DNA - kwas deoksyrybonukleinowy Wprowadzenie do genetyki sądowej część 2 odwójna helisa ok. 3,2 miliardy par zasad (base pairs) A=T, G=C ok. 20 000-30 000 genów onad 99% identyczności w populacji; 1% różnic wykorzystywany w genetyce sądowej DNA jądrowy - rejon kodujący (ok. 3 %) i niekodujący (ok. 97 %) mtdna - rejony kodujący (ok. 93 %) i niekodujący (ok. 7 %) 2016 racownia Genetyki Medycznej i Sądowej Katedra i Zakład Medycyny Sądowej DNA lokalizacja w komórce Komórki bez jądra Techniki i markery używane w genetyce sądowej Zróżnicowanie sekwencji tandemowych Analiza sekwencji tandemowo powtórzonych Sekwencje mikrosatelitarne STR Sekwencje minisatelitarne VNTR (znaczenie historyczne) Sekwencjonowanie DNA mitochondrialnego Analiza polimorfizmów typu SN Sekwencje minisatelitarne VNTR Sekwencje mikrosatelitarne STR 1
DNA typu minisatelitarnego: VNTR VNTR (variable number of tandem repeats) występujące w genomie sekwencje DNA o zmiennej liczbie tandemowych powtórzeń w locus Motyw powtórzony: od 9 do 100 bp Bardzo duże sekwencje - długość nawet do kilkudziesięciu tysięcy bp Dziedziczenie i segregacja cech wg zasad Mendla Bardzo wysoki polimorfizm olimorfizm wykrywany technikami: VNTR-RFL lub VNTR- rzykłady loci VNTR: D7S21, D12S11, D1S7 GCTCTTATGACGTATCATGACTAGT 25 bp DNA typu mikrosatelitarnego: STR STR krótkie powtórzenia tandemowe Motyw repetytywny: 2 6 bp Ilość powtórzeń w regionie może różnić się pomiędzy osobami Duży polimorfizm; metoda analizy - Szeroko rozpowszechnione w ludzkim genomie gł. w regionach niekodujących (brak informacji m. in. o rasie, predyspozycjach do chorób, cechach fenotypowych np.: wzrost, kolor oczu / włosów) TTCGAGTC AAGCTCAG TCAT TCAT TCAT TCAT TAAGCTCAG TCGA ACTC 4 powtórzenia 36 powtórzeń (= 900 bp) Markery STR Tok pracy Otrzymanie / pobranie materiału do badań Izolacja / ekstrakcja DNA omiar stężenia DNA Amplifikacja DNA metodą Rozdział elektroforetyczny produktów Genotypowanie Izolacja DNA - Kolumienki (Sherlock AX, Swab) - Kulki paramagnetyczne (repfiler) Izolacja DNA typu jądrowego metodą kolumienkową - Metoda organiczna (fenol-chloroform) Liza Wstępne oczyszczanie Wiązanie DNA łukanie (oczyszczanie) Elucja Wytrącanie Suszenie i zawieszanie w wodzie 2
Izolacja DNA jądrowego z materiału kostnego omiar stężenia DNA - zestaw: bufor specyficzny dla zestawu barwnik fluorescencyjny 2 standardy stężenia DNA -źródłem światła są diody wykrywające fluorescencję dsdna w badanej próbie omiar stężenia DNA omiar stężenia DNA Replikacja DNA proces stale zachodzący w komórkach olymerase Chain Reaction (Kary Mullis, 1985r.) Technika służąca powielaniu (amplifikacji) nici DNA w warunkach laboratoryjnych olimeraza DNA enzym syntetyzujący nić DNA Konieczna jest nić matrycowa wraz z krótkim odcinkiem dwuniciowym, powstałym po przyłączeniu się primera do matrycy Wydłużanie primera poprzez dobudowywanie kolejnych nukleotydów komplementarnych do nici matrycowej 3
3 3 Matryca DNA Mieszanina reakcyjna: - Komplementarne do sekwencji DNA primery - olimeraza Taq - Nukleotydy (A, G, C, T) - BSA - Mg 2+ rimer 1 rimer 2 zasada reakcji 94 o C Denaturacja nici pękanie wiązań wodorowych 3 3 3 3 59 o C rzyłączanie primerów do nici TCATAAGT 3 3 AGTATTCATTCATT 3 3 72 o C Wydłużanie przez olimerazę nici komplementarnej do nici matrycy 3 3 ok. 28-30 cykli 1 cykl = 2 2 = 4 odcinki DNA 3 3 odwojenie ilości DNA w każdym cyklu 1, 2, 4, 8,16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024, 2048, 4096, 8192, 16384, 32768, 65536, 131072, 262144, 524288 (20), 1.048.576 (21), 2097152, 4194304, 8388608, 16777216 (25), 33554432, 67108864, 134217728, 268435456, 536870912 (30), 1.073.741.824 (31) Multiplex Mikrosatelitarny DNA Jednoczesna amplifikacja wielu loci w jednej reakcji Odpowiedni zestaw primerów w mieszaninie reakcyjnej uniknięcie parowania się rimery wyznakowane różnymi barwnikami fluorescencyjnymi odseparowanie od siebie loci o podobnym zakresie masy (bp) Oszczędność czasu i materiału (degradacja DNA) otrzeba niewielkiej ilości DNA (0,2 ng) Duża siła dyskryminacji zestawu 15 loci 104bp 110bp 4
Multiplex standardowy zakres analizy Y-STR - dziedziczenie w linii męskiej - ustalenie pochodzenia geograficznego (brak materiału referencyjnego) Y-STR: męska linia rodowa ten sam haplotyp Elektroforeza kapilarna detekcja optyczna DZIADEK WNUCZE K SNs Single Nucleotide olymorphisms Najczęstsza zmiana zachodząca w sekwencji DNA Występują w genomie średnio co 100-300 bp Utrwalone mutacje punktowe (tranzycja / transwersja) Częstość przynajmniej 1% w populacji Większość to bialleliczne markery (dwa warianty) >> niska siła dyskryminacji Występowanie w kodujących i niekodujących regionach genomu 2/3 wszystkich SNs to zamiana C/T Niski polimorfizm pojedynczych SN Duża przydatność przy zdegradowanym materiale mtdna Genom mitochondrialny (16569 bp) został po raz pierwszy zsekwencjonowany przez Andersona i wsp. (1981r.) Standard sekwencja CRS Występowanie w mitochondriach - duża liczba kopii w komórce (200-1700) Brak rekombinacji, dziedziczenie wyłącznie od matki (homoplazmia) Duża zmienność mtdna w populacji wyższe tempo mutacji w porównaniu z jądrowym DNA (ok. 10x) Niekodująca część obejmuje 1200 bp - analiza poprzez odczytanie sekwencji mtdna w hiper-zmiennych segmentach regionu kontrolnego (pętli D) HV1 (16024-16365), HV2 (73-340), HV3 rzydatność w badaniach pokrewieństwa, antropologicznych i ewolucyjnych, przy silnie zdegradowanym materiale (gdy brak DNA jądrowego) Bardzo duża czułość na kontaminację obcym DNA Hetroplazmia komórkowa u tej samej osoby występuje więcej niż 1 haplotyp mtdna 5
OLIMORFIZM Minisatelity Mikrosatelity SN MATERIAŁY BIOLOGICZNE: zabezpieczanie oraz testy wstępne (jakościowe) WIELKOŚĆ 2016 racownia Genetyki Medycznej i Sądowej Katedra i Zakład Medycyny Sądowej Genetyka sądowa - zastosowanie DNA jądrowy - źródła Ustalanie pokrewieństwa - ojcostwo / macierzyństwo - brak rodziców badanie krewnych Identyfikacja osobnicza (identyfikacja NN denatów / osób zaginionych / ofiar katastrof masowych) Kryminalistyka - analiza zabezpieczonego materiału dowodowego w postaci śladów biologicznych - szukanie profilu sprawcy / ofiary na dowodach Inne: tkanki zatopione w parafinie, utrwalone w formalinie (możliwa degradacja DNA) Analizy historyczne Materiały biologiczne: prawidłowe zabezpieczanie śladów Warunki Materiały suche: temp. pokojowa, dostęp powietrza Ciecze, tkanki miękkie: -20 o C do -80 o C (kości) Metody Krew na EDTA (-20 o C) lub FTA / bibuła / płótno (+20 o C) Wymazy (-20 o C lub + 20 o C po wysuszeniu) Wysuszenie / zapakowanie w papierową kopertę, temperatura pokojowa niedopałki, znaczki, odzież (pobranie fragmentów lub w całości), paznokcie wraz z materiałem znajdującym się pod nimi Materiały biologiczne nieprawidłowe zabezpieczanie śladów - praca w niesterylnych warunkach brak rękawiczek, masek; używanie niejałowej wody dest. kontaminacja przy zabezpieczaniu - zabezpieczanie krwi na heparynę (inhibicja ) - niedosuszenie wymazów / zabezpieczanych śladów / przechowywanie w szczelnie zamkniętych foliowych workach rozwój mikroorganizmów i późniejsze zgnicie - zabrudzenie materiałów glebą (kwasy humusowe), rdzą, detergentami, chemikaliami (kwasy / zasady) degradacja / inhibicja DNA - pozostawianie w nasłonecznionym miejscu degradacja (UV) 6
Materiały biologiczne - testy jakościowe Ślina - testy jakościowe α-amylaza - testy specyficzne: a) test immunochromatograficzny b) test odciskowy hadebas A. Ślina test niespecyficzny test płytkowy (agar + skrobia) test specyficzny test immunochromatograficzny test odciskowy B. Krew testy niespecyficzne (luminol, H 2 O 2 ) testy specyficzne - immunochromatograficzne C. Sperma test niespecyficzny UV / test bardziej specyficzny Bluemaxx test specyficzny - immunochromatograficzny (obecność SA) α-amylaza: test niespecyficzny Krew - testy jakościowe Krew - testy jakościowe test niespecyficzny 3% H 2 O 2 test niespecyficzny - LUMINOL Katalaza 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 test specyficzny - immunochromatograficzny Luminol to substancja wykazująca chemiluminescencję związaną z utlenianiem luminolu w środowisku alkalicznym, w obecności określonych aktywatorów (hem) i utleniaczy (H 2O 2) z uwolnieniem azotu oraz energii w formie światła. Nasienie - testy jakościowe a) test niespecyficzny UV b) test bardziej specyficzny Bluemaxx c) test specyficzny SA 7