPRDEDDADYKPKKIKTEDTKKEKKRKLEEEEDGKLKKPKNKD KDKKVPEPDNKKKKPKKEEEQKWKWWEEERYPEGIKWKFLEHKGPVFAPPYEPLPENVKF YYDGKVMKLSPKAEEVATFFAKMLDHEYTTKEIFRKNFFKDWRKEMTNEEKNIITNLSKC DFTQMSQYFKAQTEARKQMSKEEKLKIKEENEKLLKEYGFCIMDNHKERIANFKIEPPGL FRGRGNHPKMGMLKRRIMPEDIIINCSKDAKVPSPPPGHKWKEVRHDNKVTWLVSWTENI QGSIKYIMLNPSSRIKGEKDWQKYETARRLKKCVDKIRNQYREDWKSKEMKVRQRAVALY FIDKLALRAGNEKEEGETADTVGCCSLRVEHINLHPELDGQEYVVEFDFLGKDSIRYYNK VPVEKRVFKNLQLFMENKQPEDDLFDRLNTGILNKHLQDLMEGLTAKVFRTYNASITLQQ QLKELTAPDENIPAKILSYNRANRAVAILCNHQRAPPKTFEKSMMNLQTKIDAKKEQLAD ARRDLKSAKADAKVMKDAKTKKVVESKKKAVQRLEEQLMKLEVQATDREENKQIALGTSK LNYLDPRITVAWCKKWGVPIEKIYNKTQREKFAWAIDMADEDYEF

Aminokwasy H H2N C R α COOH

Optycznie L i D

L i D Optycznie czynne i nieczynne

Właściwości

Hydrofobowe

Hydrofilowe

Szczególne Dwie cysteiny mogą tworzyć mostki dwusiarczkowe

Wiązanie peptydowe H H H2N C COOH + H2N C COOH R R H H H H2N C C N C COOH + H2O R O R Wiązanie amidowe

Wiązanie peptydowe H H H2N C COOH + H2N C COOH R R H H H H2N C C N C COOH + H2O R O R Wiązanie peptydowe

Brak swobody...

Rezonans chemiczny

Swoboda obrotu Aminokwas - - Wiązanie peptydowe

Wykres Ramachandrana +130 o Najczęstsze kombinacje -40 o wartości kątów ψ i ϕ to... -90 o -60 o

Struktura drugorzędowa α-heliks β-kartka

Struktura drugorzędowa Lokalna, powtarzająca się struktura przestrzenna łańcucha głównego białka zbudowana z sąsiadujących ze sobą aminokwasów, która utrzymywana jest wiązaniami wodorowymi

α-heliks

α-keratyna

β-kartka

Fibroina

Struktury Cartoon Patyczkowo-kuleczkowe Czaszowe

Model cartoon

Model patyczkowy

Model czaszowy

Struktura trzeciorzędowa Globalna struktura przestrzenna białka Wzajemne relacje położenia struktur drugorzędowych

Siły stabilizujące Wiązania wodorowe Oddziaływania jonowe Wiązania kowalencyjne Oddziaływania van der Waalsa Oddziaływania hydrofobowe

Krajobraz fałdowania Niestabilne Stabilne

Ile potencjalnych konformacji? Białko o długości 364 aminokwasów 363 wiązania peptydowe Dwa parametry, kąty ψ i ϕ przy każdym wiązaniu 2 363 = 1,8 10 108

Paradoks Levinthala Zbadanie każdej konformacji zajmuje 1 ns 2 363 ns = 1,8 10 108 ns = 1,8 10 99 s 1 rok = 60 60 24 365 s = 31536000 s To zaledwie 3,2 10 7 s

Mostki dwusiarczkowe

Mostki dwusiarczkowe Tlen utlenia!

Mostki dwusiarczkowe Tlen utlenia! Może powodować mutacje

Mostki dwusiarczkowe Tlen utlenia! Może powodować mutacje Komórka pracuje nad utrzymaniem środowiska redukującego

Mostki dwusiarczkowe Tlen utlenia! Może powodować mutacje Komórka pracuje nad utrzymaniem środowiska redukującego -SH HS-

Struktura czwartorzędowa Oddziaływania między polipeptydami Kompleksy białkowe

ADP + Pi ATP

www.pdb.org 100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 14 20 10 20 05 20 00 20 95 19 90 19 85 19 80 19 19 75 0

Klasyfikacja białek Liczba polipeptydów (podjednostek) białko jedno- vs wielopodjednostkowe Obecność kofaktora białko proste vs złożone Kształt globularne vs fibrylarne

Liczba podjednostek

Obecność kofaktora

Kształt

PrP C PrP Sc konwersja Normalna Patogenna

Priony PrP C PrP Sc Rozpuszczalne w środowisku wodnym Podatne na trawienie proteazami Dominująca struktura drugorzędowa Tak Tak α-heliks Nie Nie β-kartka Morfologia Struktura

1. 2. PrP C PrP Sc 3.

Reszty cukrowe PrP C Reszta lipidowa

Modyfikacje (posttranslacyjne) białek Fosfataza P Białko Kinaza Grupa fosforanowa pochodzi od ATP

Właściwości białek

Doświadczenie Anfinsena

Czyli? Funkcjonalne białko o właściwej konformacji denaturacja renaturacja zmiana struktury pierwszorzędowej (proteoliza) Niefunkcjonalne, zdenaturowane białko o innej konformacji zmiana stanu skupienia koagulacja Agregat

Enzymy: są katalizatorami, które zmieniają szybkość reakcji, same nie ulegając zmianie są wysoce specyficzne ich aktywność może być regulowana m.in. przez modyfikacje posttranslacyjne

Grupa fosforanowa

Klasyfikacja enzymów EC 1.1.1.1 - dehydrogenaza alkoholowa EC Nazwa Typ reakcji 1 Oksydoreduktazy Utlenianie i redukcja cząsteczek (przenoszenie elektronów) 2 Transferazy Przenoszenie grup funkcyjnych między cząsteczkami 3 Hydrolazy Hydroliza cząsteczek 4 Liazy 5 Izomerazy 6 Ligazy Odszczepianie grup innym sposobem niż za pomocą hydrolizy lub utleniania Zmiana konfiguracji cząsteczki, np. cis - trans, L - D, aldehyd - keton itd. Wytworzenie cząsteczki przez połączenie dwóch różnych cząsteczek

EC1 Oksydoreduktazy Pirogronian Kwas mlekowy EC2 Transferazy Kinaza P

EC3 Hydrolazy Fosfataza P EC4 Liazy Dehydrataza H2CO3 CO 2 + H2O

EC5 Izomerazy O O = C O - = C O - H C NH3 + NH3 + C H CH3 CH3 EC6 Ligazy trna + alanina Alanylo-tRNA

Jak przyspieszyć reakcje? zwiększyć częstość zderzania cząsteczek zwiększyć energię każdego zderzenia obniżyć energię aktywacji ustawić odpowiednio cząsteczki reagujące

Energia aktywacji Bez katalizatora Energia Substrat Produkt Czas reakcji

Energia aktywacji Bez katalizatora Energia Substrat Produkt Z katalizatorem Czas reakcji

Rozpoznawanie substratu

Model indukowanego dopasowania

Kompleks enzym-substrat

Centrum (kieszeń) aktywne (katalityczne)

Kofaktory (koenzymy) mogą być niezbędne do poprawnego działania enzymów jony nieorganiczne: Fe 2+, Fe 3+, Cu 2+, Zn 2+, Mn 2+, Co 3+, Mo 2+ itd. niebiałkowe cząsteczki organiczne: koenzymy (np. ATP, NAD +, witaminy) grupa prostetyczna kofaktory związane na stałe z enzymem

Kinetyka Michaelisa-Menten Szybkość początkowa reakcji Stężenie substratu

Dlaczego początkowa?

Kinetyka Michelisa-Menten Szybkość reakcji vmax Enzym 2 Enzym 1 1/2 vmax KM 2 KM 1 Stężenie substratu

Szybkość reakcji Enzym 2 vmax Enzym 1 1/2 vmax KM 2 KM 1 Stężenie substratu Stała Michaelisa Enz. 1 > Enz. 2 Powinowactwo Enz. 1 < Enz. 2

Równanie Michaelisa- Menten v = vmax [S] KM + [S]

Optymalne warunki pracy ~7 Temperatura Wartość ph

A co w 100 oc?

Pepsyna

Aktywny enzym Trombina Proenzym Trombinogen

Krzepnięcie krwi Fibrynogen

Krzepnięcie krwi Fibrynogen Fibryna Działanie trombiny (proteazy)

Krzepnięcie krwi Fibrynogen Fibryna Polimer fibryny

Trombina Zablokowana hirudyną Aktywna

Inhibitory enzymów Cząsteczki hamujące reakcje katalizowane przez enzymy Inhibitory kompetycyjne konkurują o centrum aktywne z substratem Inhibitory niekompetycyjne wiążą się z innymi miejscami niż centrum aktywne

Inhibitory niekompetycyjne Reakcja Hamowanie

Substrat samobójczy Na stałe wiąże się z enzymem i uniemożliwia jego dalsze działanie Często stosowany w terapii Penicylina Uniemożliwienie syntezy ściany komórkowej AZT (azydotymidyna) Zablokowanie namnażania wirusa HIV

Podobieństwo strukturalne Deoksytymidyna (właściwy substrat) Azydotymidyna (substrat samobójczy)

Sprzężenie zwrotne (ujemne) Enzym X Enzym Y Enzym Z A B C D

Izoenzymy Katalizują te same reakcje, ale różnią się właściwościami fizycznymi lub kinetycznymi Optimum ph Powinowactwo do substratu Wrażliwość na inhibitory

Badanie LDH H4 (serce) H3M1 H2M2 H1M3 M4 (wątroba)

Glukometr Oksydaza glukozowa katalizuje reakcję utleniania Glukoza -> Glukozo-1,5-lakton Reakcji towarzyszy przepływ elektronów Urządzenie wykrywa przepływ prądu Im więcej glukozy, tym większy przepływ Większa liczba na wyświetlaczu...

Na deser też enzymy

Inwertaza Sacharoza -> Glukoza + Fruktoza Cukry proste mają większą higroskopijność i wyciągają wodę z czekolady Utwardzoną masę cukrową zalewa się czekoladą