Materiały szkoleniowe ABC techniki SPE dr inŝ. Agata Kot-Wasik

ABC EKSTRAKCJI Z WYKORZYSTANIEM TECHNIKI SPE 1

Rosnąca ilość zanieczyszczeń środowiska powstających w związku z działalnością człowieka, wywarła konieczność ich kompleksowego oznaczania. Największy napotykany problemem stanowi obecność wielu zanieczyszczeń na poziomie śladowym. Konieczność uzyskiwania rzetelnych wyników, pozwalających określić zawartość mikrozanieczyszczeń stała się siła napędową rozwoju współczesnych technik analitycznych. Po opracowaniu bardzo czułych technik słuŝących do oznaczania i detekcji analitów, uwagę skupiono na sposobie przygotowania próbek. Przygotowanie próbek do analizy jest procesem złoŝonym. Wszelkie błędy pojawiające się na tym etapie rzutują na wynik końcowego oznaczenia. Dodatkowym utrudnieniem jest fakt, Ŝe pobieranie i przygotowanie próbki zajmuje blisko 2/3 czasu trwania całej analizy. 6% 61% Pobieranie próbki 27% Przygotowanie próbki Analiza Obróbka wyników 6% Czasochłonność poszczególnych etapów procedury analitycznej Wiele z tych niedogodności moŝna uniknąć stosując do przygotowywania próbek środowiskowych technikę SPE - Solid Phase Extraction. Jej gwałtowny rozwój nastąpił w latach 90 tych. Stała się coraz częściej wybieraną techniką w zastosowaniach środowiskowych, ulegając coraz większej popularyzacji i standaryzacji. Dzisiaj moŝna juŝ ją zakwalifikować do klasycznych technik przygotowania próbek. 2

Historia SPE Początki ekstrakcji o fazy stałej sięgają ponad 50 lat wstecz. Od tego czasu ukazały się setki artykułów, publikacji dotyczących SPE. Technikę SPE po raz pierwszy zastosowano w 1949r (US Public Health Service, Cincinati, OH, USA). UŜyto Ŝelaznych cylindrów wypełnionych ziarnistym aktywnym węglem (1200-1500g) do oznaczania śladowych ilości zanieczyszczeń organicznych w próbkach wody (nieoczyszczonej i przefiltrowanej). Testowanie węglowych filtrów kontynuowano, badając zawartość zanieczyszczeń z procesów rafinacji ropy w wodach powierzchniowych. Tysiące litrów wody zostały przepuszczone przez węglowe złoŝa, a zaadsorbowane anality ekstrahowano przy pomocy chloroformu. Dowiedziono, Ŝe w wodach powierzchniowych zalegają zanieczyszczenia o stęŝeniu rzędu ppm. Bez zastosowania wzbogacania próbki na złoŝu węglowym, taka analiza byłaby niemoŝliwa. Te pionierskie wysiłki zapoczątkowały gwałtowny wzrost zainteresowania aktywnym węglem w zastosowaniach analitycznych. W toku badań okazało się, Ŝe węgiel aktywny posiada wiele wad, min: adsorbuje w podczerwieni, charakteryzuje się niskim stopniem odzysku niektórych grup związków. Pomimo tych niedogodności, naleŝy pamiętać, Ŝe poprzez uŝycie aktywowanego węgla zainicjowano rozwój ekstrakcji do fazy stałej, jako metody wzbogacania organicznych analitów z próbek wody. Późne lata 60-te do wczesnych 80-tych to czas, w którym poszukiwano sorbentów o jak najbardziej uniwersalnym zastosowaniu. Zdawano sobie sprawę, Ŝe węgiel nie adsorbuje wielu związków organicznych rozpuszczonych w wodzie a desorpcja analitów często przebiega nieefektywnie i niecałkowicie. Rozwiązanie tych problemów pojawiło się wraz z otrzymaniem materiałów polimerowych oraz w późniejszych latach Ŝeli krzemionkowych. W latach 60-tych zaprezentowano wysoce usieciowaną Ŝywicę polistyrenową o nazwie handlowej Amberlite XAD-1. Potwierdzono w licznych badaniach zdolność Ŝywicy do adsorpcji związków organicznych znajdujących się w próbkach wody. Kolejne lata przynosiły nowe odkrycia. W latach 70-tych otrzymano kopolimer styrenu i diwinylobenzenu (Amberlite XAD-2, XAD-4), Ŝywicę z etylenu i dimetyloakrylanu (Amberlite XAD-7, XAD-8). 3

uŝyć Materiały szkoleniowe ABC techniki SPE dr inŝ. Agata Kot-Wasik Po serii kopolimerów Amberlite zaczęto badać przydatność do SPE sorbentów takich jak: Porapaks, Chromosorb a takŝe Tenar. Kolejnym przełomowym krokiem był wzrost zainteresowania fazami wiązanymi chemicznie w HPLC. Postanowiono je równieŝ do SPE. Zostały szeroko spopularyzowane ze względu na swoje specyficzne właściwości oraz wysoką stabilność w wielu środowiskach (z wyjątkiem ph powyŝej 12). Krzemionka związana z grupami oktadecylowymi (C 18 ) jest do dzisiaj najbardziej popularną fazą stacjonarną. Obok faz polimerowych i opartych na krzemionce na przełomie lat 70-80 pojawił się węgiel nowej jakości, wytwarzany w ściśle kontrolowanym procesie technologicznym. Posiadał bardziej homogeniczną strukturę niŝ węgiel aktywny, większe powinowactwo do związków polarnych, wyŝszą selektywność wobec niektórych grup związków i. W ciągu ostatnich 15 lat modyfikowano istniejące sorbenty. Zastosowanie w technice SPE znalazły Ŝywice modyfikowane m.in. takimi grupami chemicznymi jak: acetylowa, hydroksymetylowa, benzoilowa, o-karboksybenzoilowa (pozwalające na analizowanie polarnych związków organicznych zawartych w wodach środowiskowych). Zsyntetyzowano równieŝ zupełnie nowe, wysoko usieciowane polimery tj. Envi-Chrom P, LiChrolut EN, Isolute EN. Nowinką techniczną stały się w latach 90-tych membranowe krąŝki ekstrakcyjne, składające się z matrycy wykonanej z politetrafluoroetylenu (PTFE), w którą uwikłany został sorbent. Kolejną innowacją, która znalazła zastosowanie w SPE, okazało się są wykorzystanie oddziaływań przeciwciało-antygen. Poprzez unieruchomienie na fazie stałej przeciwciał skomponowano immunosorbenty. Analitami w tym przypadku antygeny. Inną moŝliwością zwiększenia selektywności oddziaływań pomiędzy analitem a sorbentem w SPE jest zastosowanie polimerów drukowanych molekularnie. Odpowiednio dopasowany polimer ogranicza znacząco wpływ matrycy jednocześnie pozwalając na osiągniecie wyŝszych współczynników odzysku. Mimo szeroko zakrojonych badań, po latach wysiłków stało się oczywiste, Ŝe nie istnieje sorbent uniwersalny. Fazy zalecane do poszczególnych grup analitów, nie znajdują zastosowania w odniesieniu do innych. Nie naleŝy jednak z tego powodu zaprzestawać badań, a skierować je w stronę poszukiwania nowych, wysoko selektywnych materiałów. 4

Podstawy teoretyczne ekstrakcji do fazy stałej- SPE Ekstrakcja do fazy stałej (SPE ang. Solid Phase Extraction) polega na przeniesieniu analitów znajdujących się w próbce ciekłej do fazy stałej. Rozdzielenie związków zachodzi w oparciu o współczynnik podziału związków organicznych miedzy wodę i stały sorbent. Uwolnienie analitów zachodzi przy pomocy rozpuszczalnika (oznaczenie końcowe HPLC) lub na drodze termicznej (oznaczenie końcowe GC). Pomimo niewątpliwych zalet techniki SPE nie zawsze spełnia ona swoje zadanie. Związane jest to z właściwościami fizykochemicznymi niektórych związków, które bardzo silnie adsorbują się na powierzchni ścianek naczyń, co moŝe powodować duŝe straty analitu. W metodzie ekstrakcji cieczą rozpuszczalnik dodaje się bezpośrednio do naczynia z próbką, co pozwala wypłukać zaadsorbowane na naczyń ściankach anality. Podstawowe zalety i wady techniki SPE przedstawiono w Tabeli. Wady i zalety techniki SPE Zalety metody moŝliwość izolacji i wzbogacania związków lotnych i nielotnych z próbek i ciekłych i gazowych, selektywność wzbogacenia i moŝliwość oczyszczenia substancji, zapobieganie procesom biodegradacji w czasie przechowywania próbek, zwłaszcza próbek wodnych, gdzie substancje często ulegają degradacji (anality wzbogacone na sorbentach moŝna przechowywać przez dłuŝszy czas), znaczne zredukowanie ilości uŝywanych rozpuszczalników w porównaniu z technikami LLE, a tym samym ograniczenie problemu toksycznych odpadów, eliminacja problemów związanych z tworzeniem się emulsji, szeroki wybór stałych sorbentów, łatwość automatyzacji (przy desorpcji termicznej połączenie on-line z GC, przy desorpcji rozpuszczalnikiem połączenie on-line z HPLC ), moŝliwość zastosowania w terenie. Wady metody straty analitu wynikające z niecałkowitej desorpcji, konieczność wzbogacania eluatu po desorpcji rozpuszczalnikiem, czasami niska powtarzalność, czasochłonność. 5

ABC wykonania ekstrakcji za pomocą techniki SPE. Poszczególne etapy SPE moŝna przedstawić w sposób schematyczny następująco: a) Na złoŝu adsorbują się anality. 1.Kondycjonowanie 2. Dozowanie próbki 3. Przemycie złoŝa 4. Elucja b) Na złoŝu adsorbują się zanieczyszczenia. 1.Kondycjonowanie złoŝa 2. Dozowanie próbki (sorpcja) 3. Przemycie złoŝa Anality Zanieczyszczenia Ad1. ZwilŜanie i kondycjonowanie złoŝa. ZwilŜanie i kondycjonowanie złoŝa słuŝy jego aktywowaniu przed zadozowaniem próbki. Polega na przepuszczeniu określonej ilości rozpuszczalnika w zaleŝności od rodzaju złoŝa i jego późniejszego zastosowania. Pod wpływem rozpuszczalnika poskręcane łańcuchy wypełnienia rozprostowują się, zwiększając 6

powierzchnię sorpcyjną. WaŜne jest, aby nie dopuścić do wyschnięcia złoŝa pomiędzy kondycjonowaniem a aplikacją próbki. W tym celu naleŝy pozostawić ok. 1 mm poprzedniego rozpuszczalnika nad warstwą wypełnienia. Jeśli dojdzie do wysuszenia złoŝa przed zadozowaniem próbki proces kondycjonowania naleŝy bezwarunkowo powtórzyć. Ad 2. Dozowanie próbki. Przy pomocy SPE analizuje się próbki o róŝnej objętości, od kilku mikrolitów do kilku litrów. Ze złóŝ o charakterze niepolarnym (układ faz odwróconych), w przypadku kiedy ekstrahujemy anality z duŝych objętości próbek wodnych, zostaje stopniowo wypłukiwana warstwa rozpuszczalnika pochodzącego z etapu kondycjonowania, Wraz z zanikiem rozpuszczalnika spada wydajność ekstrakcji oraz maleje stopień odzysku analitów. Aby doszło do ilościowego przeniesienia analitów na złoŝe, regulujemy ph próbki wodnej, stęŝenie soli i/lub rozpuszczalników organicznych. Próbki moŝna równieŝ przed dozowaniem odfiltrować lub odwirować, unikając tym samym ryzyka zapychania złoŝa. Przygotowaną próbkę dozujemy na kolumnę (krąŝek), zwracając szczególną uwagę, aby przenieść ją w całości bez zanieczyszczania. NatęŜenie przepływu cieczy przez złoŝe zaleŝy od wybranej procedury analitycznej, jednakŝe zazwyczaj nie przekracza ono 5ml/min. Przepływ najczęściej wymuszamy poprzez wytworzenie podciśnienia. Ad 3. Przemycie złoŝa i suszenie. NaleŜy rozpatrzyć dwa przypadki: - PoŜądane substancje ulegają zatrzymaniu na złoŝu. Kolumnę przemywamy roztworem, który nie usunie zaadsorbowanych analitów. Najczęściej stosuje się medium, w którym początkowo znajdowały się anality. JeŜeli zanieczyszczenia zostały słabo związane przez złoŝe, naleŝy je przemyć rozpuszczalnikiem o pośredniej sile elucji. Dobieramy optymalny skład (zawartość soli, rozpuszczalników organicznych), ph, polarność. Przemyte złoŝe suszymy w delikatnym strumieniu gazu obojętnego, najczęściej azotu. 7

- PoŜądane przez nas substancje nie ulegają zatrzymaniu na złoŝu. Przemywamy złoŝe rozpuszczalnikiem, w którym znajdowały się będą anality. W ten sposób wypłukujemy pozostające w złoŝu substancje. W tym przypadku przemycie złoŝa jest ostatnim etapem procedury SPE. Ad 3. Elucja Zaadsorbowane anality wypłukuje się rozpuszczalnikiem, w którym jednocześnie nie się rozpuszczały ewentualne zanieczyszczenia. W zaleŝności od ilości złoŝa stosuje się objętości od 200 l do ~ 4 ml, które dozuje się kilkoma mniejszymi porcjami. Uzyskuje się w ten sposób wyŝszy stopień odzysku analitów. Eluat zbiera się i poddaje dalszej obróbce, o ile zachodzi taka potrzeba ii. Metoda SPE znalazła zastosowanie do: Usuwania z próbki substancji przeszkadzających Izolacji i wzbogacania analitów śladowych, Frakcjonowania składników próbki, Przechowywania analitów lotnych lub nietrwałych w ciekłym roztworze, Derywatyzacji analitów poprzez oddziaływanie z reaktywnymi grupami sorbentu. 8

Stałe sorbenty stosowane w ekstrakcji SPE. Sorbenty stosowane w SPE występują w róŝnych formach. MoŜna dokonać generalnego podziału na sorbenty umieszczone: W kolumnach KrąŜkach ekstrakcyjnych. Zasada funkcjonowania powyŝszych urządzeń jest analogiczna. Anality obecne w roztworze ulegają zaadsorbowaniu na ziarnach wypełnienia, po czym następuje ich uwolnienie. RóŜnice wynikają z odmiennego upakowania złoŝa oraz struktury jego ziaren, bowiem w matrycę są dysków uwikłane ziarna o znacznie mniejszej średnicy. Najbardziej klasyczną wersję ekstrakcji typu SPE realizuje się przy zastoasowaniu kolumienki, której budowę przedstawiono na rysunku obok. polipropylenowa strzykawka polietylenowe fryty (20 µm) RóŜnice w wielkości ziaren: a) dysk do SPE, b) kolumienki do SPE. wypełnienie na bazie Ŝelu krzemionkowego (ziarno 40 µm, pory 60A) końcówka typu Luer 9

Ŝ Ŝą ŜąŜ ą Ŝą śŝ Ŝą ś ę ą Ŝ ęŝ ś Ŝę ę Ŝ śŝ ą Ŝ Materiały szkoleniowe ABC techniki SPE dr in. Agata Kot-Wasik Opis Do małych obj to ci Kolumienki Do rednich obj to ci Do du ych obj to ci Warstwa zło a sorpcyjnego mi dzy filtrami umieszczona w strzykawce z polipropylenu lub szkła Wolne kr ki Włókno teflonowe lub szklane wypełnione zło em sorpcyjnym Kolumienki z kr kami Kr Cienka warstwa zło a sorpcyjnego pomi dzy dwoma filtrami z włókna szklanego chronionymi dodatkowymi filtrami ki do ekstrakcji Kr ki w palecie Płytki składaj ce si z kolumienek o pojemno ci 1-2 ml wypełnione materiałem stałym Kr ki do przyspieszonej ekstrakcji Cienka warstwa zło a sorpcyjnego pomi dzy dwoma filtrami z włókna szklanego Masa sorbentu [mg] 10-100 100-500 500-10000 4-15 20-200 5-100 10-200 Wymiary [mm] Zale ne od rednicy polipropylenowej lub szklanej Ø 25, 47, 90 Ø=4, 7, 10 Ø=50 strzykawki Przepływ [ml/min] 2-5 20-25 1-10 200 Kr ki w pipecie Czas ekstrakcji 1 litra wody [min] 200 40 100 5 Wygl d Porównanie ró nych form sorbentów stosowanych w technice SPE. 10

Mniejsza średnica ziaren eliminuje niedogodności wynikające ze stosowania kolumienek. Oto niektóre z zalet dysków: Krótszy czas analizy ze względu na większe pole przekroju poprzecznego Mniejsze: spadki ciśnienia, objętość martwa Większa: powierzchnia kontaktu, jednorodność i gęstość upakowania, stabilność chemiczna MoŜliwość przepuszczania większych objętości próbki bez ryzyka przebicia złoŝa Mniejsza masa złoŝa powoduje, Ŝe oddziaływanie sorbentu z matrycą jest znacznie ograniczone. Ograniczenie kanalikowania łatwość suszenia krąŝka przed etapem elucji. Największą niedogodnością pojawiającą się są są podczas stosowania krąŝków ekstrakcyjnych niskie wartości odzysków dla niektórych związków spowodowane krótkim czasem kontaktu analitów z sorbentem. Pomimo wielu zalet krąŝków, fakt, Ŝe nie moŝna ich wykonać samodzielnie w laboratorium oraz wysoka cena (w porównaniu z kolumienkami) powoduje, Ŝe kolumienki nadal najczęściej uŝywaną formą upakowania materiału sorpcyjnego 11

Dobór fazy stałej i warunków wzbogacania. W czasie optymalizacji warunków izolacji i wzbogacania związków organicznych z wody pod uwagę są brane przede wszystkim następujące czynniki: polarność rozpuszczalnika i typ wypełnienia kolumienki ekstrakcyjnej. W kolejnej Tabeli przedstawiono typy wypełnień stosowanych w technice SPE. Typy sorbentów wykorzystywanych do ekstrakcji z uŝyciem techniki SPE. TYP SORBENTU SYMBOL FAZA STAŁA POLARNOŚĆ/ KLASYFIKACJA ZWIĄZKU C-2 śel krzemionkowy modyfikowany grupami etylowymi C-8 śel krzemionkowy modyfikowany grupami octylowymi Nie-polarny C-18 śel krzemionkowy modyfikowany grupami oktadecylowymi Związki niepolarne i średnio polarne Ph śel krzemionkowy modyfikowany grupami fenylowymi CN śel krzemionkowy modyfikowany grupami cyjanopropylowymi CN śel krzemionkowy modyfikowany grupami cyjanopropylowymi Si śel krzemionkowy Polarny Diol Diol Związki polarne Florisil Dwutlenek magnezu NH 2 śel krzemionkowy modyfikowany grupami cyjanopropylowymi aminopropylowymi CN Cyanopropylosilika Ŝel Kationy Wymieniacz jonowy NH 2 śel krzemionkowy modyfikowany grupami cyjanopropylowymi aminopropylowymi Słabe aniony, kwasy organiczne SCX Kwas sulfonowy Mocne kationy, zasady organiczne SAX Czwartorzędowa amina Mocne aniony, kwasy organiczne WCX Słaby wymieniacz kationowy Słabe kationy 12

Obecnie rynku istnieje szeroki asortyment artykułów do SPE, w tym wiele rodzajów wypełnień. Znalezienie najbardziej optymalnego sorbentu do konkretnej analizy moŝe nastręczać będą kłopotu. Dobór sorbentu i charakterystyki jego uziarnienia zaleŝy od: Charakteru analizowanej próbki. Właściwości tj. polarność analitów względem matrycy, rodzaj matrycy, obecność grup posiadających ładunek, rozpuszczalność, masa cząsteczkowa, stęŝenie analitu(ów) i współobecnych substancji przeszkadzających decydują, jak silne zachodzić oddziaływania pomiędzy analitami a złoŝem. Sposobu uwalniania analitów, stosowanej metody analizy końcowej, oraz sposobu jej łączenia z metodą SPE (off-line, on-line). Przy wyborze optymalnego materiału sorpcyjnego moŝna kierować się schematem przedstawionym na Rysunku poniŝej. Po dokonaniu wyboru optymalnego materiału sorpcyjnego naleŝy rozwaŝyć jego ilość, która zapewni jak najbardziej ilościowy odzysk analitów. Zbyt duŝa ilość złoŝa prowadzi do problemów z wyeluowaniem wszystkich zaadsorbowanych związków, z kolei zbyt mała ilość materiału nie jest w stanie związać wszystkich analitów. Kolejnym kluczowym aspektem jest dobór odpowiedniego medium, które posłuŝy kolejno do kondycjonowania, przemywania złoŝa oraz elucji. NaleŜy wziąć pod uwagę, Ŝe ostatni z rozpuszczalników uŝywanych do kondycjonowania powinien być najsłabszym. Rozpuszczalniki stosowane do przemywania złoŝa, naleŝy dobrać tak, aby wypłukiwały słabo zaadsorbowane zanieczyszczenia. Rozpuszczalnik stosowany do elucji analitów powinien być na tyle silny, aby jego niewielka objętość ilościowo usunęła ze złoŝa interesujące nas substancje. 13

Ŝ Ś ść Ś ś ś Materiały szkoleniowe ABC techniki SPE dr in. Agata Kot-Wasik Anality Rozpuszczalne w wodzie Rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych Niejonowe Jonowe Rozpuszczalnik Wodny Wodny Wodny Organiczny Organiczny Polarno analitów Niepolarne Polarne redniopolarne Kationowe Anionowe Niepolarne Polarne redniopolarne Zalecany rodzaj fazy stałej Oktadecylowa Oktylowa C4 C2 Cyjanopropylowa Fenyloetylowa el krzemionkowy Aminopropylowa Cyjanopropylowa Diolowa Aminopropylowa PA DMA PCA SA PS-A PS-H SB NH2 DMA PS-OH- Oktadecylowa Oktylowa C4, C2 Cykloheksylowa Fenyloetylowa Cyjanopropylowa el krzemionkowy Aminopropylowa Cyjanopropylowa Diolowa Aminopropylowa PA DMA Zalecany rozpuszczalnik do selektywnej elucji Heksan Dichlorometan Acetonitryl Alkohole Chloroform Dichlorometan Octan etylu Alkohole Woda Chloroform Dichlorometan Octan etylu Alkohole Woda Kwasy Sole Bufory Kwasy Sole Bufory Heksan Dichlorometan Acetonitryl Alkohole Chloroform Dichlorometan Octan etylu Alkohole Chloroform Dichlorometan Octan etylu Alkohole 15

Ŝ ę Materiały szkoleniowe ABC techniki SPE dr in. Agata Kot-Wasik Schemat post powania: wybór rozpuszczalnika oraz fazy stałej wykorzystywanych w SPE 16

Problemy towarzyszące technice SPE, ich przyczyny oraz sposoby rozwiązywania. Podstawowe problemy, jakie spotyka się zwłaszcza w przypadku klasycznych kolumienek stosowanych do SPE to: opory przepływu, kanalikowanie, objętość martwa (ta wpływa na czas poświecony kondycjonowaniu, myciu i suszeniu). W tabeli poniŝej przedstawiono najczęściej spotykane w SPE problemy, ich przyczyny i sposoby rozwiązywania. soli nieorganicznych Obecność surfaktantów Zwiększenie ciśnienia (a tym samym zmniejszenie prędkości przepływu próbki przez sorbent) olejów węglowodanów Obecność białek Próbka o wysokiej lepkości Podwójna ekstrakcja Podwójna ekstrakcja, ekstrakcja ciecz ciecz Podwójna ekstrakcja, Ekstrakcja ciecz -ciecz Rozpuszczenie próbki Zmiana ph, Strącenie białka, Degradacja białka Rozpuszczenie próbki Problemy towarzyszące technice SPE, ich przyczyny oraz sposoby rozwiązywania. Problem Prawdopodobna przyczyna Działania korygujące Zanieczyszczenia w matrycy Podwójna ekstrakcja, dializa Niskie współczynniki odzysku analitów Niewłaściwe kondycjonowanie Nie mieszające się reagenty Niewłaściwe kondycjonowanie Słabe związanie analitów z wypełnieniem Niewłaściwe mycie NaleŜy dopilnować, aby sorbent podczas kondycjonowania nie wysechł NaleŜy wysuszyć złoŝe pomiędzy dozowaniem kolejnych rozpuszczalników NaleŜy dopilnować, aby sorbent podczas kondycjonowania nie wysechł Zastosować wypełnienie o większej selektywności w stosunku do analitów Zmienić rozpuszczalnik uŝyty do mycia złoŝa 17

Zanieczyszczenia Materiały szkoleniowe ABC techniki SPE dr inŝ. Agata Kot-Wasik Słaba elucja Niewystarczające mycie Czasochłonne operacje Mała wydajność Zbędne etapy Niewłaściwie dobrana metodyka Granica oznaczalności nie została osiągnięta Za bardzo rozcieńczony rozpuszczalnik Niewłaściwie kondycjonowanie Niecałkowite dozowanie próbki na Słaba odtwarzalność sorbent Niewystarczające mieszanie -NaleŜy wypróbować róŝne sorbenty, -NaleŜy obniŝyć siłę elucyjną rozpuszczalnika, - Zwiększenie ilości rozpuszczalnika - Zoptymalizowanie przenoszenia masy - Zwiększenie ilości rozpuszczalnika - Zoptymalizowanie przenoszenia masy - Dobór optymalnego rozpuszczalnika do przemywania, Optymalizacja procedury Optymalizacja procedury Eliminacja etapu odparowania -Zminimalizować odparowanie -Odparować -Wzbogacić -UŜyć próbkę kolumienki z krąŝkami. Zwrócić uwagę na zalecenia producenta Zmniejszyć prędkość przepływu próbki -Wymieszać -Rozcieńczyć próbkę przed zadozowaniem 18

są Materiały szkoleniowe ABC techniki SPE dr inŝ. Agata Kot-Wasik (automatyzacja) Technika SPE zarówno w układzie off-line jak i on-line charakteryzuje się zadowalającymi odzyskami analitόw, jednak w tej drugiej nieco wyŝsze, co moŝe być bardzo istotne przy oznaczaniu śladowych i ultraśladowych ilości związków. zaletą są Dodatkową techniki zautomatyzowanej wartości granic wykrywalności analitów w próbkach wodnych, co z pewnością liczy się najbardziej dla analityka. Szczególnie, jeśli musi stwierdzić ich obecność na bardzo niskim poziomie stęŝeń. Korzystniejsze wyniki wzbogacania pozostałości analiztów z wykorzystaniem techniki on-line, związane mogą być z ilością czynności wykonywanych podczas przygotowywania próbki. Oczywiście im mniejsza liczba etapów, tym mniejsze prawdopodobieństwo popełnienia błędu i utraty analitów. WaŜnym czynnikiem, który naleŝy uwzględnić podczas planowania procesu oznaczania substancji, jest czas analizy. Jest on nieporównywalnie krótszy dla techniki online. Związane jest to między innymi z tym, Ŝe wykonuje się tylko kondycjonowanie złoŝa, przepuszczanie strumienia próbki oraz bezpośrednio po tym oznaczanie końcowe. Natomiast w układzie off-line po wzbogaceniu analitów z próbki wodnej złoŝe trzeba wysuszyć, zdesorbować anality, odparować rozpuszczalnik i rozpuścić anality w fazie ruchomej. Wymaga to przenoszenia próbki do dwóch róŝnych stanowisk i montaŝu jej, by proces mógł przebiegać prawidłowo. Praktyka laboratoryjna wykazała, Ŝe proces ekstrakcji w układzie on-line moŝliwy jest do wykonania w czasie do 1.5 godziny, natomiast off-line od kilku do kilkunastu godzin. Istotne znaczenie ma równieŝ objętość przepuszczanej próbki przez złoŝe sorbentu, co dodatkowo ma wpływ na czas analizy i jest istotnym parametrem na etapie pobierania i transportu (500-1000 ml dla off-line i 10-100 ml dla on-line). Pomimo niewątpliwie wielu zalet zautomatyzowana technika ekstrakcji posiada równieŝ Technika SPE realizowana w trybie off-line i on-line wady. OtóŜ w przypadku zastosowania ekstrakcji w układzie on-line nie ma moŝliwości powtórzenia analizy (w przypadku off-line moŝliwa jest kilkukrotna analiza tego samego ekstraktu). Ponadto podczas jednego procesu analitycznego moŝna przeprowadzać izolację i wzbogacanie analitów tylko jednej próbki. W układzie off-line moŝliwa jest jednoczesna ekstrakcja analitów z kilku-kilkunastu próbek. Istnieją równieŝ statywy do ekstrakcji SPE off- 19

line, w których moŝna umieścić nawet 96 próbek. Dlatego biorąc pod uwagę liczbę przygotowanych próbek przed analizą końcową w obu przypadkach, parametr czasowy przybiera innego znaczenia. Kolejną niekorzystną cechą techniki on-line jest efekt pamięci ścianki i złoŝa. Przedkolumna ekstrakcyjna nie jest wymieniana kaŝdorazowo po jej uŝyciu, po przemyciu za pomocą rozpuszczalnika słuŝy do analizy następnych próbek. W związku z tym anality, które nie całkowicie zdesorbowały w pierwszej analizie oraz podczas mycia prekolumny, mogą uwalniać się w następnej analizie powodując zafałszowanie wyników. Technika ekstrakcji w układzie off-line wykorzystuje natomiast jednorazowe kolumienki ekstrakcyjne. Świadomość analityka dotycząca wad i zalet danej techniki, pozwoli wybrać najbardziej korzystną dla jego potrzeb oraz moŝliwości ekonomicznych danego laboratorium. W tabeli zestawiono wady i zalety prowadzenia ekstrakcji do fazy stałej zarówno w układzie off-line jak i on-line. Zalety i wady prowadzenia ekstrakcji do fazy stałej w układzie off-line i on-line Sposób realizacji procesu ekstrakcji Zalety Wady MoŜliwość przygotowania kilku próbek jednocześnie Trudności z automatyzacją operacji Układ off-line MoŜliwość optymalizacji poszczególnych etapów Elastyczność etapów metody Proste wyposaŝenie Czasochłonność i pracochłonność Konieczność pracy z duŝą objętością próbek Ryzyko zanieczyszczenia próbek i ekstraktów oraz strat analitów MoŜliwość automatyzacji procesu Analiza całej próbki Skomplikowane wyposaŝenie Układ on-line MoŜliwość pracy z mniejszą objętością próbek Skrócenie czasu analizy Mała elastyczność procedury Zmniejszenie ryzyka strat analitów i zanieczyszczenia próbki Poprawa precyzji analizy Utrudniona lub niemoŝliwa optymalizacja poszczególnych etapów 20

Odmiany techniki ekstrakcji do fazy stałej Ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika z próbki zmieszanej z wypełniaczem (ang. Matrix solid-phase dispersion - MSPD) Ekstrakcja analitów z próbek moździerz próbka (0.5 g) stałych i półpłynnych moŝe być krok 1 wykonana z zastosowaniem techniki sorbent MSPD opatentowanej w 1989 roku. (np. C18, 2g) Próbkę badaną umieszcza się w naczyniu szklanym do którego wprowadzany jest sorbent (materiał stały przemyty rozpuszczalnikiem i kondycjonowany wcześniej na wzór kolumienek do SPE). Próbkę wraz ze sorbentem miesza się dokładnie (homogenizacja) i przenosi do pustej kolumienki (strzykawka z polipropylenu lub szkła) zabezpieczonej jedynie filtrem papierowym. Całość się ściska tłoczkiem od strzykawki i przez tak przygotowaną kolumienkę przepuszcza się kilka porcji rozpuszczalnika. Eluat zbierany do naczynia poddaje się są dalej albo oczyszczaniu (np. SPE) albo redukcji objętości końcowej rozpuszczalnika albo teŝ analizie końcowej (ilościowej i/lub jakościowej technikami chromatograficznymi). Wszystkie te kroki w sposób graficzny przedstawione na Rysunku. krok 4 krok 5 ściśnij krok 9 - usuń nadmiar rozpuszczalnika - przefiltruj - ANALIZA spatula krok 3 przenieś tłuczek korpus strzykawki filtr papierowy rozpuszczalnik tłoczek 2 strzykawki filtr papierowy krok 6 odbieralnik ekstrakt krok 2 wymieszaj krok 7 eluuj anality krok 8 Schemat postępowania z próbką w przypadku zastosowania techniki MSPD. 21

Technikę MSPD stosowano do izolacji analitów z grupy PCBs z ryb, pozostałości leków z tkanki tłuszczowej i wątroby, witamin z poŝywienia (warzywa i owoce), pestycydów z warzyw, owoców, ryb i krwi. Ekstrakcja z wykorzystaniem ruchomego elementu sorpcyjnego typu Twister TM (Stir Bar Sorptive Extraction-SBSE) W erze zielonej chemii trudno jest uzasadnić stosowanie technik ekstrakcyjnych z uŝyciem duŝych ilości toksycznych rozpuszczalników organicznych na etapie przygotowanie próbki, dlatego powinno się preferować techniki bezrozpuszczalnikowe, a do takich naleŝy między innymi próbnik z ruchomym elementem sorpcyjnym TM typu Twister (sprzedawany przez firmę Gerstel, Muhlheim, Niemcy). Element sorpcyjny jest szklanym mieszadełkiem magnetycznym o długości 1.5 cm pokrytym grubym filmem polidimetylosiloksanu. Jego pojemność sorpcyjna jest stukrotnie większa od tej, którą są zapewnia włókno ekstrakcyjne SPME. Czas ekstrakcji jest krótki (rzędu kilku minut do maksimum 1 godziny), a element sorpcyjny po ekstrakcji polegającej na umieszczeniu elementu Twister TM w ciekłej próbce i mieszaniu (Rysunek) jest wyciągany i poddawany desorpcji najczęściej termicznej i analizie chromatograficznej. Próbniki z ruchomym elementem sorpcyjnym typu Twister TM wykorzystywane do ekstrakcji organicznych zanieczyszczeń (pestycydy, WWA) z takich matryc, jak woda, ścieki, soki, herbata, kawa, wino, mleko, keczup. Element sorpcyjny typu Twister TM do ekstrakcji typu SBSE 22

Mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej (SPME) Mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej jest szybką, uniwersalną, czułą, bezrozpuszczalnikową i ekonomiczną metodą przygotowania próbek do analizy z wykorzystaniem chromatografii gazowej (GC) lub wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Jest rodzajem ekstrakcji do fazy stałej (SPE), zachowującym wszystkie jej zalety prostota, niski koszt, łatwość automatyzacji i moŝliwość zastosowania w terenie, nie posiadającym jednocześnie jej wad czasochłonności i uŝycia rozpuszczalników. Sorbent naniesiony jest w tym przypadku na cienkie włókno szklane lub kwarcowe. Taka zmiana geometrii sorbentu ułatwia wymianę masy podczas wzbogacania i uwalniania zatrzymanych związków. Na Rysunku przedstawiono schemat urządzenia do SPME, produkowanego przez firmę Supelco. Jego integralną częścią jest stalowa igła z zamocowanym w niej włóknem, pokrytym fazą stacjonarną. Schemat budowy urządzenia do mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej. 1-tłok, 2-obudowa, 3-śruba prowadząca, 4-wycięcie w obudowie, 5-otwór w obudowie,6-prowadnica igły, 7- spręŝyna, 8-uszczelka, 9-igła, 10-rurka stalowa, 11- włókno pokryte fazą stacjonarną Na kolejnym Rysunku pokazano zaś wygląd zestawu do mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej. Technika SPME umoŝliwia izolację i wzbogacanie związków lotnych i średniolotnych z matryc gazowych, ciekłych lub stałych. Czułość tej techniki zaleŝy przede wszystkim od wartości współczynnika podziału między próbką a fazą stacjonarną włókna. W związku z tym na efektywność wzbogacania wpływa rodzaj zastosowanej fazy stacjonarnej oraz jej grubość. Istotny wpływ mają teŝ inne parametry procesu takie jak: objętość próbki, jej temperatura, czas ekspozycji włókna, pojemność fiolki ekstrakcyjnej oraz mieszanie próbki. 23

tą Zestaw do mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej. Optymalizacja warunków pracy urządzenia do SPME umoŝliwia osiągnięcie granicy wykrywalności 5-50 ppt zarówno dla związków lotnych, jak i nielotnych, przy czym czas przygotowania próbki techniką wynosi zwykle 2-15 minut. Liczne zalety techniki SPME, sprawiają, Ŝe jest ona prawie uniwersalna, pozwala bowiem, na analizę wielu rodzajów próbek ciekłych, gazowych i stałych, często o bardzo skomplikowanym składzie, zawierających anality w śladowych ilościach. Czynniki wpływające na efektywność wzbogacenia analitów z wykorzystaniem techniki SPME. Na efektywność wzbogacania analitów techniką są SPME wpływa wiele czynników, m.in. rodzaje włókien. Przy wyborze włókna obowiązuje zasada podobne rozpuszcza się w podobnym, tzn. polarne anality sorbowane na polarnym włóknie, niepolarne na niepolarnym. W sprzedaŝy znajduje się cała gama standardowych włókien, których przykłady zostały przedstawione w Tabeli. 24

Charakterystyka włókien uŝywanych w technice SPME. Rodzaj fazy stacjonarnej Polidimetylosiloksan(PD MS) Polarność Niepolarna Grubość filmu fazy stacjonarnej [µm] Handlowe oznaczenie włókna 100 Czerwone 280 30 śółte 280 Maksymalna temperatura pracy włókna [ 0 C] 7 Zielone 340 65 Niebieskie 270 60 Brązowe 270 Polidiwinylosiloksan/diw Umiarkowanie inylobenzen polarna (PDMS/DVB) Przy wyborze włókna waŝna jest grubość umieszczonej na nim fazy stacjonarnej. większych ilości analitów niŝ są cienkie, bardziej efektywne w przypadku związków lotnych i umoŝliwiają ich transport do dozownika chromatografu praktycznie bez strat. Natomiast włókna ekstrakcyjne pokryte cienkim filmem fazy stacjonarnej zaleca się stosować w przypadku izolacji i wzbogacania związków wysokowrzących, poniewaŝ umoŝliwiają one przeprowadzenie zarówno ekstrakcji jak i desorpcji w stosunkowo krótkim czasie. Na efektywność ekstrakcji techniką SPME oprócz rodzaju włókna wpływ mają równieŝ: Objętość próbki Dla podwyŝszenia efektywności ekstrakcji, objętość fazy gazowej w fiolce powinna być zminimalizowana. Najczęściej fiolkę wypełnia się cieczą do połowy jej objętości. Istotny wpływ ma tu równieŝ pojemność samej fiolki. Stwierdzono, Ŝe jeŝeli w fiolce o poj. 5 cm 3 umieści się 1 cm 3 cieczy to równowaga zostanie osiągnięta 3 razy szybciej niŝ gdy w naczyniu o pojemności 50 cm 3 znajdzie się 10 cm 3. Temperatura i czas ekstrakcji Wzrost temperatury ułatwia transport analitów z matrycy do fazy nadpowierzchniowej (zwiększa się K hs ), co przyspiesza sorpcję analitów na włóknie. Jednak nadmierny wzrost temperatury moŝe przedwczesną desorpcję powodować analitów. Wartość optymalnej temperatury zaleŝy od składu 65 (włókno elastyczne) RóŜowe 270 Poliakrylan (PA) Polarna 85 Białe 320 75 Czarne 320 Carboxen/polidimetylosi Umiarkowanie loksan (Car/PDMS) polarna 85 (włókno elastyczne) Błękitne 320 65 Pomarańczowe 265 Carbowax/diwinylobenz Polarna en (CW/DVB) 70 (włókno elastyczne) śółtozielone 265 Włókna ekstrakcyjne z grubym filmem fazy stacjonarnej lub sorbentu umoŝliwiają ekstrakcję matrycy, analitów w niej zawartych oraz zastosowanej fazy stacjonarnej. 25

Poza tym im dłuŝszy czas ekspozycji tym więcej miejsc aktywnych na włóknie moŝe być są zajętych przez cząsteczki analitu; jednak przedłuŝanie czasu, gdy wszystkie miejsca aktywne juŝ są zajęte, nie ma juŝ wpływu na efektywność wzbogacania. Czas i temperatura parametrami ściśle związanymi ze sobą, np. podniesienie temperatury umoŝliwia skrócenie czasu ekspozycji włókna, co znacznie przyspiesza wykonanie analizy. Wysalanie Dodatek soli do próbki powoduje obniŝenie rozpuszczalności analitów w matrycy, w związku z czym większa ilość analitów jest sorbowana na włóknie, co zwiększa efektywność ekstrakcji. Zabieg ten często stosuje się w analizie pestycydów oraz związków zapachowych. Efekt jest jednak zaleŝny od rodzaju analitów i stęŝenia NaCl w próbce. Desorpcja analitów z włókna ekstrakcyjnego Zwykle stosuje się desorpcję termiczną, prowadzoną w dozowniku chromatografu gazowego i do tego celu nie jest konieczna Ŝadna modyfikacja jego budowy. Desorpcja powinna przebiegać w jak najkrótszym czasie, dlatego temperatura dozownika powinna być nieco wyŝsza od temperatury wrzenia najwyŝej wrzącego analitu. Limitowana jest ona jednak odpornością termiczną są zastosowanego włókna. W przypadku analizy związków mniej lotnych lub termicznie nietrwałych technikę SPME łączy się z techniką HPLC. Derywatyzacja analitów Anality często występują w próbkach na poziomie śladowym a matryce próbek bardzo złoŝone. Wówczas zdarza się, Ŝe składniki matrycy, których poziom jest porównywalny lub wyŝszy od poziomu analitów, przeszkadzać mogą a nawet uniemoŝliwić przeprowadzenie oznaczenia. Rozwiązaniem moŝe okazać się, przekształcenie analitu w pochodną, o strukturze chemicznej odróŝniającej go od związków zawartych w matrycy. Proces ten określa się terminem upochadnianie (derywatyzacja). W procesie derywatyzacji (konwersji chemicznej) nadaje się analitowi nowe cechy chemiczne i fizyczne (np. obniŝenie temperatury wrzenia), co umoŝliwia zwiększenie czułości oznaczeń. Szczególną, choć wyjątkowo uŝyteczną wersją przekształcania w pochodne jest derywatyzacja na włóknie urządzenia do SPME. W tym celu włókno mikroekstrakcyjne nasyca się odczynnikiem derywatyzującym, a następnie tak przygotowane umieszcza się w roztworze lub w fazie nadpowierzchniowej analizowanej próbki. Przekształcenie w pochodne następuje na włóknie, co pozwala istotnie skrócić czas analizy. 26

Technika SPME coraz częściej jest wybierana przez wielu analityków jako efektywna metoda przygotowania próbki do analizy jakościowej i ilościowej. Główne jej zalety to: Szybkość wyeliminowanie praco- i czasochłonnego etapu obróbki próbki Eliminacja drogich i toksycznych rozpuszczalników organicznych przeprowadzania analizy próbek w stanie stałym, ciekłym i gazowym Wysoka czułość Mała objętość próbki MoŜliwość duŝą automatyzacji Niski koszt analizy Prosta aparatura umoŝliwiająca pobieranie prób w terenie. Technika SPME moŝe być stosowana do analiz związków polarnych i niepolarnych, w gazach, cieczach i próbkach stałych. Łatwo łączona jest z takimi technikami instrumentalnymi jak: GC, GC-MS, HPLC i LC-MS. Do nielicznych mankamentów techniki SPME zalicza się niezbyt duŝe odzyski analitów oraz niezbyt precyzję są oznaczeń, co moŝe ograniczać moŝliwość zastosowania do analizy jakościowej. Dalsze losy techniki SPME związane z opracowaniem nowych pokryć włókien, np. związków chiralnych do analiz analitów aktywnych optycznie, jak równieŝ połączeniem techniki SPME z innymi technikami instrumentalnymi np. elektroforezą kapilarną oraz automatyzacją urządzeń do SPME. W przyszłości spodziewany jest dalszy znaczny wzrost znaczenia techniki SPME w badaniach analitycznych. 27

Wykorzystanie SPE do oczyszczania ekstraktów. W celu oczyszczenia uzyskanych ekstraktów stosuje się głównie takie techniki, jak: ekstrakcję ciecz-ciecz, ekstrakcję do fazy stałej (SPE), kolumnową chromatografię cieczową oraz chromatografię będą iŝ wykluczania. W przypadku ekstrakcji z wykorzystaniem techniki SPE, ze względu na fakt, etap oczyszczania ekstraktów ma celu selektywne zatrzymanie na złoŝu lub elucję ze złoŝa izolowanych analitów z jak najmniejszą ilością interferentów, najwaŝniejszymi aspektami oczyszczania więc: dobór złoŝa (sorbentu) dobór rozpuszczalnika eluującego, właściwe przygotowanie odpowiedniego złoŝa aktywacja poprzez wygrzewanie i określony sposób deaktywacji złoŝa. W Tabeli przedstawiono charakterystykę sorbentów stosowanych do oczyszczania ekstraktów. Charakterystyka sorbentów stosowanych do oczyszczania próbek ekstraktów. F l o r i s i l Charakterystyka Zastosowanie Postępowanie krzemian magnezu SiO 2 +MgO, polarny, zaliczany do amfoterycznych, bardziej kwaśny charakter od aluminy i Ŝelu krzemionkowego. izolacja hydrofilnych, polarnych substancji z niewodnych, niepolarnych mieszanin, analiza próbek zawierających duŝo lipidów, wosków lub olejów, adsorpcja pestycydów z próbek środowiskowych, głównie chlorowanych, oznaczanie herbicydów w Ŝywności i paszach, oznaczanie PCB w oleju transformatorowym, rozdzielanie związków azotowych od węglowodorowych, separacja związków aromatycznych od mieszanin alifatyczno-aromatycznych, szeroko wykorzystywany w metodach zalecanych przez AOAC i EPA. 1. aktywacja poprzez wygrzewanie w temperaturze 130ºC przez noc w naczyniu szklanym przykrytym folią aluminiową, 2. ostudzenie w eksykatorze, 3. dezaktywacja 2% wody 4. wypełnienie kolumienki wata szklana, Florisil, bezwodny Na 2 SO 4, 5. kondycjonowanie kolumienki odpowiednim rozpuszczalnikiem, 6. suszenie kolumienki, 7. naniesienie próbki (anality w odpowiednim rozpuszczalniku) wzbogaconej do określonej objętości, 8. gradientowa elucja za pomocą odpowiednich rozpuszczalników. 28

Charakterystyka Zastosowanie Postępowanie A l u m i n a tlenek glinu Al 2 O 3, przygotowywana z Al(OH) 3 poprzez wygrzewanie w temp. 900ºC w atmosferze CO 2, mechanizm retencji związany jest z oddziaływaniami kwas-zasada (Al 2 O 3 jest kwasem Lewisa), polarnością i wymianą jonową, polarna wyróŝnia się trzy rodzaje: kwaśna Al-A, ph 4,5, słaby kationit, zasadowa Al-B, ph 10, neutralna Al-N, ph 7,5, neutralna elektrycznie powierzchnia, mała pojemność sorpcyjna. WWA, nitrozoaminy, alkaloidy, steroidy, terpeny, związki alifatyczne i aromatyczne, analiza odpadów rafineryjnych, izolacja hydrofilnych substancji z niewodnych mieszanin, Al-A zatrzymywanie neutralnych i anionowych związków; witamin w analizie Ŝywności i pasz, antybiotyków i dodatków do pasz, Al-B zatrzymywanie kationowych i tworzących wiązanie wodorowe związków, pestycydów, herbicydów, cukrów, kofeiny z napojów, steroidów, Al-N zatrzymywanie bogatych w elektrony związków (aromatyczne, alifatyczne aminy, z grupami z O, P, S), izolacja herbicydów, dodatków do Ŝywności, analiza benzyny. 1. aktywacja poprzez wygrzewanie w temperaturze 130ºC przez noc w naczyniu szklanym przykrytym folią aluminiową ostudzenie w eksykatorze, 2.deaktywacja wodą w zaleŝności od wymaganego stopnia: 0-0% I 2,6% II 5% III 8,4% IV 15%, 3. wypełnienie kolumienki - dolną warstwę stanowi Ŝel krzemionkowy lub wata szklana, później umieszcza się aluminę i górną warstwę tworzy bezwodny Na 2 SO 4, 4. kondycjonowanie kolumienki za pomocą odpowiedniego rozpuszczalnika, 5. naniesienie próbki (anality w odpowiednim rozpuszczalniku) wzbogaconej do określonej objętości, 6. gradientowa elucja za pomocą odpowiednich rozpuszczalników. jako grupa funkcyjna jest OH: OH Si matryce - polarne organiczne rozpuszczalniki, oleje i lipidy, izolacja WWA, PCB, zderywatyzowanych fenoli, chloroorganicznych pestycydów, aktywacja poprzez wygrzewanie w temperaturze 130ºC przez noc w naczyniu szklanym przykrytym folią aluminiową, ostudzenie w eksykatorze, śel krzemionkowy najbardziej polarny sorbent zaktywowany jest lekko kwaśny mechanizm retencji związany z tworzeniem się wiązań wodorowych lub oddziaływań dipol dipol poprzez zamianę grupy funkcyjnej otrzymano szeroką gamę sorbentów o róŝnorodnych właściwościach zatrzymywanie polarnych związków, elucja przeprowadzana jest poprzez zmianę siły elucyjnej rozpuszczalnika wypełnienie kolumienki, dolną warstwę stanowi wata szklana, później umieszcza się Ŝel krzemionkowy i górną warstwę tworzy bezwodny Na 2 SO 4, kondycjonowanie kolumienki za pomocą odpowiedniego rozpuszczalnika, naniesienie próbki (anality w odpowiednim rozpuszczalniku) wzbogaconej do określonej objętości, gradientowa elucja za pomocą odpowiednich rozpuszczalników. W przypadku techniki SPE optymalizacja warunków oczyszczania ekstraktów obejmuje zarówno optymalizację uŝywanego sorbentu, jak i mocy rozpuszczalnika uŝytego do desorpcji analitów ze złoŝa. 29

MOC ROZPUSZCZALNIKÓW POLARNOŚĆ SORBENTÓW { Oktadecyl (C Częstokroć są 18 ) Oktyl (C 8 ) R NIEPOLARNY Butyl (C 4 ) HEKSAN O Cykloheksyl IZOOKTAN S Fenyl (Ph) TETRACHLOROMETAN N CHLOROFORM Ą DICHLOROMETAN C TETRAHYDROFURAN A ETER DIETYLOWY OCTAN ETYLU P ACETON O DIOKSAN L ACETONITRYL A IZOPROPANOL R METANOL N WODA O KWAS OCTOWY Ś Ć w praktyce analityczne stosowane kombinacje dwóch i więcej sorbentów. Wybrane zestawy takich złóŝ { Cyjanowy (CN) śel krzem. (SiOH) POLARNY Aminowy (NH 2 ) Florisil (MgSiO 3 ) Tlenek glinowy (Al 2 O 3 ) I i II rzędowe aminy WYMIENIACZ (NH 2 / NH) ANIONOWY (N + ) WYMIENIACZ - COOH KATIONOWY Ph - SO 3 H zwykle dostępnych w postaci kolumienek do SPE przedstawiono wraz z ich zastosowaniem w Tabeli. 30

Zastosowanie techniki SPE z kolumienkami wypełnionymi róŝnymi sorbentami do oczyszczania ekstraktów. Typ kolumienki do SPE CN/SiOH Zastosowanie WWA z gleby - oczyszczanie ekstraktów heksanowych CN SiOH selektywna adsorpcja WWA poprzez wiązania n-n, potem elucja acetonitrylem usuwanie związków polarnych NH 2 /C18 NH 2 C18 SiOH-H + /SA (SiOH) górna warstwa Ŝelu krzemionkowego impregnowana jest H 2 SO 4, dolna warstwa to silnie kwaśny wymieniacz kationowy z grupy kwasu benzenosulfonowego SiOH-H + SA/SiOH SA górna warstwa Ŝelu krzemionkowego to silnie kwaśny wymieniacz kationowy z grupy kwasu benzenosulfonowego, dolna warstwa to Ŝel krzemionkowy SA SiOH Wzbogacanie WWA z wody usuwanie kwasów humusowych wzbogacanie WWA PCB z olejów - oczyszczanie ekstraktów heksanowych wg niemieckiej normy DIN 51 527 utlenianie związków towarzyszących do związków jonowych i/ lub polarnych usuwanie związków jonowych oraz związków siarki PCB z olejów przepracowanych - oczyszczanie ekstraktów heksanowych usuwanie związków jonowych oraz związków siarki usuwanie związków polarnych NAN PCB ze szlamów oczyszczanie ekstraktów heksanowych przeprowadzać stosując mikrokolumny ekstrakcyjne w postaci pipetek Pasteura wypełnione Celem zminimalizowania objętości próbki niezbędnej do realizacji tego procesu, a przede wszystkim zuŝycia toksycznych rozpuszczalników oczyszczanie moŝna złoŝem sorbentu. SiOH-AgNO 3 usuwanie siarki, związków siarki oraz związków polarnych 31

Firmy produkujące akcesoria do SPE 1. Ansys Technologies, Inc. www.ansysinc.com 2. Applied Separations, Inc. www.appliedseparations.com 3. ChromTech www.chromtech.com 4. P. J. Cobert Assoc., Inc. www.cobertassoc.com 5. 3M Corp. www.3m.com 6. Horizon Technology, Inc. www.horizontech.net/horizonhomepage.htm 7. International Sorbent Technology, Ltd. www.ist-spe.com 8. Mallinckrodt Baker, Inc. www.jtbaker.com 9. Orochem Technologies, Inc. www.orochem.com 10. Restek Corp. www.restekcorp.com 11. Supelco www.sigmaaldrich.com 12. United Chemical Technologies, Inc. www.unitedchem.com 13. Varian, Inc. www.varianinc.com 14. Waters Co. www.waters.com 32

Wszelkie prawa zastrzeŝone. Nieautoryzowane rozpowszechnianie całości lub fragmentów niniejszych materiałów jest zabronione. Utwór nie moŝe być powielany ani rozpowszechniany za pomocą urządzeń elektronicznych, mechanicznych, kopiujących, nagrywających i innych bez pisemnej zgody posiadacza praw autorskich. Wykonywanie kopii jakąkolwiek metodą powoduje naruszenie praw autorskich do niniejszej publikacji. i 33

ii Katalog 34