Załącznik 2. Autoreferat

Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja w Krakowie Wydział Technologii Żywności Katedra Technologii Węglowodanów Krzysztof Buksa Załącznik 2 Autoreferat Kraków 2015 Strona 1 z 38

Załącznik 2 Kraków 03.07.2015 Autoreferat 1. Imię i Nazwisko Krzysztof Buksa Miejsce pracy: Uniwersytet Rolniczy w Krakowie, Wydział Technologii Żywności, Katedra Technologii Węglowodanów, ul. Balicka 122, 30-149 Kraków 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne - z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej Matura II Liceum Ogólnokształcące w Rabce Zdroju, 1999 r. Studia Dyplom magistra inżyniera technologii żywności, Akademia Rolnicza im. Hugona Kołłątaja w Krakowie; 2004 r. Studia Dyplom ukończenia Studium Przygotowania Pedagogicznego dla Studentów na wydziale Nauk Społecznych Stosowanych AGH w Krakowie, 2004 r. Studia Dyplom ukończenia studiów podyplomowych w zakresie Zarządzanie Jakością w Przemyśle Spożywczym Akademia Rolnicza im. Hugona Kołłątaja w Krakowie; 2005 r. Doktorat Dyplom doktora nauk rolniczych w zakresie technologii żywności i żywienia, Akademia Rolnicza im. Hugona Kołłątaja w Krakowie; Tytuł rozprawy doktorskiej: Wpływ właściwości skrobi i pentozanów na wartość wypiekową całoziarnowej mąki z polskich odmian żyta, 12 listopad 2008 r. Promotor pracy: prof. dr hab. Anna Nowotna. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/artystycznych 15.12.2008-01.10.2010 asystent naukowo-dydaktyczny, Katedra Technologii Węglowodanów, Akademia Rolnicza im. Hugona Kołłątaja w Krakowie. Strona 2 z 38

01.10.2010 - obecnie adiunkt, Katedra Technologii Węglowodanów, Akademia Rolnicza im. Hugona Kołłątaja w Krakowie, aktualnie Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie. 4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): a) Tytuł osiągnięcia naukowego Osiągnięciem naukowym będącym podstawą złożonego przeze mnie wniosku o wszczęcie postępowania habilitacyjnego jest jednotematyczny cykl publikacji pod zbiorczym tytułem: Rola ekstrahowalnych wodą żytnich arabinoksylanów, o różnej masie cząsteczkowej, naturalnych i zmodyfikowanych, w kształtowaniu jakości chleba żytniego b) Publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego 1. Buksa K. (85%), Nowotna A, Ziobro R., Praznik W. 2014. Molecular properties of arabinoxylan fractions isolated from rye grain of different quality. Journal of Cereal Science. 60 (2), 368-373. IF = 1.943, 35 pkt MNiSW. 2. Buksa K. (80%), Ziobro R., Nowotna A., Praznik W., Gambuś H. 2012. Isolation, modification and characterization of soluble arabinoxylan fractions from rye grain. European Food Research and Technology. 235 (3), 385-395. IF = 1.436, 30 pkt MNiSW, 10 cytowań (bez autocytowań 3) w bazie Web of Science. 3. Buksa K. (75%), Ziobro R., Nowotna A., Adamczyk G., Sikora M., Żylewski M. 2015.Water Binding Capacity of Rye Flours with the Addition of Native and Modified Arabinoxylan Preparations, Journal of Agricultural Science and Technology (JAST), 16 (3), 1083-1085. IF = 0.679, 25 pkt MNiSW. 4. Buksa K. (85%), Ziobro R., Nowotna A., Gambuś H. 2013. The influence of native and modified arabinoxylan preparations on baking properties of rye flour. Journal of Cereal Strona 3 z 38

Science. 58, 23-30. IF = 1.943, 35 pkt MNiSW, 2 cytowań (bez autocytowań 0) w bazie Web of Science. 5. Buksa K. (85%), Nowotna A., Ziobro R., Gambuś H. 2014. Rye flour enriched with arabinoxylans in rye bread making. Food Science and Technology International. 21 (1), 45-54. IF = 0.981, 25 pkt MNiSW. 6. Buksa K. (100%) 2014. Komponowanie składu mąki żytniej służącej do wypieku modelowych chlebów żytnich metodą bezpośrednią. Żywność Nauka. Technologia. Jakość. 2 (93), 175 189. IF = 0.311, 15 pkt MNiSW. *Liczba punktów za cykl publikacji (dane z roku publikacji): 165 pkt. MNiSW *Wartość IF (dane z roku publikacji): 7.293 Oświadczenia współautorów prac określające indywidualny wkład każdego z nich w powstanie publikacji zamieszczono w załączniku 5. c) Omówienie celu naukowego/artystycznego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Tytuł osiągnięcia: Rola ekstrahowalnych wodą żytnich arabinoksylanów, o różnej masie cząsteczkowej, naturalnych i zmodyfikowanych, w kształtowaniu jakości chleba żytniego 1. Wprowadzenie Znana jest pozytywna rola arabinoksylanów (AX) w tworzeniu ciasta i chleba zarówno pszennego jak i żytniego (Bushuk 2001). Efekty działania tych polisacharydów zależą od ich pochodzenia i rodzaju oraz charakterystyki mąki do której zostały dodane w celu sporządzenia ciasta i wypieczenia chleba. Stwierdzono, że AX przyczyniają się w dużym stopniu do zwiększenia wodochłonności mąki, natomiast frakcja AX rozpuszczalna w wodzie w znacznym stopniu stabilizuje pory gazowe i zwiększa objętość chleba, zmniejsza twardość, jak również opóźnia starzenie, co stwierdzono w badaniach chlebów głównie pszennego (Biliaderis i in. 1995; Denli i Ercan 2001; Izydorczyk i Biliaderis 1995; Migliori i Gabriele 2010). Ponadto w badaniach tych wykazano, że zastosowanie rozpuszczalnych AX o wysokiej masie Strona 4 z 38

cząsteczkowej, w porównaniu do tych o niskiej masie cząsteczkowej, wyizolowanych z różnych odmian pszenicy, jest bardziej efektywne, ale to jaki ich dodatek należy zastosować, zależy od jakości mąki pszennej używanej do wypieku (Biliaderis i in. 1995; Izydorczyk i Biliaderis 1995). Ze względu na pozytywną rolę jaką odgrywają AX w pieczywie, szczególnie żytnim, wydaje się celowym stosowanie dodatku tych związków, wyizolowanych z ziarna żyta, aby zwiększyć ich udział w mące. Poprawa jakości pieczywa zależy jednak w dużym stopniu nie tylko od rodzaju, ilości, ale także właściwości preparatów AX uzyskanych w wyniku izolacji. Na właściwości AX można wpłynąć poprzez modyfikację ich struktury, zwłaszcza pod względem wielkości cząsteczek. Umożliwia to hydroliza enzymatyczna, prowadząca do degradacji cząsteczek AX oraz sieciowanie - powodujące znaczny wzrost ich masy cząsteczkowej (Izydorczyk i Biliaderis 1995; Vinkx i Delcour 1996). W dotychczasowych badaniach, w celu hydrolizy arabinoksylanów stosowano dodatek do mąki enzymów, które hydrolizują arabinoksylany, co skutkowało zwiększeniem ilości arabinoksylanów rozpuszczalnych w wodzie (Vinkx i Delcour 1996, Courtin i Delcour 2002). Endoksylanazy są najpopularniejszymi enzymami stosowanymi do modyfikacji tych polisacharydów. Badania, dotyczące głównie mąki pszennej i chleba pszennego wykazały, iż endoksylanazy, uwalniając pentozany nierozpuszczalne z matrycy celulozowej, zwiększają ich rozpuszczalność. W konsekwencji zwiększa się ilość pentozanów rozpuszczalnych w cieście, co prowadzi do poprawienia parametrów obróbki ciasta, uzyskiwania większej objętości chleba oraz lepszej struktury miękiszu. W dalszej kolejności zbyt daleko posunięta hydroliza endoksylanazami, powoduje depolimeryzację AX rozpuszczalnych w wodzie, co skutkuje gwałtownym zmniejszeniem lepkości ich wodnych roztworów (Girhammar i Nair 1995), a w konsekwencji pogorszeniem właściwości ciasta. Wykazano bowiem, że im większa masa cząsteczkowa AX w cieście pszennym, tym większa jego wodochłonność (Biliaderis i in. 1995, Goesaert i in. 2005). Innym sposobem poprawy właściwości ciasta, stosowanym szczególnie przy produkcji chleba pszennego, jest dodatek do mąki czynników o działaniu utleniającym. Takie działanie umożliwia poprawę jakości słabej mąki pszennej, głównie za sprawą sieciowania białek glutenowych (Kieffer i in. 1981). Zdolność do sieciowania stwierdzono także w przypadku arabinoksylanów - zarówno frakcji rozpuszczalnej w wodzie, jak i nierozpuszczalnej (Michniewicz i in. 1990). Pod wpływem substancji utleniających, za pośrednictwem cząsteczek kwasu ferulowego wchodzących w skład AX, także te węglowodany mogą się łączyć. Prowadzi to do gwałtownego zwiększenia ich masy cząsteczkowej, a obecność AX o Strona 5 z 38

dużej masie cząsteczkowej, jak wykazano w badaniach ciasta i chleba pszennego, szczególnie pozytywnie wpływa na ich właściwości (Izydorczyk i Biliaderis 1995; Vinkx i Delcour 1996). Usieciowane AX są zdolne do wiązania znacznie większej ilości wody, niż wolne (nieusieciowane) polimery, a jak wykazali Girhammar i Nair (1995) w badaniach ciasta pszennego z dodatkiem AX oraz czynników utleniających, usieciowanie znacząco zwiększa wodochłonność mąki. Sieciowanie pod wpływem czynnika utleniającego może także zmieniać właściwości reologiczne ciasta (Girhammar i Nair 1995) i pozytywnie wpływać na parametry wypiekowe, a w szczególności na objętość chleba pszennego (Izydorczyk i in. 1990; Michniewicz 1995). Badania dotyczące wpływu żytnich AX rozpuszczalnych w wodzie, zróżnicowanych pod względem mas cząsteczkowych, na jakość chleba żytniego, nie były dotychczas prowadzone, a literatura z tego zakresu koncentruje się zasadniczo na mące pszennej. Mąka żytnia jest jednakże znacznie bogatsza w te związki, w porównaniu z mąką pszenną (Gąsiorowski 1994), a ponadto w cieście żytnim nie tworzy się matryca glutenowa, dlatego arabinoksylany, obok skrobi, są głównym strukturotwórczym składnikiem takiego ciasta. Najczęściej prowadzone są badania, w których stosuje się dodatek do mąki: uprzednio wyizolowanych preparatów AX, enzymów, które hydrolizują AX obecne w mące (Vinkx i Delcour 1996, Courtin i Delcour 2002), a także czynników modyfikujących strukturę tych hydrokoloidów. Jednak dotychczas nie stosowano dodatku zmodyfikowanych AX (zhydrolizowanych i usieciowanych) do wypieku chleba. 2. Hipoteza badawcza i cel pracy Formułując cel pracy założono hipotezę badawczą: na jakość pieczywa głównie z mąki żytniej, istotny wpływ wywiera nie tylko ilość AX ekstrahowalnych wodą w mąkach ze zbóż chlebowych, ale także ich masa cząsteczkowa. Zasadniczym celem pracy było przebadanie roli rozpuszczalnych żytnich AX, o różnej masie cząsteczkowej i strukturze (usieciowanych i zhydrolizowanych) w kształtowaniu jakości ciasta i chleba żytniego. Naukowym celem pracy było opracowanie laboratoryjnej metody izolacji rozpuszczalnych arabinoksylanów z całoziarnowej mąki żytniej, opracowanie metod ich modyfikacji oraz przebadanie ich właściwości molekularnych metodami specyficznymi dla poszczególnych preparatów. Strona 6 z 38

Praktycznym celem pracy było wykazanie wpływu stosowanych preparatów na jakość uzyskanego pieczywa, poprzez przeprowadzenie wypieku chlebków żytnich z mąki typu 720 oraz 1150, handlowej i pochodzącej z przemiału laboratoryjnego ziarna odmiany Amilo, z udziałem arabinoksylanów wyizolowanych metodą laboratoryjną oraz przemysłową, naturalnych i modyfikowanych, z uwzględnieniem analizy ciasta, jakości uzyskanych chlebów oraz procesu ich starzenia się. 3. Materiał i metody 3.1. Materiał Podstawowym materiałem użytym do badań było ziarno żyta odmiany Amilo z roku zbioru 2004, 2005, 2006 i 2007 (Publikacje 1-5), charakteryzujące się szczególnie dużą zawartością arabinoksylanów (Buksa i in. 2010). Do badań użyto również ziarno odmian żyta Dańkowskie Złote i Kier zebrane w 3 kolejnych latach (2004, 2005 i 2006) uprawianych w tych samych warunkach agrotechnicznych i klimatycznych (Publikacja 1). Zastosowano również ziarno żyta odmiany Warko z roku 2004 (Publikacja 6). Ponadto materiałem badawczym były mąki żytnie typu 720 i 1150: handlowe pochodzące z PZZ w Krakowie SA oraz z przemiału laboratoryjnego ziarna żyta odmiany Amilo (Publikacje 4 i 5) i uzyskana metodą przemysłową, bogata w arabinoksylany (AX) frakcja mąki żytniej (nazwana w pracy preparatem MP), wyprodukowana na drodze separacji powietrznej, w firmie MICROSTRUCTURE Sp. z o. o. (04-402 Warszawa ul. Cyrulików 37a). Materiał badawczy stanowiły również: preparat AX pszennych, ekstrahowalnych wodą, o nazwie handlowej Naxus (BioActor B.V., Belgia), albumina jaja kurzego (POCh, Polska), gluten pszenny witalny (Cargill, Polska), skrobia żytnia wyizolowana metoda laboratoryjną (Publikacja 6) z ziarna odmiany Warko. 3.2. Metody 3.2.1. Izolacja AX z ziarna żyta (Publikacja 1 i 2) Z całoziarnowej mąki żytniej uzyskanej w wyniku przemiału ziarna odmiany Amilo, Dańkowskie Złote i Kier w młynku laboratoryjnym (RG-109 firmy Labor Muszeripari Strona 7 z 38

Muwek, z dwiema parami walców, działającym podobnie jak Quadrumat Junior firmy Brabender) wyizolowano arabinoksylany ekstrahowalne wodą (WEAX) (zwane również rozpuszczalnymi w wodzie) i nieekstrahowalne wodą (WUAX) (tzn. nierozpuszczalne w wodzie). 3.2.2. Opracowanie optymalnej metody izolacji naturalnych AX ekstrahowalnych wodą Metodę izolacji arabinoksylanów ekstrahowalnych wodą (WEAX) opracowano dobierając warunki poszczególnych etapów na podstawie dostępnych danych literaturowych. W celu inaktywacji enzymów rodzimych mąki stosowano jej ogrzewanie w formie suchej w 130 C przez 90 min (Vinkx i in. 1993) (Publikacja 1) lub ogrzewanie zawiesiny mąki w etanolu (Jankiewicz i Michniewicz 1976) w 90 C przez 120 min (Publikacja 2). Kolejny kluczowy etap ekstrakcję wodną przeprowadzano w temperaturze pokojowej, na podstawie prac (Vinkx i in. 1993; Fengler i Marquardt 1988) (Publikacja 1 i 2). Oczyszczanie preparatu z pozostałej w nim skrobi przeprowadzano przy użyciu termostabilnej α-amylazy (Publikacja 1) na podstawie prac: Vinkx a i współpracowników (1993), Jankiewicza i Michniewicza (1976). Ponieważ preparaty uzyskiwane z termostabilną α-amylazą nie nadawały się do wypieku chlebów, ze względu na niemożliwą do wyeliminowania aktywność enzymu, uzyskano również preparaty (oznaczane w pracy jako LP) używając w miejsce termostabilnej α-amylazy - amylazy ślinowej (Publikacja 2). Opracowano także własny sposób doczyszczania preparatu AX, tj. umożliwiający maksymalne zinaktywowanie enzymu i koagulację białek. Jest to nowość w preparatyce AX, dotychczas nie stosowana przez innych Autorów. W celu inaktywacji enzymu i koagulacji rozpuszczalnych białek ekstrakt AX ogrzewano przez 30 min w 95 C i filtrowano przez warstwę cellitu (Publikacja 1 i 2). W kolejnym kroku w celu wytrącenia AX filtrat zalewano 4 objętościami roztworu etanolu i acetonu, w proporcji 1:1. Wytrącone arabinoksylany odwirowywano, a następnie: a) doczyszczano, powtarzając trzykrotnie procedurę rozpuszczania, wytrącania mieszaniną etanol-aceton i wirowania (Publikacja 1), lub b) uzyskany osad zamrażano (-18 C) w celu przerwania (odroczenia) dalszej części procedury izolacji na kolejny dzień lub przeprowadzenia modyfikacji AX (Publikacja 2). Końcowym etapem izolacji wszystkich preparatów było usunięcie wody z preparatu AX poprzez dwukrotne przemywanie acetonem i wirowanie. Uzyskany po ostatnim wirowaniu osad arabinoksylanów suszono w 50 C przez 2h i traktowano jako docelowy preparat Strona 8 z 38

arabinoksylanów ekstrahowalnych wodą (WEAX) dodatkowo oznaczony symbolem LP, aby podkreślić że był on otrzymany metodą laboratoryjną (Publikacja 2). Znając ilość preparatu uzyskiwanego ze 100g mąki, oznaczono zawartość czystych arabinoksylanów w preparacie, metodą Hashimoto i in. (1987) i na tej podstawie wyliczono wydajność uzyskiwanych naturalnych (niemodyfikowanych) arabinoksylanów (LP NM), jako ilość czystych arabinoksylanów uzyskanych ze 100 g mąki całoziarnowej. 3.2.3. Modyfikacje uzyskanych preparatów naturalnych AX ekstrahowalnych wodą (Publikacje 2, 3 i 5) Opracowano metody modyfikacji stosowanych w badaniach preparatów: arabinoksylanów ekstrahowalnych wodą (LP) i bogatej w arabinoksylany ekstrahowalne wodą frakcji mąki żytniej (MP), poprzez: 1. sieciowanie peroksydazą i nadtlenkiem wodoru AX naturalnych tj.: a - LP CR; b - MP CR, 2. hydrolizę enzymatyczną AX naturalnych, tj.: a - LP HYD; b - MP HYD, 3. sieciowanie AX zhydrolizowanych enzymatycznie, oznaczone jako hydroliza/usieciowanie (LP HCR). a) Modyfikacje preparatu LP (Publikacja 2) W celu przeprowadzenia modyfikacji, zamrożony osad (p. 3.2.2.) rozmrażano i rozpuszczano w wodzie. Na tym etapie przeprowadzano trzy wyżej wymienione modyfikacje preparatu LP. Zaproponowane modyfikacje są autorskie, dotychczas nie stosowane. Do usieciowania arabinoksylanów (symbol preparatu LP CR) użyto peroksydazy chrzanowej (Horseradish) i nadtlenku wodoru. We wstępnych badaniach ustalono optymalną aktywność peroksydazy, która powinna być zastosowana do modyfikacji (Publikacja 2), optymalny dodatek H 2 O 2 oraz optymalną temperaturę i czas reakcji (Publikacja 2). Do modyfikacji polegającej na hydrolizie enzymatycznej (symbol preparatu LP HYD), użyto enzymu ksylanazy ze szczepu Thermomyces lanuginosus (Sigma Aldrich). We Strona 9 z 38

wstępnych badaniach ustalono optymalny dodatek ksylanazy (Publikacja 2), który powinien być zastosowana do modyfikacji, optymalną temperaturę i czas reakcji. Preparat poddano również hydrolizie enzymatycznej ksylanazą, a następnie usieciowaniu nadtlenkiem wodoru i peroksydazą (modyfikacja hydroliza/usieciowanie, symbol preparatu LP HCR; Publikacja 2). Do modyfikacji użyto tych samych substancji, w identycznych dawkach oraz w takich samych temperaturach reakcji, jak w przypadku osobnej hydrolizy i sieciowania, ale zastosowano krótszy czas hydrolizy (Publikacja 2). Następnie próbkę chłodzono i przeprowadzano sieciowanie peroksydazą i nadtlenkiem wodoru, w takich samych warunkach jak w przypadku samego sieciowania, czyli uzyskiwania preparatów LPCR (Publikacja 2). b) Modyfikacje bogatej w AX frakcji mąki żytniej MP (Publikacja 5) Bogatą w AX frakcję mąki żytniej uzyskaną metodą przemysłową (preparat przemysłowy MP) poddano dwóm modyfikacjom: sieciowaniu (MP CR) i hydrolizie (MP HYD). Modyfikacje przeprowadzano po rozpuszczeniu preparatu w wodzie o temperaturze pokojowej. Obie przeprowadzone modyfikacje, opisane w Publikacji 5, są autorskie, dotychczas nie stosowane. Do usieciowania arabinoksylanów użyto peroksydazy chrzanowej (Horseradish, Sigma Aldrich) i nadtlenku wodoru (POCh, Poland). We wstępnych badaniach ustalono optymalną aktywność peroksydazy, która powinna być zastosowana do modyfikacji, optymalny dodatek H 2 O 2, oraz optymalną temperaturę i czas reakcji (Publikacja 5). Do przeprowadzenia hydrolizy enzymatycznej użyto enzymu ksylanazy ze szczepu Thermomyces lanuginosus (Sigma Aldrich). We wstępnych badaniach ustalono optymalny dodatek ksylanazy, który powinien być zastosowany do modyfikacji, optymalną temperaturę i czas reakcji (Publikacja 5). Po przeprowadzeniu dwóch wyżej wymienionych modyfikacji preparaty MP zamrażano i liofilizowano przez 30h. Po liofilizacji, preparaty w formie proszków ogrzewano (15min. w 120 C), w suszarce, w celu inaktywacji enzymów. 3.2.4. Badanie właściwości preparatów AX W następnym etapie analizowano właściwości fizyczno-chemiczne i molekularne uzyskanych metodą laboratoryjną preparatów arabinoksylanów oraz bogatych w AX frakcji Strona 10 z 38

mąki żytniej (MP) naturalnych i modyfikowanych. Wykonano również analizę komercyjnego preparatu AX pszennych o nazwie handlowej Naxus. Przeprowadzono następujące analizy: oznaczenie zawartości białka - metodą 950.36 wg AOAC (2006). oznaczenie składu węglowodanowego uzyskanych preparatów (naturalnych i modyfikowanych) tj. zawartość cukrów prostych po hydrolizie kwasowej preparatów, metodą własną stosując HPLC/RI. Warunki hydrolizy preparatów kwasem trifluorooctowym dobrano bazujac na dostepnych danych literaturowych (Chaplin 2001), do zobojetniania hydrolizatów zastosowano suchy Na 2 CO 3, rozdział chromatograficzny prowadzono na zestawie HPLC/RI wyposażonym w kolumny SP-G i SP08010 (Shodex), stosując wodę jako eluent, szybkość przepływu 0,6 cm 3 /min i temperaturę kolumn 70 C. Na podstawie uzyskanych wyników wyznaczono proporcję reszt L-arabinofuranozy do reszt β-d-ksylopiranozy (A/X) w cząsteczkach arabinoksylanów (Publikacja 1, 2, 5 i 6). analizę struktury arabinoksylanów metodą rezonansu magnetycznego 1 H NMR (Publikacja 1 i 3), wyznaczając proporcję pojedynczo do podwójnie podstawionych reszt β-d-ksylopiranozy (ang. substitution ratio - SR) w łańcuchach arabinoksylanów (Hoffman i in. 1992a; Hoffman i in. 1992b; Izydorczyk i Biliaderis 1993; Joseleau i in. 1977). Przyporządkowanie pików widm zostało przeprowadzone na podstawie danych literaturowych (Hoffman i in. 1992a; Hoffman i in. 1992b; Izydorczyk i Biliaderis 1993; Joseleau i in. 1977; Roubroeks i in. 2000; Vinkx i in. 1995). opracowano również autorską metodę oznaczania zawartości kwasu ferulowego ogółem (a) i jego formy niezwiązanej (b) i oznaczono tę zawartość w preparatach (Publikacja 2). Ad. a) W celu oznaczenia kwasu ferulowego ogółem próbki poddawano hydrolizie alkalicznej 2M NaOH. Ad. b) W celu oznaczenia zawartości niezwiązanego kwasu ferulowego ekstrahowano go z próbki mieszaniną wody i octanu etylu. Następnie próbki uzyskane zgodnie z wariantami a i b zakwaszano i ekstrahowano kwas ferulowy przy pomocy octanu etylu. Z roztworów octanu etylu zawierających kwas ferulowy usuwano pozostałości wody i przeprowadzano pomiar zawartości kwasu ferulowego metodą spektrofotometryczną mierząc absorbancję przy długości fali 320 nm. Na podstawie różnicy pomiędzy zawartością kwasu ferulowego ogółem i niezwiązanego obliczono ilość tego kwasu związanego z cząsteczkami pentozanów. Strona 11 z 38

oznaczenie charakterystyki molekularnej arabinoksylanów, przez pomiar ich masy cząsteczkowej metodami HPSEC i GPC po doświadczalnym ustaleniu optymalnych warunków rozpuszczania badanych preparatów arabinoksylanowych (Publikacje 2 i 5). Rozkład mas cząsteczkowych AX we wszystkich preparatach (AX naturalnych i modyfikowanych), oznaczano stosując dwa autorsko skonfigurowane systemy chromatograficzne i warunki analizy. 1) system 1 - GPC (Publikacja 2 i 5) składał się z pompy perystaltycznej (Pharmacia), dwóch kolumn wypełnionych żelami Sephacryl (Pharmacia), o wymiarach odpowiednio: S-200, 37 x 1,6 cm oraz S-500, 46 x 1,6 cm. Układ wyposażony był także w kolektor frakcji. Eluentem był 0,032% roztwór wodny węglanu sodu. Szybkość przepływu wynosiła 0,4 cm 3 /min, objętość retencji 3,0 cm 3, a objętość pętli dozującej - 1,0 cm 3. We frakcjach zebranych po rozdziale na kolumnach oznaczono zawartość arabinoksylanów zmodyfikowaną metodą z orcinolem (Hashimoto i in. 1987), stosując gotowanie frakcji z odczynnikiem orcinolowym, chłodzenie, a następnie pomiar absorbancji przy długości fali 670 nm. Krzywą kalibracyjną wykonano wykorzystując pullulany oraz ksylozę jako wzorce o znanych masach cząsteczkowych (Publikacja 2). Przed podaniem na kolumny GPC preparat AX był rozpuszczany w eluencie. Rozpuszczoną próbkę wirowano, a uzyskany supernatant nastrzykiwano na system kolumn. 2) system 2 - HPSEC stanowił układ wyposażony w pompę (Smartline 1000; Kanuer) i kolumny OHpak SB-G, OHpak SB-806HQ i OHpak SB-804HQ (Shodex). Układ wyposażony był także w detektor RI (Knauer). Eluentem była woda (Publikacje 2 i 6) lub 100 mm roztwór NaNO 3 (Publikacje 1, 3 i 5), Szybkość przepływu wynosiła 0,6 cm 3 /min, a temperatura kolumn 60 C. Krzywą kalibracyjną do oznaczenia mas cząsteczkowych wykonano wykorzystując pullulany oraz arabinozę jako wzorce o znanych masach cząsteczkowych. Przed podaniem na kolumny SEC preparat AX był rozpuszczany w wodzie (Publikacje 2 i 6) lub w DMSO (Publikacje 1, 3 i 5). Tak przygotowaną próbkę wirowano a filtrat nastrzykiwano (100ul) na system kolumn. Rozkłady mas cząsteczkowych oraz średnie wagowo masy cząsteczkowe zostały opracowane i obliczone oprogramowaniem Eurochrom (Knauer), CPC win (a.h.group, Graz, Austria). Strona 12 z 38

pomiary reologiczne 5% roztworów preparatów uzyskanych metodą laboratoryjną LP, wyznaczając krzywe płynięcia, a na ich podstawie parametry modelu Ostwalda de Waele n i K. Wykonano także oznaczenie widm mechanicznych tych roztworów w reometrze rotacyjnym Haake RS1 uwzględniając zakres liniowej lepkosprężystości (Publikacja 3). oznaczenie lepkości granicznej, preparatów uzyskanych metodą laboratoryjną (LP, Publikacja 2), gdyż ze względu na skład preparatów uzyskanych metodą przemysłową MP (dużą zawartość nieskleikowanej skrobi) oznaczenie to nie było możliwe do wykonania. 3.2.5. Wypiek chlebków żytnich z dodatkiem AX metodą tradycyjną i metody analizy ich jakości w dniu wypieku i po 4 dniach przechowywania (Publikacja 4 i 5) Z przebadanych mąk żytnich o różnej zawartości popiołu (typu 720 i 1150), handlowych (Publikacje 4 i 5) oraz uzyskanych z ziarna żyta Amilo (Publikacja 4), sporządzono ciasta i wypieczono chlebki z kęsów ciasta o masie 60 g. Według bazowej receptury ciasto na chleb żytni sporządzano ze: 100 g mąki, wody w ilości oznaczonej farinograficznie (ciasto o konsystencji 150 j.br.), 2% soli, 3% drożdży, 8% kwasu piekarskiego firmy Bionat. Wymieniona receptura była stosowana do sporządzania ciasta i chlebka, stanowiącego próbę kontrolną. 3.2.5.1. Przygotowanie ciasta z dodatkiem preparatów arabinoksylanów Aby scharakteryzować wpływ udziału arabinoksylanów ekstrahowalnych wodą (rozpuszczalnych w wodzie), naturalnych i zmodyfikowanych, na jakość ciasta i pieczywa żytniego, użyto następujących preparatów: a) naturalnych arabinoksylanów ekstrahowalnych wodą, wyizolowanych metodą laboratoryjną (LP NM), b) naturalnych arabinoksylanów uzyskanych metodą przemysłową (MP NM). c) zawierających zmodyfikowane arabinoksylany (LP i MP) uzyskane poprzez: - hydrolizę enzymatyczną (HYD), - usieciowanie (CR), - hydrolizę AX wyizolowanych metoda laboratoryjną i następnie usieciowanie (hydroliza/sieciowanie - LP HCR). Strona 13 z 38

Przy tworzeniu ciasta, w miejsce części mąki użyto w.w. preparaty arabinoksylanowe uzyskane metodą laboratoryjną (LP) w ilości 1% i 2%. Preparaty MP, ze względu na znacznie mniejszą zawartość arabinoksylanów (AX), w porównaniu do preparatów LP, dodawano w większej ilości - 10%. Badania wykazały, że najlepszym sposobem dozowania wszystkich preparatów jest dodawanie ich do mąki w postaci sproszkowanej, na początku mieszenia ciasta. 3.2.5.2. Analizy ciasta Pierwszą analizą było oznaczenie dodatku wody do ciasta z udziałem wszystkich stosowanych preparatów oraz z dodatkiem soli, drożdży i kwasu piekarskiego firmy Bionat tak, aby uzyskać jednakową konsystencję 150 j.br. w farinografie Brabendera (zgodnie z ICC-Standard No. 115/1). Następnie określono właściwości teksturalne tak przygotowanego ciasta żytniego testem TPA mierząc: twardość i adhezyjność w teksturometrze TAXT.Plus. W tym celu próbkę ciasta (25 cm 3 ) umieszczano w cylindrycznym pojemniku o średnicy 4 cm i mierzono teksturę ciasta używając przystawki P20 (Publikacja 4 i 5). Sporządzając ciasto z mąki z odmiany Amilo (Publikacja 4), użyto tylko preparaty AX wyizolowane metoda laboratoryjną (LP): naturalne (LP NM) i poddane modyfikacjom (LP CR, LP HYD, LP HCR), które zastosowane do mąk handlowych dały najlepsze efekty wypiekowe tj. największą objętość i najmniejszą twardością miękiszu. Ilość dodawanej wody do ciasta o jednakowej konsystencji 150 j.br. zależała od udziału i rodzaju preparatu arabinoksylanowego, oraz rodzaju i typu mąki. Ze sporządzonego ciasta, po uformowaniu kęsów (60 g) i fermentacji (75 min w temperaturze 37 C), wypieczono chlebki, w foremkach aluminiowych, w modułowym piecu elektrycznym Miwe Condo, typu C 52, w temperaturze 230 o C i czasie 20 min (Publikacja 4 i 5). 3.2.5.3. Analizy chleba Oznaczono upiek (stratę wypiekową) wg Jakubczyka i Habera (1981) jak również, po ochłodzeniu, objętość chlebków w materiale sypkim, zgodnie z metodyką przedstawioną przez Jakubczyka i Habera (1981) i przeprowadzono jego ocenę organoleptyczną (wg PN-A- Strona 14 z 38

74108:1996). Ocenie podlegały: wygląd zewnętrzny, jakość skórki i miękiszu, a także smak i zapach pieczywa. Proces starzenia się chlebków przebadano oznaczając profil tekstury miękiszu teksturometrem TAXT.Plus, testem TPA, badając miękisz chlebka w kromce o grubości 3 cm (Publikacja 4 i 5). Spośród uzyskanych wyników do interpretacji wybrano tylko twardość miękiszu, jako najbardziej istotną cechę dla konsumentów (Publikacja 4 i 5). Oznaczono także wilgotność miękiszu chlebków, metodą 925.10 wg AOAC (2006), w dniu wypieku oraz po 4 dniach przechowywania, w komorze o temperaturze 24 o C i wilgotności 64% (Publikacja 5). 3.2.6. Wypiek modelowych chlebków żytnich (Publikacja 6) Skrobię żytnią izolowano z mąki całoziarnowej, uzyskanej z ziarna żyta odmiany Warko, zgodnie z opisem zamieszczonym w pracy (Buksa i in. 2010). W skrobi oznaczono zawartość niewęglowodanowych składników, zawartość amylozy, masę cząsteczkową, współczynnik pęcznienia oraz wykonano jej charakterystykę kleikowania, posługując się standardowymi metodami (Publikacja 6). Analizę rozkładu mas cząsteczkowych preparatu albuminy jaja kurzego przeprowadzano w zestawie HPSEC (Publikacja 6). Ciasto do wypieku modelowych chlebków żytnich sporządzano w miesiarce farinografu o pojemności dzieży 50 g (Farinograph E, Brabender) ze skomponowanej modelowej mąki żytniej zawierającej skrobię żytnią, albuminę jaja kurzego, gluten witalny, preparat AX pszennych (Naxus), dodatków technologicznych tj: drożdży, soli (NaCl), sacharozy i kwasu mlekowego. Do mieszanki wyżej wymienionych składników (w sumie 50 g) dodawano taką ilość wody, aby w farinografie uzyskać ciasto o konsystencji 150 j.br. (Publikacja 6). Z uzyskanego ciasta formowano kęsy o masie 60 g, a następnie umieszczano je w foremkach (3 3 4 cm). Każdorazowo po 15 min od momentu rozpoczęcia mieszenia ciasta (w farinografie), uformowane kęsy wstawiano do komory fermentacyjnej pieca piekarskiego firmy Mive Condo. Fermentację kęsów ciasta prowadzono przez 60 min, w komorze fermentacyjnej pieca w temp. 35 C oraz przy wilgotności względnej powietrza wynoszącej 80 %. Wypiek kęsów ciasta prowadzono przez 20 min w komorze wypiekowej pieca piekarskiego Mive Condo, w temp. 230 C. Wypieczone chlebki ważono natychmiast po Strona 15 z 38

wyjęciu z pieca, oznaczając stratę wypiekową, a następnie studzono w temperaturze 20 ± 2 C przez 1 h i ważono, w celu oznaczenia straty upiekowej całkowitej. Objętość chlebków mierzono w laserowym analizatorze objętości Volscan Profiler (Stable Microsystems, Anglia), zgodnie z instrukcją obsługi urządzenia. Objętość chleba przeliczano na 100 g modelowej mieszanki wypiekowej o standardowej wilgotności wynoszącej 14 %. Pomiary wilgotności miękiszu chlebków oraz jego tekstury w dniu wypieku wykonywano analogicznie jak podczas analizy chlebków opisanej w rozdziale 3.2.5.3. 3.2.7. Analiza statystyczna Wszystkie pomiary wykonywane w opracowaniu ( z wyjątkiem oznaczeń 1 H NMR) wykonano co najmniej w 2 powtórzeniach. Analiza statystyczna wyników obejmowała jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA, analizę PCA (Principal Component Analysis), natomiast istotność różnic pomiędzy wartościami średnimi weryfikowano testem Tukey a na poziomie istotności p = 0,05. Obliczenia statystyczne wykonywano stosując program Statistica 10.0 (StatSoft, Tulsa, USA). 4. Wyniki i dyskusja 4.1. Charakterystyka odmian żyta jako źródła AX (Publikacja 1) Istotnym zadaniem postawionym w pracy było uzyskanie informacji odnośnie związku pomiędzy jakością ziarna żyta wyrażona jako masa 1000 ziaren (Buksa i in. 2012) (3 odmian tj. Amilo, Dańkowskie Złote i Kier, uprawianych przez 3 lata), a zawartością i strukturą AX ekstrahowalnych wodą (WEAX) i w konsekwencji wiązaniem wody przez mąkę, która zawiera związki o takiej budowie. Aby uzyskać pełną informację odnośnie właściwości AX oprócz WEAX wyizolowano również arabinoksylany nieekstrahowalne wodą (WUAX). Zadaniem pracy było też przebadanie właściwości molekularnych wyizolowanych rozpuszczalnych w wodzie AX, a dokładniej ekstrahowalnych wodą z całoziarnowej mąki ww. odmian żyta. Strona 16 z 38

Na podstawie tych badań wykazano, że jakość ziarna żyta, czyli jego dorodność określana masą 1000 ziaren, która zależy od warunków panujących w danym roku uprawy (Buksa i in. 2012), wynika też z właściwości strukturalnych AX syntetyzowanych w konkretnych warunkach uprawy. W pierwszym roku uprawy, występujące w małej ilości w dorodnym ziarnie AX ekstrahowalne wodą, odznaczały się najmniejszym stopniem rozgałęzienia (najmniejszy współczynnik A/X, czyli najmniejszy stosunek arabinozy do ksylozy oznaczony metodą HPLC), ale przewagą pojedynczo podstawionych arabinozą reszt ksylozy w łańcuchu arabinoksylanowym oraz najmniejszą średnią masą cząsteczkową. Związki te natomiast występujące w dużej ilości, wyizolowane z drobnego ziarna pochodzącego z 3 roku uprawy charakteryzowały się innymi wartościami wymienionych parametrów, tj. największą średnią masą cząsteczkową, największym stopniem rozgałęzienia i przewagą podwójnie podstawionych arabinozą reszt ksylozy. Jak więc wynika z powyższych danych w kształtowaniu wodochłonności mąki całoziarnowej uzyskanej z przemiału ziarna główną rolę odgrywają WEAX o dużej masie cząsteczkowej i dużym stopniu rozgałęzienia z przewagą podwójnie podstawionych arabinozą reszt ksylozy. Na podstawie przeprowadzonych badań, ze względu na potencjalnie dużą ilość AX w ziarnie i wydajność izolacji, jako optymalne źródło AX ekstrahowalnych wodą wybrano do dalszych badań ziarno odmiany żyta Amilo. 4.2. Izolacja, modyfikacja i analiza właściwości wyizolowanych AX ekstrahowalnych wodą (Publikacja 2 i 3) i bogatej w AX frakcji mąki żytniej MP (Publikacja 5) W związku z brakiem handlowych AX żytnich, potrzebnych do zrealizowania zasadniczego celu omawianego osiągnięcia naukowego, podjeto próbę ich izolacji w dużej ilości, aby te polisacharydy można było zastosować jako dodatek w wypieku chleba żytniego (Publikacja 2). Wykonane wstępne próby wypiekowe, z zastosowaniem udziału wyizolowanych arabinoksylanów metodą laboratoryjną (Buksa i in. 2010), nie były satysfakcjonujące, gdyż używana w trakcie izolacji termostabilna α-amylaza (Bacillus licheniformis) pozostawała w preparatach, nawet po ich oczyszczeniu i powodowała nadmierną hydrolizę skrobi, a w Strona 17 z 38

konsekwencji wadliwy miękisz chleba. Po nieudanych próbach inaktywacji tego enzymu w otrzymanym preparacie arabinoksylanowym, zdecydowano się na ponowną izolację wg opracowanej metody zwanej dalej laboratoryjną (LP), jednakże z zastosowaniem w miejsce termostabilnej α-amylazy (Bacillus licheniformis), amylazy ślinowej (Saliva) (Publikacja 2). Uzyskane według nowego sposobu preparaty (LP) spełniały zakładane wymagania i nadawały się do wypieku chleba (Publikacja 4). Wydajność izolacji arabinoksylanów uzyskanych opracowaną metodą laboratoryjną (LP), po wysuszeniu i oznaczeniu w nich zawartości samych arabinoksylanów, wynosiła ok. 2,1% w przeliczeniu na suchą masę mąki (Publikacja 2, Tabela 1). Wydajność izolacji była duża, zbliżona do wyników osiągniętych przez Hartmann a i in. (2005). Jako preparaty arabinoksylanów ekstrahowalnych wodą uznano także wzbogacone w WEAX mąki żytnie, które można nazwać preparatami przemysłowymi, uzyskane metodą przemysłową przez separację powietrzną cząstek mąki (MP). Zawierały one około 10-cio krotnie mniej arabinoksylanów, a 20-sto krotnie więcej skrobi i dekstryn (Publikacja 5, Tabela 1), w porównaniu do preparatów wyizolowanych metodą laboratoryjną (LP). Wszystkie preparaty (LP i MP) charakteryzowały się zbliżoną, około 15% zawartością białka. Zarówno preparat laboratoryjny (LP) jak i przemysłowy (MP) poddano modyfikacjom opisanym w rozdziale Materiał i metody. Preparaty arabinoksylanowe LP oraz MP, naturalne (NM) i modyfikowane (sieciowane i hydrolizowane), znacznie różniły się między sobą (Publikacja 2, Tabela 2 i Publikacja 5, Tabela 1). Przeprowadzenie podwójnej modyfikacji AX poprzez ich hydrolizę, a następnie usieciowanie (preparat LP HCR) miało zapewnić efektywniejsze usieciowanie polisacharydu (Publikacja 2, Tabele 2 i 3), ale zaproponowana modyfikacja nie spełniła tych oczekiwań. Opracowana metoda, z zastosowaniem HPLC/RI, pozwoliła na dokładne oznaczenie składu węglowodanowego po hydrolizie preparatów arabinoksylanowych. We wszystkich preparatach zidentyfikowano występowanie takich cukrów prostych, jak: arabinoza, ksyloza, glukoza i mannoza (Publikacja 2, Rys. 1). Modyfikowane arabinoksylany, uzyskane na bazie preparatu laboratoryjnego, charakteryzowały się większą zawartością reszt β-d-ksylopiranozy i L-arabinofuranozy, natomiast znacznie mniejszą ilością glukozy, w porównaniu do preparatów uzyskanych na bazie preparatu przemysłowego. Natomiast zarówno modyfikowane preparaty laboratoryjne jak i przemysłowe, po ich hydrolizie nie wykazywały znacznego zróżnicowania pod względem składu węglowodanowego, w obrębie poszczególnej grupy. Strona 18 z 38

Przebadane WEAX w preparatach LP charakteryzowały się większą od AX w preparatach MP proporcją A/X < 1, co świadczy o niedużym stopniu rozgałęzienia AX w preparatach MP, w porównaniu do AX z odmiany żyta Amilo (Publikacja 5, Tabela 1). Zawartość kwasu ferulowego ogółem oznaczono opracowaną autorską metodą, która pozwoliła na wygodne (szybkie i nieskomplikowane) scharakteryzowanie badanych preparatów. Wykazano, że preparaty uzyskane metodą laboratoryjną charakteryzowały się większą zawartością kwasu ferulowego ogółem, w porównaniu do otrzymanych metodą przemysłową, natomiast nie zawierały kwasu ferulowego w formie niezwiązanej (Publikacja 2 i 5). Zawartość kwasu ferulowego ogółem w preparacie uzyskanym metodą laboratoryjną (LP NM) była zbliżona do oznaczonej w preparacie podobnego typu przez Vinkx a i in. (1993) oraz Figueroa-Espinozę i in. (2002). W preparatach niemodyfikowanych i hydrolizowanych, oznaczono większą zawartość kwasu ferulowego, niż w preparatach poddanych sieciowaniu LP CR, MP CR i LP HCR, co prawdopodobnie wynikało z tworzenia się podczas sieciowania dimerów i trimerów kwasu ferulowego. Złożone struktury kwasu ferulowego wykazują bowiem mniejszą czułość przy długości fali 320 nm, użytej do oznaczania jego zawartości (Pan i in. 2002). Zaobserwowane więc różnice w zawartości kwasu ferulowego ogółem, w arabinoksylanach poddanych sieciowaniu w stosunku do niemodyfikowanych i hydrolizowanych, potwierdziły skuteczność tworzenia połączeń (mostków) pomiędzy cząsteczkami kwasu ferulowego. Przeprowadzono również analizę 1 H NMR aby scharakteryzować budowę strukturalną WEAX, ale tylko tych frakcji, które uległy rozpuszczeniu w wodzie podczas przygotowywania próbek do analiz. Metoda ta umożliwiła oznaczenie stopnia podstawienia - proporcji (SR) pojedynczo (w większości 3-Ksylp) do podwójnie (2,3-Ksylp) podstawionych reszt β-d-ksylopiranozy (podrozdział 2.3). Zaobserwowano tendencję wg której wartości współczynnika SR były większe w przypadku AX poddanych sieciowaniu niż niemodyfikowanych i hydrolizowanych (Tabela 2, Publikacja 3), co mogło być skutkiem różnic w rozpuszczalności AX. Duże wartości SR, przy proporcji A/X < 1, wskazują na prawdopodobną obecność łańcuchów arabinofuranozydaz (arabanów) przyłączonych do cząsteczek AX (Biliaderis i Izydorczyk 2007). Kolejne badania dotyczyły charakterystyki molekularnej arabinoksylanów (Publikacja 2, Rys. 3, 4 i 5, Tabela 3, oraz Publikacja 5, Rys. 2, Tabela 1,). W ramach tej charakterystyki oznaczono lepkość graniczną preparatów LP, natomiast we frakcji mąki bogatej w arabinoksylany ekstrahowalne wodą (MP) nie było to możliwe, ze względu na Strona 19 z 38

zawartość w nich nieskleikowanej skrobi. Ponieważ oznaczenie masy cząsteczkowej części preparatów (LP CR i wszystkich preparatów MP), używając zestawu HPSEC/RI nie było możliwe, ze względu na zawartość dużych ilości białek i innych składników mogących uszkodzić kolumny przeznaczone do chromatografii wysokosprawnej, do oceny masy cząsteczkowej wszystkich próbek użyto zestawu do chromatografii żelowej GPC. Zastosowanie techniki GPC pozwoliło zminimalizować ryzyko związane z zablokowaniem kolumn przez duże cząsteczki, a ponadto w zebranych po rozdziale chromatograficznym frakcjach można było oznaczyć selektywnie zawartość pentoz. Stosowany bowiem często w analizie HPSEC/RI detektor refraktometryczny wykrywa, oprócz arabinoksylanów, również wszystkie substancje wpływające na współczynnik załamania światła, które są obecne w preparacie (dekstryny, białka). Arabinoksylany w preparatach usieciowanych (LP CR) uzyskanych metodą laboratoryjną (LP) charakteryzowały się istotnie większą masą cząsteczkową (oznaczoną techniką GPC), lepkością graniczną i wartością współczynnika K H w odniesieniu do niemodyfikowanych (LP NM) oraz kilkakrotnie mniejszą wartością tych parametrów, charakteryzujących preparaty po hydrolizie (LP HYD; Publikacja 2, Tabela 3). W przypadku bogatej w AX frakcji mąki żytniej, uzyskanej metodą przemysłową (MP), obserwowane zmiany masy cząsteczkowej były znacznie mniej widoczne (Publikacja 5, Tabela 1). Zupełnie nieadekwatne do przeprowadzonych modyfikacji właściwości molekularne wykazał natomiast preparat LP HCR, który, mimo etapu sieciowania po pierwotnej hydrolizie, charakteryzował się masą cząsteczkową, współczynnikiem K H oraz lepkością graniczną zbliżoną do LP HYD (Publikacja 2, Tabela 3). Przyczyną tego mógł być duży stopień hydrolizy cząsteczek arabinoksylanów zawartych w preparatach HCR, który przy małej zawartości kwasu ferulowego, mimo potwierdzenia tworzenia się mostków diferulowych, nie skutkował znaczącym zwiększeniem masy cząsteczkowej arabinoksylanów. W badaniach wcześniejszych stwierdzono bowiem, że w cząsteczkach arabinoksylanów 18-60 reszt kwasu ferulowego przypada na 10000 reszt β-d-ksylopiranozy (Dervilly-Pinel et al. 2001). Reasumując, zastosowanie hydrolizy, a następnie usieciowania arabinoksylanów nie spełniło przewidywanych oczekiwań, gdyż sieciowanie zhydrolizowanych arabinoksylanów zaproponowaną metodą przebiegało mało efektywnie i w konsekwencji LP HCR nieznacznie różniły się właściwościami od LP HYD. Strona 20 z 38

Uzyskane modyfikowane preparaty arabinoksylanów ekstrahowalnych wodą, na bazie LP, różniły się właściwościami reologicznymi przebiegiem krzywych płynięcia, oznaczonych w reometrze Haake RS1. Usieciowane arabinoksylany (LP CR) odznaczały się większą lepkością pozorną (dla całego zakresu szybkości ścinania ), niż niemodyfikowane (LP NM; Publikacja 3, Tabela 3 i Rys. 1). Zastosowanie hydrolizy enzymatycznej jako modyfikacji, skutkowało natomiast uzyskaniem preparatów (LP HYD) o mniejszej lepkości ich roztworów. Preparaty zmodyfikowane poprzez hydrolizę enzymatyczną, po której zastosowano sieciowanie, wykazywały lepkości pozorne najbardziej zbliżone do preparatów poddanych hydrolizie. W pomiarach oscylacyjnych przeprowadzonych w zakresie liniowej lepkosprężystości, w 5% wodnych roztworach wszystkich preparatów LP, wyznaczono moduły G i G oraz tan(δ) (Publikacja 3, Rys. 2 i Tabela 3). Wszystkie preparaty LP, z wyjątkiem LP CR, odznaczały się głównie właściwościami lepkimi, ponieważ G > G i tan(δ) > 1. Jedynie preparat LP CR zawierający usieciowane polimery wykazywał właściwości słabosprężyste, o czym świadczy G > G, tan(δ) < 1 (Publikacja 3, Rys. 2 i Tabela 3). 4.3. Właściwości ciasta z udziałem AX (Publikacja 3, 4 i 5) Właściwości ciasta w dużym stopniu zależą od zdolności wiązania wody przez mąkę. Do tego oznaczenia w praktyce laboratoryjnej stosuje się Farinograf, którym oznacza się ilość wody potrzebną do uzyskania ciasta o konsystencji 500 j.br., co wówczas nazywamy wodochłonnością. Można też w tym aparacie oznaczać ilość wody potrzebną do uzyskania konkretnej konsystencji. W przypadku ciasta na chleb żytni jest to często konsystencja 150 j.br. Ponieważ ilość dodawanej wody zależy w dużym stopniu od rodzaju mąki, dlatego zastosowano do badań mąki różnego typu, uzyskane zarówno metodą laboratoryjną z ziarna żyta odmiany Amilo, jak i przemysłową. Oznaczony dodatek wody do sporządzenia ciasta o konsystencji wynoszącej 150 j.br. był większy w przypadku użycia mąki typu 1150, niż typu 720 (Publikacja 4, Tabela 2 i Publikacja 5, Tabela 2), ze względu na jej większą wodochłonność. Wynikało to z większej zawartości błonnika (w tym arabinoksylanów) i białka w mąkach ciemniejszych, szczególnie w handlowej, w porównaniu do mąki z ziarna żyta odmiany Amilo (Publikacja 4, Tabela 1). Strona 21 z 38

Ilość dodawanej wody podczas sporządzania ciasta zależy też od stosowanych substancji dodatkowych, które mają być jego składnikami (Biliaderis i Izydorczyk 2007; Biliaderis i in. 1995). Jednym z celów prac było ustalenie ilości wody potrzebnej do sporządzenia ciasta z różnych rodzajów mąk żytnich z udziałem preparatów arabinoksylanowych (LP) oraz preparatów bogatej w arabinoksylany ekstrahowalne wodą frakcji mąki żytniej (MP), niemodyfikowanych i poddanych modyfikacjom (sieciowaniu i hydrolizie, a w przypadku preparatów LP również hydrolizie/usieciowaniu), aby uzyskać ciasto o konsystencji 150 j.br. Udział wszystkich preparatów arabinoksylanowych uzyskanych metodą laboratoryjną (LP) w ilości 1 i 2% masy mąki jak i 10% udziału preparatów frakcji mąki bogatej w AX ekstrahowalne wodą, uzyskanych metodą przemysłową (MP), niemodyfikowanych i poddanych modyfikacjom, znacznie zwiększał wodochłonność wszystkich mąk, szczególnie typu 720 (Publikacja 4, Tabela 2 i Publikacja 5, Tabela 2). Największy wzrost tego parametru zaobserwowano w wyniku dodawania usieciowanych preparatów, uzyskanych metodą laboratoryjną (LP CR, Publikacja 4, Tabela 2). Dobrze to obrazuje zaproponowany model (Publikacja 3, Rys. 4), który przedstawia możliwe struktury AX otoczone przez powłoki złożone z cząsteczek wody. Arabinoksylany usieciowane są sol watowane przez cząsteczki wody, która dodatkowo jest zamknięta (zokludowana) wewnątrz sieci utworzonej z usieciowanych arabinoksylanów, połączonych mostkami ferulowymi (Publikacja 3). Strona 22 z 38

Rys. 1. Model możliwych struktur tworzonych przez cząsteczki arabinoksylanów: (a) nie modyfikowanych; (b) usieciowanych; (c) hydrolizowanych, otoczone powłokami z cząsteczek wody (Publikacja 3, Rys 4). Udział wszystkich preparatów LP (w ilości 1 i 2%), z wyjątkiem usieciowanych, wpływał korzystnie na właściwości ciasta, z mąki typu 720, wykazując tendencję do zmniejszania jego twardości i adhezyjności (Tabela 2, Publikacja 4). Parametry ciasta sporządzonego z mąki z ziarna żyta odmiany Amilo, w małym stopniu ulegały zmianom pod względem twardości i adhezyjności, po dodaniu preparatów LP, ponieważ już ciasto wzorcowe (bez udziału preparatów) było mniej twarde i o mniejszej adhezyjności. Preparaty uzyskane metodą przemysłową (MP), zarówno naturalny jak i modyfikowane, obecne w cieście w ilości 10%, wykazywały również tendencję do zmniejszania twardości i adhezyjności tego ciasta. Najsłabsze efekty na właściwości ciasta wykazał udział preparatu MP CR (Publikacja 5, Tabela 2). Dodatek preparatów arabinoksylanowych (LP - 1 i 2% oraz MP 10%) do mąki typu 1150 spowodował również znaczne zwiększenie jej wodochłonności (Publikacja 4, Tabela 2 i Publikacja 5, Tabela 2). Największy wzrost tego parametru zaobserwowano w wyniku dodawania preparatów usieciowanych (CR). Jednakże preparaty LP, zwłaszcza preparat usieciowany LP CR, dodane do mąk typu 1150, handlowej oraz z ziarna Amilo, wykazywały tendencję do pogarszania właściwości Strona 23 z 38

ciasta, zwiększając jego twardość i adhezyjność w stosunku do wzorca (ciasta bez dodatkowego udziału AX). Przy 10% udziale preparatów MP zauważono tendencję do zmniejszenia twardości i adhezyjności ciasta (Publikacja 5, Tabela 2). 4.4. Właściwości chlebków wypieczonych metodą tradycyjną z udziałem arabinoksylanów (Publikacja 4 i 5) i ocena procesu ich starzenia się (Publikacja 5) Zasadniczym celem omawianego osiągnięcia naukowego i głównym zadaniem publikacji 4 i 5 było wypieczenie chlebków z mąki żytniej różnych typów, z udziałem preparatów arabinoksylanów ekstrahowalnych wodą uzyskanych metodą laboratoryjną (LP) i preparatów bogatej w AX frakcji mąki żytniej (MP), niemodyfikowanych i poddanych modyfikacjom (hydrolizie, sieciowaniu, w przypadku preparatów LP również hydrolizie/usieciowaniu), aby wykazać wpływ tych preparatów na właściwości uzyskanego pieczywa. Ważnym celem było również sprawdzenie, czy z oceny jakości ciasta przeprowadzonej w teksturometrze TAXT.Plus można przewidzieć jakość chleba oraz czy zastosowane preparaty wpłyną na proces starzenia się badanych chlebków. Do wypieku chlebków zastosowano ciasta, których właściwości omówiono w p. 4.3. Zaobserwowano tendencję do zmniejszania się straty wypiekowej (upieku) chlebków z handlowej mąki żytniej typu 1150, wypieczonych z 1 i 2% udziałem preparatów arabinoksylanowych LP (Publikacja 4, Tabela 4), natomiast przy zastosowaniu handlowej mąki żytniej typu 720 wartość tej cechy pozostawała bez zmian, w porównaniu do chlebków standardowych. Było to konsekwencją dużej zdolności arabinoksylanów do wiązania wody, większej w chlebkach z mąki 1150 (bez dodatków i z dodatkami), w której tych związków jest więcej niż w mące typu 720. Zależności te nie potwierdziły się w przypadku mąki uzyskanej z ziarna żyta odmiany Amilo, gdyż większy dodatek preparatu arabinoksylanowego (2%), skutkował większą stratą wypiekową, w porównaniu do chlebka standardowego. Przyczyną mogła być inna granulacja i skład chemiczny tych mąk, w porównaniu do handlowych (Publikacja 4, Tabela 1). Stosując do wszystkich mąk dodatek preparatów arabinoksylanowych (LP lub MP), naturalnych i modyfikowanych, generalnie uzyskano zwiększenie objętości chlebków żytnich oraz zmniejszenie twardości ich miękiszu (Publikacja 4, Tabela 4 i Publikacja 5, Tabela 3). Wyjątek stanowiły tylko chlebki z udziałem preparatu LP CR, dodawanego do mąki typu Strona 24 z 38

1150 (ze względu na ich małą objętość) oraz chlebek uzyskany z udziałem preparatu MP CR i mąki typu 720 (ze względu na dużą twardość miękiszu). Przy użyciu mąki handlowej typu 720 z dodatkiem większości preparatów arabinoksylanowych, wilgotność miękiszu chlebków wzrosła, a w pozostałych przypadkach nie odbiegała od chlebka wzorcowego. Badając właściwości ciasta z udziałem preparatów arabinoksylanów (LP i MP) można było przewidzieć jakość chleba. Preparaty usieciowanych arabinoksylanów (CR) o największej wśród zastosowanych preparatów masie cząsteczkowej, dodane do mąki, mimo uzyskanej przez nią największej wodochłonności sprzyjały dużej twardości i adhezyjności ciasta, co skutkowało dużą wilgotnością jego miękiszu, ale i dużą twardością chleba. Zależność była wyraźniej widoczna, gdy stosowano mąkę typu 720, niż 1150. Stosując analizę PCA można przedstawić związek pomiędzy większością parametrów określających stosowane preparaty AX, a jakością ciasta i chleba (Publikacja 4, Rys. 1). Bazując na uzyskanych rezultatach analizy PCA zaproponowano model ciasta żytniego uzyskanego z mąki z udziałem arabinoksylanów, uwzględniający wielkość cząsteczki AX i rozpuszczalność tego polisacharydu. Mimo mniejszej wodochłonności mąki z udziałem arabinoksylanów hydrolizowanych (HYD), w porównaniu do usieciowanych (CR), AX hydrolizowane, rozpuszczalne, o krótkich łańcuchach, lepiej stabilizowały pęcherzyki gazowe w cieście, co w konsekwencji skutkowało chlebkiem o większej objętości i mniej twardym miękiszu. Strona 25 z 38

Rys. 2. Mechanizm działania arabinoksylanów rozpuszczalnych w wodzie (ekstrahowalnych wodą) w wypieku chleba żytniego (Publikacja 4, Rys. 2). Reasumując można stwierdzić, że dobre efekty wypiekowe (w szczególności dużą objętość chlebka i małą twardość jego miękiszu) uzyskano z mąki typu 720, w wyniku zastosowania preparatu uzyskanego metodą laboratoryjną, niemodyfikowanego (LP NM), Strona 26 z 38

hydrolizowanego (LP HYD) i hydrolizowanego/ usieciowanego (LP HCR), jak również preparatu przemysłowego w formie niezmodyfikowanej (MP NM) oraz poddanego hydrolizie (MP HYD). Udział preparatów arabinoksylanowych LP i MP, naturalnych i zmodyfikowanych (z wyjątkiem CR) do mąki typu 1150 spowodował zwiększenie objętości wypieczonych chlebków oraz obniżenie twardości miękiszu, bez zmiany jego wilgotności (Publikacja 4, Tabela 4 i Publikacja 5, Tabela 3), w porównaniu do chlebków bez dodatkowego udziału AX. Zastosowanie udziału preparatów arabinoksylanów LP i MP naturalnych i zmodyfikowanych podczas przygotowania ciasta z mąki żytniej (w większym stopniu typu 720) skutkowało mniejszym wzrostem twardości miękiszu (najmniejszym w przypadku użycia AX niemodyfikowanych) i mniejszą utratą jego wilgotności (najmniejszą w przypadku użycia AX usieciowanych) w stosunku do chlebka wzorcowego (Publikacja 5, Tabela 5). 4.5. Ocena właściwości arabinoksylanów pszennych w preparacie Naxus (Publikacja 6) Zadaniem podjętym w tej publikacji było przebadanie właściwości pszennych AX (preparat Naxus) ekstrahowalnych wodą i sprawdzenie go jako komponenta mąki do wypieku chlebka modelowego. W tym celu skomponowano modelową mąkę, złożoną z dostępnego w handlu preparatu pszennych AX, wyizolowanej skrobi żytniej i białka stanowiącego mieszaninę albuminy jaja kurzego oraz komercyjnego glutenu pszennego witalnego. Po ustaleniu warunków fermentacji i wypieku metodą bezpośrednią uzyskano modelowe chlebki, które poddano analizie. Preparat pszennych AX charakteryzował się zbliżoną zawartością czystych arabinoksylanów oraz o połowę mniejszą zawartością białka (Publikacja 6, Tabela 2), w porównaniu z AX otrzymanymi metodą laboratoryjną z całoziarnowej mąki żytniej. Stosunek zawartości arabinozy do ksylozy (A/X; Publikacja 6, Tabela 2) był podobny do żytnich arabinoksylanów, natomiast w odróżnieniu do arabinoksylanów żytnich, stwierdzono 7,4% udział galaktozy (Publikacja 6, Tabela 2), najprawdopodobniej stanowiącej składnik arabinogalaktanów występujących w ziarnie pszenicy. Pszenne AX charakteryzowały się mniejszą masą cząsteczkową (Publikacja 6, Rys. 1, Tabela 2) i małą lepkością graniczną, w porównaniu z żytnimi AX. Różnice te mogą wynikać z zastosowania innego surowca, ale Strona 27 z 38

przede wszystkim z warunków procesu izolacji AX, sugerujących ich częściową hydrolizę w preparacie pszennych AX. Na podstawie wyników wykonanych prób, do sporządzenia ciasta na modelowe chlebki żytnie wybrano mieszankę o składzie: 83% skrobi żytniej, 6% preparatu pszennych arabinoksylanów (preparat Naxus) oraz 6% mieszaniny albuminy i glutenu (w proporcji 7: 3). Stwierdzono, że taką mieszankę można uznać za modelową mąkę, z której po uzupełnieniu dodatkami technologicznymi w postaci: 1,5% soli, 1% cukru, 2,5% drożdży i 1 M roztworu kwasu mlekowego w ilości potrzebnej do uzyskania ph = 4,3 można uzyskać ciasto. Sporządzono je w mieszarce farinografu, przy 58 cm 3 dodatku wody, aby uzyskać konsystencję 150 j.br. Arabinoksylany wchodzące w skład preparatu Naxus o znacznie mniejszej masie cząsteczkowej niż arabinoksylany żytnie, jak również białko użyte w ww. proporcjach, do sporządzenia ciasta poddawanego fermentacji, pozwoliły uzyskać produkt końcowy w dużym stopniu zbliżony do chleba żytniego. 5. Wnioski 1. Opracowana metoda izolacji arabinoksylanów ekstrahowalnych wodą z żytniej mąki całoziarnowej była właściwa, ponieważ uzyskany preparat cechowała duża wydajność, a ponadto charakteryzował się on zadowalającym stopniem oczyszczenia ze składników niearabinoksylanowych (zawartość czystych AX ok. 70%), aby można go było zastosować jako istotny składnik ciasta do wypieku chleba. 2. Zaproponowane metody modyfikacji preparatów arabinoksylanów ekstrahowalnych wodą, zarówno LP jak i MP, zhydrolizowanych jak również usieciowanych były efektywne i doprowadziły do uzyskania nowych preparatów, o odmiennych właściwościach potwierdzonych ich charakterystyką molekularną. 3. Stwierdzono, że udział preparatów modyfikowanych w mące żytniej typu 720 i 1150 (handlowych i z przemiału laboratoryjnego ziarna odmiany Amilo), a w szczególności w jasnej handlowej mące typu 720, doprowadził do wzrostu wodochłonności mąki, proporcjonalnie do ich ilości i masy cząsteczkowej. Zaproponowano model możliwych struktur obecnych w cieście, tworzących się z arabinoksylanów i cząsteczek wody, które tłumaczą różną zdolność wiązania wody przez te polisacharydy. Strona 28 z 38

4. Stwierdzono, że opierając się na właściwościach teksturalnych ciasta, można przewidzieć właściwości chleba, bowiem chleb uzyskany z ciasta o małej twardości i adhezyjności charakteryzował się znacznie większą objętością i małą twardością miękiszu. 5. Zaproponowano model, który tłumaczy rolę masy cząsteczkowej AX w mechanizmie tworzenia się ciasta i miękiszu chleba z mąki żytniej z udziałem AX. 6. Mimo największej zdolności do wiązania wody przez arabinoksylany usieciowane (CR), właściwości ciasta z mąk żytnich z ich udziałem odznaczały się najgorszymi cechami jakościowymi tj. dużą adhezyjnością i twardością, szczególnie przy stosowaniu ciemnej, o większej popiołowości mąki handlowej typu 1150. 7. Największą poprawę jakości ciasta i chleba uzyskano przez zastosowanie 2% udziału arabinoksylanów zhydrolizowanych uzyskanych metodą laboratoryjną (LP HYD) oraz w mniejszym stopniu takiego samego udziału niemodyfikowanego preparatu laboratoryjnego (LP NM). Podobny efekt uzyskano stosując pięciokrotnie większy, tj 10% udział przemysłowego preparatu AX (MP), zarówno naturalnego jak i poddanego modyfikacji, niezależnie od jej rodzaju. 8. Na podstawie wszystkich badań stwierdzono, iż rola AX w wypieku chleba żytniego jest niezastąpiona, a ich mała masa cząsteczkowa, warunkująca ich bardzo dobrą rozpuszczalność w wodzie, wywiera szczególnie korzystny wpływ na właściwości chleba. 6. Literatura 1. Biliaderis, C. G., Izydorczyk, M. S. (2007). Functional food carbohydrates: CRC Press, Taylor & Francis Group. 2. Biliaderis, C. G., Izydorczyk, M. S., Rattan, O. (1995). Effect of arabinoxylans on bread-making quality of wheat flours. Food Chemistry, 53(2), 165-171. 3. Buksa, K., Nowotna, A., Praznik, W., Gambuś, H., Ziobro, R., Krawontka, J. (2010). The role of pentosans and starch in baking of wholemeal rye bread. Food Research International, 43(8), 2045-2051. 4. Bushuk, W. (2001). Rye: Production, Chemistry, and Technology. Second Edition. In). AAOCC St. Paul, Minnesota. 5. Denli, E., Ercan, R. (2001). Efect of Added Pentosans Isolated from Wheat and Rye Grain on some Properties of Bread. European Food Research and Technology, 212, 374 376. Strona 29 z 38

6. Dervilly-Pinel, G., Rimsten, L., Saulnier, L., Andersson, R., Aman, P. (2001). Water-extractable Arabinoxylan from Pearled Flours of Wheat, Barley, Rye and Triticale. Evidence for the Presence of Ferulic Acid Dimers and their Involvement in Gel Formation. Journal of Cereal Science, 34(207-214). 7. Figueroa-Espinoza, M. C., Poulsen, C., Borch Soe, J., Zargahi, M. R., Rouau, X. (2002). Enzymatic solubilization of arabinoxylans from isolated rye arabinoxylans and rye flour by different endoxylanases and other hydrolyzing enzymes. Effect of a fungal laccase on the flour extracts oxidative gelatination.. J Agric Food Chem, 50, 6473-6484. 8. Hartmann, G., Piber, M., Koehler, P. (2005). Isolation and chemical characterization of waterextractable arabinoxylans from wheat and rye during breadmaking. European Food Research and Technology, 221, 487-492. 9. Hashimoto, S., Shogren, M. D., Pomeranz, Y. (1987). Cereal arabinoxylans: their estimation and significance. I arabinoxylans in wheat and milled wheat products. Cereal Chemistry, 64, 30-34. 10. Hoffman, R. A., Geijtenbeek, T., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. G. (1992a). 1H-NMR study of enzymically generated wheat-endosperm arabinoxylan oligosaccharides: structures of hepta- to tetradeca- saccharides containing two or three branched xylose residues. Carbohydrate Research, 223, 19-44. 11. Hoffman, R. A., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. G. (1992b). Structural features of a water-soluble arabinoxylan from the endosperm of wheat. Carbohydrate Research, 226, 303-311. 12. Izydorczyk, M. S., Biliaderis, C. G. (1993). Structural heterogenity of wheat endosperm arabinoxylans. Cereal Chemistry, 70(6), 641-646. 13. Izydorczyk, M. S., Biliaderis, C. G. (1995). Cereal arabinoxylans: advances in structure and physicochemical properties. Carbohydrate Polymers, 28(1), 33-48. 14. Joseleau, J. P., Chambat, G., Vignon, M., Barnoud, F. (1977). Chemical and 13C-NMR studies on two arabinans from the inner bark of young stems of Rosa glauca. Carbohydrare Research, 58, 165. 15. Migliori, M., Gabriele, D. (2010). Effect of pentosan addition on dough rheological properties. Food Research International, 43(9), 2315-2320. 16. Pan, G. X., Thompson, C. I., Leary, G. J. (2002). Uv-vis, spectroscopic characteristics of ferulic acid and related compounds. Journal of Wood Chemistry and Technology, 22, 137-146. 17. Roubroeks, J. P., Andersson, R., Aman, P. (2000). Structural features of (1-3),(1-4)-B-D-glucan and arabinoxylan fractions isolated from rye bran. Carbohydrate Polymers, 42, 3-11. 18. Vinkx, C. J. A., Reynaert, H. R., Grobet, P. J., Delcour, J. A. (1993). Physicochemical and functional properties of rye nonstarch polysaccharides V. Variability in the structure of water-soluble arabinoxylans. Cereal Chemistry, 70(311-317). 19. Vinkx, C. J. A., Stevens, I., Gruppen, H., Gobet, P. J., Delcour, J. A. (1995). Physicochemical and functional properties of rye nonstarch polysaccharides. VI. Variability in the structure of waterunextractable arabinoxylans. Cereal Cemistry, 72(4), 411-418. Strona 30 z 38

d) Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych Oprócz badań nad rolą ekstrahowalnych wodą żytnich arabinoksylanów, o różnej masie cząsteczkowej, naturalnych i zmodyfikowanych, w kształtowaniu jakości chleba żytniego moje zainteresowania badawcze dotyczyły głownie: 1. towaroznawczej analizy ziarna różnych odmian żyta 2. zastosowania w piekarstwie mąki całoziarnowej z ziarna różnych odmian żyta 3. możliwości poprawy właściwości mąki żytniej 4. właściwości skrobi różnego pochodzenia botanicznego 5. właściwości i możliwości zastosowania innych niż arabinoksylany nieskrobiowych polisacharydów Ad 1. Na podstawie towaroznawczej analizy ziarna żyta 5 polskich odmian populacyjnych uprawianych przez 3 lata: 2004-2006 oraz ich składu chemicznego (Załącznik 6; II-D9) stwierdzono zależność jakości ziarna głównie od roku jego uprawy, a w mniejszym stopniu od odmiany. W ostatnim (trzecim) roku uprawy, który charakteryzował się najmniejszą ilością opadów, żyto badanych odmian tj. Amilo, Dańkowskie Złote, Kier, Walet oraz Warko odznaczało się drobnym ziarnem, a mąka całoziarnowa z niego uzyskana zawierała największą ilość białka i arabinoksylanów (zwanych w pracy pentozanami), a najmniejszą skrobi. Ad 2. Badania odnośnie całoziarnowej mąki z różnych odmian żyta dotyczyły zastosowania jej w piekarstwie (Załącznik 6; II-D2, przed doktoratem), oraz roli związków chemicznych wchodzących w skład takiej mąki w kształtowaniu jakości wypieczonego z niej chleba (Załącznik 6; II-D5, przed doktoratem) i procesie jego starzenia się (Załącznik 6; II-D4, przed doktoratem). Ziarno kilku odmian populacyjnych, w tym Amilo, znanej z niskiej aktywności enzymatycznej, oraz Dańkowskie Złote jako jednej z najstarszych uprawianych w Polsce (Buksa i in. 2010), charakteryzowało się niską (lecz różną) aktywnością enzymatyczną, a mąka całoziarnowa zróżnicowanym składem chemicznym, a więc też zróżnicowaną absorpcją wody i właściwościami wypiekowymi. Wśród badanych odmian mąka całoziarnowa z ziarna Strona 31 z 38

żyta odmiany Amilo odznaczała się największą zawartością arabinoksylanów (12%, w tym dużą ilością arabinoksylanów rozpuszczalnych w wodzie), dużą wodochłonnością, a uzyskany chleb wykazywał dużą objętość, jego miękisz w najmniejszym stopniu tracił wilgotność i najmniej twardniał (Załącznik 6; II-D4, II-D5). Stwierdzono, że z mąk całoziarnowych uzyskanych z ziarna żyta odmiany mieszańcowej Nawid, jak również syntetycznej Caroass można wypiec chleb o cechach nieodbiegających od uzyskanego z całoziarnowych mąk odmian populacyjnych (Załącznik 6; II-D2). W kolejnej pracy (Załącznik 6; II-A1) skorelowano parametry jakości chleba uzyskanego z całoziarnowej mąki żytniej z właściwościami skrobi i pentozanów w niej obecnych. Stwierdzono, że chleby o największej objętości uzyskuje się z mąk, które charakteryzują się dużą wartością proporcji AX rozpuszczalnych do całkowitych, proporcją AX rozpuszczalnych do skrobi jak: 1:16 i 1:20. Ponadto mąki na taki chleb charakteryzowały się skrobią o dużej zawartości amylozy, dobrej zdolności do pęcznienia (dużym współczynnikiem pęcznienia SF), a w konsekwencji dużą rozpuszczalnością i wysoką temperaturą kleikowania. Zawartość wody w chlebie żytnim z mąki całoziarnowej była bardziej determinowana przez zawartość błonnika, w skład którego wchodziły arabinoksylany, w porównaniu do skrobi. Właściwości skrobi, które uznawane są za szczególnie ważne w kształtowaniu wilgotności miękiszu to: zawartość amylozy, zdolność do pęcznienia i kleikowania. Zaobserwowano zmniejszenie twardości miękiszu chleba w obecności arabinoksylanów rozpuszczalnych w wodzie cechujących się dużą masą cząsteczkową. Zastosowaniu skrobi o dużej zawartości amylozy, dużym współczynniku pęcznienia i małej średniej masie cząsteczkowej towarzyszył wzrost twardości miękiszu chleba. W pracy (Załącznik 6; II-D15) zaproponowano nową metodę oznaczania wodochłonności mąki przy zastosowaniu teksturometru (z sondą P20 o średnicy 15mm), a wyniki porównano z uzyskanymi poprzez pomiar w powszechnie stosowanym Farinografie firmy Brabender oraz sporadycznie używaną wytłaczarką RWAM firmy Simon. Stwierdzono, że oznaczenie wodochłonności całoziarnowej mąki żytniej w Farinografie nie było możliwe, natomiast zastosowanie teksturometru oraz wytłaczarki RWAM dało dobre efekty, a wartości wodochłonności mąk żytnich o małej zawartości popiołu, niezależnie od zastosowanego aparatu, były zbliżone. Ze względu na częste stosowanie teksturometru w laboratoriach badawczych, można polecić ten aparat do oznaczania wodochłonności mąki różnych typów. Strona 32 z 38

Ad 3. Badając możliwości poprawy właściwości mąki żytniej (Załącznik 6; II-A2) wykazano znaczący efekt działania na frakcję rozpuszczalną mąki żytniej typu 1150 (z ziarna odmiany Amilo) substancji o działaniu utleniającym (nadtlenek wodoru i peroksydaza, kwas askorbinowy i jodan potasu - KIO 3 ) w kierunku tworzenia arabinoksylanowo białkowych wiązań sieciujących, co skutkowało wiązaniem dużych ilości wody przez hydrokoloidy i okazało się kluczowe przy sporządzaniu ciasta. Podobne badania były wykonywane przez innych autorów, ale wyłącznie w odniesieniu do mąki pszennej. Ze względu na znacznie większy wzrost lepkości ekstraktu i twardości jego żelu w wyniku usieciowania H 2 O 2 (z udziałem peroksydazy), niż kwasu askorbinowego (który działa głównie na białko) stwierdzono, ze arabinoksylany są głównym substratem mąki żytniej, który uległ reakcji usieciowania. Dodatek 0,5% preparatu wyizolowanych arabinoksylanów (w pracy nazwanych pentozanami) rozpuszczalnych w wodzie (w pracy nazwanych pentozanami) znacząco zwiększył wodochłonność badanych mąk handlowych typu 720 i 1150 (Załącznik 6; II-D8). Chleby wypieczone z udziałem tego preparatu wykazywały znacznie większą objętość i odznaczały się mniejszą twardością miękiszu, w porównaniu do chlebów wypieczonych bez jego udziału. Pomimo zastosowania większego dodatku wody do ciast na chleby z udziałem preparatu arabinoksylanowego, adhezyjność miękiszu wszystkich badanych chlebów pozostawała na podobnym poziomie. Udział 0,5% preparatu arabinoksylanowego skutecznie hamował również twardnienie i utratę wilgotności miękiszu chleba żytniego, podczas jego przechowywania. Ad 4. Badając zdolność do retrogradacji skrobi pszennych i żytnich, uzyskanych z mąk handlowych i z przemiału laboratoryjnego (Załącznik 6; II-D3, przed doktoratem), stwierdzono największą podatność na retrogradację skrobi z ziarna żyta odmiany Amilo, która charakteryzowała się najmniejszą aktywnością enzymatyczną. Skrobia ta charakteryzowała się największą zawartością amylozy (o ok. 3%). Problem rozpuszczania skrobi jest ważny ze względów teoretycznych jak również analityki tego polisacharydu. Badano skrobie naturalne i ekstrudowane po 1, 4 i 7 dniach rozpuszczania w 0,5M NaOH w 35 C, oznaczając ich: redukcyjność, lepkość graniczną i rozkład mas cząsteczkowych (profile SEC, Załącznik 6; II-A3). Długi czas rozpuszczania ziarenek skrobiowych prowadził do ciągłej dezintegracji ich zwartej struktury krystalicznej i Strona 33 z 38

części amorficznej, co skutkowało równoczesnym rozpadem wiązań wodorowych pomiędzy łańcuchami polisacharydu. W efekcie następowało systematyczne uwalnianie łańcuchów amylozy i amylopektyny z agregatów cząsteczek. Świadczyły o tym zmniejszające się wartości lepkości granicznej oraz zmiany w kształcie profili SEC. Uzyskane wyniki potwierdziły, że skrobie ekstrudowane rozpuszczały się szybciej, w porównaniu do natywnych. W pracy (Załącznik 6; II-A4) wykazano, iż właściwości fizyczno chemiczne skrobi ziemniaczanej modyfikowanej poprzez: utlenienie, ekstruzję i kombinację tych dwóch metod, różniły się zdolnością wiązania wody i rozpuszczalnością. Skrobie utlenione różniły się nieznacznie od skrobi natywnej, podczas gdy ekstruzja skutkowała dużymi zmianami oznaczonych parametrów. Największą zmianę masy cząsteczkowej zaobserwowano w wyniku zastosowania kombinacji utleniania i ekstruzji, natomiast najmniejszą w wyniku ekstruzji. Modyfikacje skrobi wpłynęły na jej właściwości reologiczne powodując zmniejszenie lepkości i zwiększenie podatności na siły ścinające podczas pomiaru krzywych płyniecia. Ad 5. Moje zainteresowania dotyczyły także właściwości hydrokoloidów i ich zastosowania w przemyśle spożywczym (Załącznik 6; II-D6, przed doktoratem). Zajmowałem się badaniami wodochłonności mąki pszennej po dodaniu do niej różnych polisacharydów nieskrobiowych (β-glukanów, arabinoksylanów, inuliny; Załącznik 6; II-D7). W badaniach tych wykazano, że wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej polisacharydów wartość tego parametru ulegała zwiększeniu. Ze względu na niezwykle cenny skład ziarna owsa, zarówno z żywieniowego jak i technologicznego punktu widzenia, włączony byłem w prace prowadzone w Katedrze Technologii Węglowodanów dotyczące tego zboża (Załącznik 6; II-D10, II-D11, II-A5). Prowadzone badania dotyczące wpływu β-glukanów (pochodzących z ziarna owsa), na właściwości chleba bezglutenowego (Załącznik 6; II-D10) wykazały, że preparat tego polisacharydu może być stosowany z powodzeniem w wypieku chleba bezglutenowego. Z kolei badania z zastosowaniem dodatku białek z ziarna tego zboża do chleba pszennego (Załącznik 6; II-D11) wykazały poprawę wartości odżywczej tego chleba, pogarszając jego jakość. Z ziarna owsa po produkcji koncentratu β-glukanów metodą mikronizacji, pozostaje produkt uboczny tzw. mąka resztkowa. Stwierdzono (Załącznik 6; II-A5), że proces ten Strona 34 z 38

spowodował tylko niewielkie uszkodzenie skrobi w takiej mące, co nie wpłynęło na jej masę cząsteczkową. Udowodniono również, że mąka resztkowa owsiana nie różni się od naturalnej (nie poddanej mikronizacji), a analizowane 10% zawiesiny obu mąk owsianych, charakteryzowały się dwukrotnie większą lepkością w temperaturze ok. 95 C i po ochłodzeniu, w porównaniu do zawiesiny mąki pszennej o tym samym stężeniu. Uzyskane kleki z mąk owsianych były jednakże mniej odporne na mechaniczne ścinanie, niż kleiki z mąki pszennej. W ostatnich latach uczestniczyłem także w badaniach dotyczących analizy kwasów fenolowych w winach i miodach pitnych (Załącznik 6, II-A6 i II-A7) oraz badań modelowych związanych z wypiekiem chleba żytniego (Załącznik 6, II-D13, II-D14, Grant II-I5). Moje zaangażowanie w prowadzenie przedmiotu dotyczącego opracowywania nowych artykułów żywnościowych poskutkowało opublikowaniem rozdziału w monografii stanowiącej podręcznik dla studentów (Załącznik 6, II-D12). Wygłosiłem także referat w ramach udziału w Szkole Letniej: The food industry in Europe: Tradition and innovation co zaowocowało rozdziałem w monografii poświęconym innowacyjnym produktom cukierniczym (Załącznik 6; II-D1, przed doktoratem). Jestem również autorem 6 publikacji o charakterze popularnonaukowym, w pismach branżowych. Pełną listę moich publikacji i doniesień na konferencje naukowe przedstawiłem w załączniku nr 6. e) Podsumowanie dorobku naukowego Szczegółowy wykaz opublikowanych prac naukowych zawarty został w Załączniku nr 6. Przedstawiony w nim dorobek naukowy obejmuje 132 pozycje, w tym: - 15 oryginalnych prac twórczych, niewchodzących w skład osiągnięcia naukowego - 6 prac popularnonaukowych w czasopismach branżowych - 7 rozdziałów w monografiach - 98 komunikatów naukowych na konferencje zagraniczne (74) i krajowe (24) Strona 35 z 38

6. 6th International Conference on Polysaccharides-Glycoscience, Prague, 29 September - 1 October 2010, 7. 38th International Conference of SSCHE, Tatranske Matliare, Slovakia, 23-27 May 2011, 8. 7th International Conference on Polysaccharides-Glycoscience Prague, 2 4 November 2011, 9. 39th International Conference of SSCHE, Tatranske Matliare, Slovakia, 21-25 May 2012, 10. 8th International Conference on Polysaccharides-Glycoscience. Prague, 28-30 November 2012, 11. 40th International Conference of SSCHE, Tatranske Matliare, Slovakia, 27-31 May 2013. 12. XLI Sesja Naukowa Komitetu Nauk o Żywności PAN, Kraków, 2-3 lipca 2013, 13. III Krajowa Konferencja Naturalne substancje roślinne aspekty strukturalne i aplikacyjne. Puławy, 4-6 września 2013, 14. 9th International Conference on Polysaccharides-Glycoscience. Prague, 6-8 November 2013, 15. 41th International Conference of SSCHE, Tatranske Matliare, Slovakia, 26-30 May 2014, 16. 10th International Conference on Polysaccharides-Glycoscience. Prague, 22-24 October, 2014, Wygłosiłem 6 referatów ustnych: 1) Referat pt. Fom typical to new food product Jellies. Szkoła letnia: The food industry in Europe Tradition and innovation. Cracow, Jully 2006. 2) Referat pt. Rola składników chemicznych ziarna polskich odmian żyta w kształtowaniu objętości chleba, Sesja Naukowa: Doktorant a rozwój nauk rolniczych. Wielokierunkowość badań w rolnictwie. Kraków 10 Marzec 2007. 3) Referat pt. Characterization and application of cereal cell wall polysaccharides considering arabinoxylans as an example, Konferencja: Ősterreichische Gesellschaft für Biotechnologie. Graz, 15-16 November 2007. 4) Referat pt. Isolation and characterization of arabinoxylans from cereals, Wygłoszony w ramach kursu (Intensive Programe) o tematyce dotyczącej surowców odnawialnych; Austria, Karl-Franzens Universität (KFUG) Graz, 29-06-2009 do 11-07-2009. 5) Referat pt. Isolation and characterization of arabinoxylan from cereals. 5th International Conference on Polysaccharides-Glycoscience Prague 11-13 November 2009. 6) Referat pt. Comparison of physico-chemical and molecular properties of water soluble and water insoluble arabinoxylans from rye grain. 8th International Conference on Polysaccharides-Glycoscience. Prague, 28-30 November 2012. (zamawiany) Jestem autorem lub współautorem 98 komunikatów na konferencje krajowe (24) i międzynarodowe (74) (Załącznik nr 6). Uczestniczyłem w 5 krajowych projektach badawczych (Załącznik 6 I) przyznanych przez MNiSW (później NCN), w dwóch jako kierownik, a w pozostałych jako wykonawca. Jestem też wykonawcą w grancie przyznanym w ramach II Konkursu Programu Badań Stosowanych Narodowego Centrum Badań i Rozwoju (NCBiR). Strona 37 z 38