Biologia komórki Skrypt do ćwiczeń dla studentów Bioinformatyki i Biologii Systemów (część mikrobiologiczna) przygotowany przez zespół pracowników Zakładu Genetyki Bakterii INSTYTUT MIKROBIOLOGII WYDZIAŁ BIOLOGII UNIWERSYTET WARSZAWSKI 2015 1
SPIS TREŚCI I. REGULAMIN PRACOWNI 3 II. ĆWICZENIA Ćwiczenie 1. 4 Izolowanie drobnoustrojów z różnych środowisk naturalnych Izolowanie czystych kultur Ćwiczenie 2. 10 Badania mikroskopowe bakterii III. ADDENDUM 13 Opis kolonii bakteryjnych 2
I. Regulamin pracowni 1. W pracowni obowiązuje noszenie fartucha ochronnego (najlepiej białego). 2. Wszystkie odczynniki i ich roztwory, a także podłoża i hodowle mikroorganizmów muszą być czytelnie oznakowane. 3. Na stołach laboratoryjnych mogą znajdować się wyłącznie materiały potrzebne do wykonywania ćwiczenia. 4. Należy zachować daleko idącą ostrożność przy pracy z materiałem mikrobiologicznym, a w szczególności: a) stosować się do zasad pracy jałowej (zachować szczególną ostrożność przy pracy w bezpośrednim sąsiedztwie płomienia palnika); b) wstawiać hodowle bakteryjne w probówkach do statywów (nie wolno ich kłaść na stole); c) opisywać każdą posianą próbę (rodzaj posiewu, inicjały osoby wykonującej posiew, itp.); d) po skończeniu posiewów wyżarzać ezy, opalać głaszczki i zawsze wstawiać je do statywów, a zużyte pipety wkładać do specjalnych pojemników. 5. W pracowni zabronione jest spożywanie posiłków, a także picie napojów. 6. Po zakończeniu pracy należy: a) wyłączyć dopływ gazu; b) posprzątać stół laboratoryjny; c) niepotrzebny już sprzęt odłożyć na miejsce, pozostawić w porządku mikroskopy. 7. Niepotrzebne hodowle drobnoustrojów oraz szkło zużyte w trakcie pracy należy odłożyć do specjalnie przygotowanych pojemników, po uprzednim usunięciu wszelkich napisów. 8. Nie wolno wynosić z pracowni żadnych hodowli bakteryjnych, preparatów i odczynników bez pozwolenia prowadzącego zajęcia. 9. Po zakończeniu ćwiczeń należy sprawdzić, czy został wyłączony gaz oraz aparatura nie przeznaczona do pracy ciągłej, a przed wyjściem z sali umyć ręce. 10. W razie pojawienia się jakichkolwiek problemów należy niezwłocznie zgłosić się do osoby prowadzącej zajęcia. 3
Ćwiczenie 1 Temat: Izolowanie drobnoustrojów z różnych środowisk naturalnych i określanie ich liczebności Izolowanie czystych kultur I. WPROWADZENIE Woda, gleba i organizmy żywe są środowiskami dogodnymi dla wzrostu różnych mikroorganizmów. Mikroorganizmy znajdują się również w powietrzu, które nie jest jednak środowiskiem sprzyjającym ich rozwojowi. To właśnie mikroorganizmy wytyczają granice biosfery, a tak szerokie rozprzestrzenienie w przyrodzie zawdzięczają następującym cechom: 1) małe rozmiary; 2) krótki czas generacji; 3) różnorodność metaboliczna (zdolność do wykorzystania wielu źródeł węgla, azotu, energii, różnych końcowych akceptorów elektronów); 4) zdolność adaptacji do zmieniających się warunków środowiska; 5) zdolność do życia w warunkach ekstremalnych (dotyczy to temperatury, ph, potencjału oksydoredukcyjnego, ciśnienia osmotycznego, ciśnienia hydrostatycznego i bardzo niskich stężeń związków odżywczych); 6) wytwarzanie form przetrwalnikowych. Zwykle w badanym środowisku występują różne mikroorganizmy. Jeśli chcemy wyizolować określony gatunek, musimy zastosować odpowiednie podłoża selekcyjne i takie warunki hodowli, które będą prowadziły do selektywnego namnażania mikroorganizmu poszukiwanego, a hamowały wzrost innych mikroorganizmów. Jeśli spodziewamy się, że w danym środowisku jest mało komórek poszukiwanego mikroorganizmu, to należy założyć tzw. hodowlę wzbogacającą na podłożu płynnym, a dopiero po uzyskaniu wzrostu, przesiać mikroorganizmy na podłoże stałe. Z wyrosłych kolonii możemy następnie założyć czyste kultury, a po ich identyfikacji, uzyskać czystą kulturę poszukiwanego przez nas gatunku. 1. Izolowanie czystych kultur Metody izolowania czystych kultur dzielimy na bezpośrednie i pośrednie. W metodach bezpośrednich pobieramy pojedynczą komórkę mikroorganizmu (np. stosując mikromanipulator) i przenosimy do jałowego podłoża płynnego. W metodach pośrednich izolujemy pojedyncze kolonie na podłożu stałym. Zakładając, że pojedyncza kolonia stanowi potomstwo pojedynczej komórki, pobieramy z niej materiał i przenosimy na podłoże stałe, wykonując posiew redukcyjny. Pojedyncze kolonie możemy uzyskać dzięki posiewowi: 1) powierzchniowemu na podłoże stałe w płytce Petriego, wykonanemu za pomocą: - ezy posiew redukcyjny (metoda suchych rozcieńczeń); - pipety metoda rozcieńczeń; zwykle wysiewa się 0,1 ml i rozprowadza po powierzchni płytki głaszczką; 2) wgłębnemu, w którym zawiesinę mikroorganizmów wprowadza się na dno pustej szalki Petriego, a następnie zalewa upłynnionym i odpowiednio schłodzonym podłożem stałym (zwykle wysiewa się 1 ml). Jeśli w badanej próbie jest mało mikroorganizmów, możemy ją przefiltrować, a filtr umieścić na odpowiednim podłożu. Bakterie wytworzą kolonie na filtrze. 2. Podstawowe pojęcia mikrobiologiczne Hodowla to podłoże z namnożonymi mikroorganizmami. Hodowle można prowadzić na podłożu płynnym bądź stałym. Hodowle mogą być jednogatunkowe (gdy na podłożu rośnie jeden gatunek bakterii) lub mieszane (gdy rosną w nich przynajmniej dwa gatunki). 4
Czystą kulturą nazywamy hodowlę, w której bakterie stanowią potomstwo jednej, pierwotnie wyosobnionej komórki bakteryjnej. Szczepy to różne klony należące do tego samego gatunku, a wyprowadzone z poszczególnych czystych kultur, izolowanych niezależnie od siebie. Kolonia to widoczne gołym okiem skupisko drobnoustrojów na podłożu stałym. Na ogół kolonia powstaje w wyniku podziałów pojedynczej komórki. 3. Określanie liczebności mikroorganizmów Liczebność mikroorganizmów można okreslić, stosując metody bezpośrednie i pośrednie. W metodach bezpośrednich liczymy komórki mikroorganizmów pod mikroskopem. Metody pośrednie polegają na odpowiednim, ilościowym wysiewie badanego materiału na podłoże stałe i uzyskaniu tylu kolonii, aby (a) można je było policzyć, (b) błąd statystyczny był jak najmniejszy (zwykle liczy się kolonie na tych płytkach, gdzie jest ich ~ 30-300). Zakłada się, że każda kolonia wyrasta z podziałów pojedynczej komórki mikroorganizmu. Znając liczbę wyrosłych kolonii, objętość wysianej próbki i ewentualne rozcieńczenie materiału, można oszacować liczbę żywych mikroorganizmów, zdolnych do wytworzenia kolonii (ang. viable count) przypadających na 1 ml czy 1 g badanego środowiska. W metodzie tej oznaczamy w rzeczywistości nie liczbę żywych komórek, lecz liczbę jednostek tworzących kolonie (jtk/ml) (ang. colony forming unit, cfu). Dokładność metody płytkowej jest zadawalająca w przypadku określania w laboratorium gęstości bakterii w hodowli określonego gatunku o znanych wymaganiach pokarmowych. Metodę tę stosuje się także w mikrobiologii żywności, w mikrobiologii medycznej, w analizie sanitarnej wody, gdzie ważne jest dla nas poznanie liczby żywych bakterii. W metodach pośrednich stosuje się różne techniki wysiewu (podobnie jak przy izolowaniu czystych kultur), pamiętając o tym, by wysiew robić co najmniej w dwóch powtórzeniach. Na ćwiczeniach zostanie zastosowana metoda posiewu powierzchniowego, w której materiał zawierający mikroorganizmy odpowiednio się rozcieńcza i wysiewa po 0,1 ml kolejnych rozcieńczeń na odpowiednie podłoża. II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA 1. Technika pracy sterylnej a) Dezynfekcja stołów laboratoryjnych za pomocą sterinolu lub alkoholu etylowego. b) Praca w bezpośrednim sąsiedztwie płomienia palnika. c) Sterylizacja ez (wyżarzanie w płomieniu palnika) i głaszczek (opalanie w etanolu). 2. Przygotowanie podłoży a) Rozlać na płytki Petriego upłynniony agar odżywczy. b) Po zastygnięciu podłoża, płytki wysuszyć, w celu odparowania części wody. c) Przed dokonaniem posiewów płytki należy odpowiednio podpisać flamastrem na denku, uwzględniając rodzaj posiewanej próbki, rozcieńczenie, inicjały osoby wykonującej posiew. 3. Izolowanie drobnoustrojów z powietrza metodą sedymentacyjną Kocha i określanie ich liczby a) Płytki z agarem odżywczym postawić w miejscu, gdzie wykonany będzie posiew. 5
b) Zdjąć wieczko i wystawić pożywkę na działanie powietrza przez 5, 10 lub 15 minut zależnie od przewidywanego skażenia powietrza. Po ekspozycji płytki zakryć. c) Po kilkudniowej inkubacji w temperaturze pokojowej policzyć kolonie mikroorganizmów, a następnie obliczyć ich liczbę (X) w 1 m 3 (10 6 cm 3 ) powietrza według zamieszczonego niżej wzoru (według założenia Omeliańskiego na 1 m 2 (10 4 cm 2 ) podłoża osiada w ciągu 5 minut tyle mikroorganizmów, ile znajduje się 1 m 3 powietrza): Tabela 1. Badanie czystości mikrobiologicznej powietrza Miejsce badania czystości powietrza Liczba drobnoustrojów w 1 m 3 powietrza Powietrze atmosferyczne uważamy za: - nie zanieczyszczone, jeśli ogólna liczba bakterii w 1 m 3 wynosi mniej niż 1000; - średnio zanieczyszczone, jeśli ogólna liczba bakterii w 1 m 3 wynosi od 1000 do 3000; - silnie zanieczyszczone, jeśli ogólna liczba bakterii w 1 m 3 wynosi więcej niż 3000. Dopuszczalny stopień mikrobiologicznego zanieczyszczenia powietrza atmosferycznego wynosi 3000 mikroorganizmów w 1 m 3. Dopuszczalna liczba mikroorganizmów w 1 m 3 powietrza pomieszczeń użytkowych wynosi: - pomieszczenia służby zdrowia sala operacyjna 100 sala opatrunkowa 150 sala z chorymi 1000 - pomieszczenia domów mieszkalnych kuchnia i jadalnia 2000 pokój do przyjęć 1500 sypialnia 1000 - pomieszczenia szkolne sale wykładowe 1500 sale do ćwiczeń 2000 sale gimnastyczne 3000 4. Izolowanie mikroorganizmów z naturalnego zbiornika wodnego i określanie ich liczby a) Rozcieńczyć wodę ze zbiornika (10-1 - 10-4 ) wg schematu przedstawionego na Ryc. 1. - Wlać do 4 probówek po 4,5 ml roztworu fizjologicznego (RF). - Do pierwszej probówki odmierzyć pipetą (à 1 ml) 0,5 ml badanej wody. Pipetę odłożyć, a zawartość probówki dobrze wymieszać na worteksie. W ten sposób rozcieńczyliśmy badaną wodę dziesięciokrotnie (10-1 ). - Przenieść 0,5 ml rozcieńczenia 10-1 do następnej probówki z solą fizjologiczną i wymieszać. Uzyskujemy stukrotne rozcieńczenia badanej wody (10-2 ). - Postępując analogicznie otrzymujemy rozcieńczenia 10-3 i 10-4. 6
wysiew po 0,1ml z każdej probówki na dwie płytki z agarem odżywczym Ryc. 1. Schemat rozcieńczania hodowli bakteryjnej. b) Wysiać po 0,1 ml każdego rozcieńczenia na płytki z agarem odżywczym w 2 powtórzeniach. c) Po kilkudniowej inkubacji w temperaturze pokojowej zaobserwować zróżnicowaną morfologię kolonii mikroorganizmów. d) Następnie policzyć kolonie na płytkach. Do liczenia należy wziąć te płytki, na których wyrosło od 30 do 300 kolonii. Określić liczbę mikroorganizmów zdolnych do wytworzenia kolonii (jednostek tworzących kolonie, jtk) w 1 ml badanej wody (X) wg wzoru: Wyniki zapisać w tabeli 2. 5. Izolowanie mikroorganizmów z gleby i określanie ich liczby a) Przygotować roztwór glebowy. W tym celu odważyć 2 g gleby i wsypać do kolby zawierającej 18 ml soli fizjologicznej. Całość wytrząsać kilka minut w celu wymycia mikroorganizmów z cząstek gleby. Poczekać, aż cząstki stałe opadną na dno. b) Przygotować kolejne rozcieńczenia gleby (10-1 - 10-6 ) tak jak w punkcie 3a, traktując roztwór glebowy jako rozcieńczenie 10-1. Wysiać po 0,1 ml rozcieńczeń od 10-3 do 10-6 na płytki z agarem odżywczym (po 2 płytki na każde rozcieńczenie). c) Po kilkudniowej inkubacji w temperaturze pokojowej zaobserwować zróżnicowaną morfologię kolonii mikroorganizmów. d) Policzyć kolonie na płytkach, a następnie określić liczbę jednostek (mikroorganizmów) zdolnych do wytworzenia kolonii (jtk) w 1 g gleby, stosując wzór z punktu 4d). e) Wyniki zapisać w tabeli 2. 7
Tabela 2. Określenie liczby bakterii w wodzie i glebie Badana próbka Średnia liczba kolonii bakterii na agarze odżywczym na rozcieńczeniu: 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Liczba jtk* w 1 ml wody lub w 1 g gleby Woda X X Gleba X X * jtk = jednostka tworząca kolonię (cfu, ang. colony forming unit) f) Porównać liczebność bakterii w badanej wodzie i glebie. 6. Izolowanie mikroorganizmów z innych środowisk a) Na jednej płytce z agarem odżywczym wykonać posiew dowolny, np. kaszlnąć, dotknąć palcem brudnym i przetartym etanolem, dotknąć jakimś przedmiotem, zrobić posiew materiału pobranego jałową wymazówką, itp. b) Po inkubacji w temperaturze pokojowej obserwować wzrost bakterii. 7. Charakterystyka wybranej kolonii bakteryjnej a) Wybrać jedną z kolonii bakteryjnych i opisać w zeszycie jej morfologię (patrz Addendum str. 12), uwzględniając: - kształt i brzeg kolonii; - wielkość (średnicę) w mm; - wzniesienie; - barwę kolonii i jej otoczenia (barwnik może dyfundować do podłoża); - typ wzrostu (na powierzchni lub częściowo wrośnięta w podłoże); - przejrzystość (przejrzysta, nieprzejrzysta, opalizująca); - powierzchnię (gładka, lśniąca, matowa, pomarszczona, pofałdowana, krzaczkowata, koncentrycznie pierścieniowata); - strukturę (np. ziarnista, włóknista, skórzasta, krucha, ciągnąca się strukturę bada się za pomocą ezy). Należy przy tym pamiętać, że morfologia kolonii zależy nie tylko od rodzaju mikroorganizmu, ale również od składu podłoża i warunków hodowli. Hodowla danego mikroorganizmu może charakteryzować się też swoistym zapachem. b) Wybraną kolonię bakteryjną (z dowolnej płytki) posiać metodą posiewu redukcyjnego na agar odżywczy (tak jak pokazano na rycinie 2). Płytkę inkubować w temperaturze pokojowej. Następnie sprawdzić, czy uzyskana hodowla jest jednorodna i czy pojedyncze kolonie mają taką samą morfologię jak pobrana kolonia wyjściowa. Jeśli tak, to najprawdopodobniej udało się uzyskać czystą kulturę. Posiew redukcyjny należy powtórzyć, pobierając ponownie materiał z pojedynczej kolonii. Należy pamiętać, że mikroorganizmy stanowiące zakażenia mogą charakteryzować się wolniejszym wzrostem, a tym samym ich kolonie mogą pojawić się na płytce w późniejszym czasie. 8
Ryc. 2. Posiew redukcyjny. 1 początek linii posiewu; 2 i 3 miejsca, w których przerywa się posiew i opala ezę w celu usunięcia nadmiaru materiału. III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA 1. Przyczyny szerokiego rozpowszechnienia mikroorganizmów w przyrodzie. 2. Metody izolowania mikroorganizmów z różnych środowisk naturalnych. 3. Podstawowe pojęcia mikrobiologiczne hodowla, czysta kultura, kolonia, szczep. 4. Metody izolowania czystych kultur bezpośrednie i pośrednie. 9
Ćwiczenie 2 Temat: Badania mikroskopowe bakterii I. WPROWADZENIE 1. Barwienia Komórki bakteryjne są zwykle bardzo małe i charakteryzują się małą gęstością słabo załamują i pochłaniają światło, dlatego też trudno jest odróżnić je od podłoża. Przed oglądaniem w mikroskopie, najczęściej się je wybarwia, stosując różne metody, w zależności od rodzaju bakterii oraz celu, jaki chcemy osiągnąć. W tym celu należy przygotować rozmaz bakterii na szkiełku podstawowym, wysuszyć go, a następnie w odpowiedni sposób utrwalić przed barwieniem. W barwieniu prostym stosujemy tylko jeden barwnik, natomiast w złożonym co najmniej dwa barwniki, a często również różne bejce (zaprawy) i odbarwiacze. Przykładem barwienia złożonego jest barwienie Grama, które jest podstawą klasyfikacji i identyfikacji bakterii. W metodzie tej stosujemy dwa barwniki (fiolet krystaliczny i safraninę), płyn Lugola jako bejcę i etanol jako odbarwiacz. Z powodu różnic w budowie ściany komórkowej bakterie gramujemne barwią się na różowo, zaś gramdodatnie na fioletowo. Oprócz barwienia pozytywnego, w którym oglądamy wybarwione bakterie na bezbarwnym tle, istnieją też barwienia negatywne, w których wybarwia się tło (czyli szkiełko podstawowe) za pomocą tuszu bądź nigrozyny. W ten sposób uwidacznia się otoczki bakteryjne, które trudno barwią się metodami pozytywnymi. 2. Kształt komórek bakteryjnych Podstawowe kształty bakterii to kula (ziarniaki), walec (pałeczki i laseczki) i skręcony walec (przecinkowce, krętki i śrubowce). Istnieją też bakterie o kształtach nieregularnych, np. maczugowce. Bakterie mogą tworzyć charakterystyczne układy komórek, takie jak: dwoinki, pakiety, grona (takie układy tworzą ziarniaki), a także łańcuszki (ziarniaki i laseczki). 3. Budowa komórki bakteryjne Strukturami występującymi w każdej komórce bakteryjnej są: nukleoid, błona cytoplazmatyczna i rybosomy. Poza tym, większość bakterii ma ścianę komórkową, a niektóre - otoczki i rzęski. Ściana komórkowa zawiera warstwę mureiny (peptydoglikanu), która u typowych bakterii gramdodatnich jest gruba i silnie usieciowana, zaś u gramujemnych cienka, słabo usieciowana i pokryta błoną zewnętrzną. Budowa peptydoglikanu (jego grubość i stopień usieciowania) warunkuje wynik barwienia bakterii metodą Grama. Dzięki rzęskom bakterie poruszają się, co można zobaczyć pod mikroskopem w tzw. kropli wiszącej, stosując szkiełko z łezką. Ruch bakterii można też wykazać, stosując posiew na słupek z podłożem półpłynnym, a w przypadku bakterii zdolnych do wzrostu rozpełzliwego (ang. swarming) punktowy posiew na środek niewysuszonej płytki. Otoczki pełnią rolę: (i) ochronną (przed wysychaniem, fagocytozą, niektórymi bakteriofagami i pewnymi związkami chemicznymi), a także (ii) w adhezji do podłoża stałego, co jest ważne przy kolonizacji środowiska przez mikroorganizmy. Obecność otoczek można wykazać, stosując złożone barwienie negatywno-pozytywne. 10
II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA 1. Barwienie proste preparatów bakteryjnych Szczepy bakteryjne: - pałeczki: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas fluorescens - laseczki: Bacillus subtilis, B. megaterium - ziarniaki: Micrococcus luteus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis Barwnik: - fiolet krystaliczny (barwić 1 minutę) a) Przygotowanie preparatu - Zrobić rozmaz na szkiełku podstawowym. - Wysuszyć go w temperaturze pokojowej. - Utrwalić, przeprowadzając ostrożnie szkiełko trzykrotnie przez płomień palnika. Przed barwieniem poczekać, aż szkiełko ostygnie. b) Barwienie preparatu - Zalać cały preparat fioletem krystalicznym. - Po 1 minucie zlać barwnik i przemywać szkiełko wodą wodociągową aż do momentu, gdy woda spływająca z preparatu będzie bezbarwna. - Delikatnie usunąć wodę ze szkiełka za pomocą bibuły. - Po całkowitym wyschnięciu szkiełka oglądać preparat go pod mikroskopem, najpierw pod małym powiększeniem, a następnie stosując obiektyw immersyjny. - Narysować wszystkie oglądane formy morfologiczne bakterii i tworzone przez te bakterie układy komórek. 2. Barwienie złożone metodą Grama Szczepy bakteryjne: - Proteus vulgaris (bakteria gramujemna) - Bacillus megaterium (bakteria gramdodatnia) Roztwory stosowane do barwienia: - fiolet krystaliczny - safranina - płyn Lugola - 95 % etanol a) Przygotowanie preparatu - Na szkiełku podstawowym zmieszać hodowle bakterii gramujemnej i gramdodatniej. - Zrobić rozmaz, wysuszyć i utrwalić jak w punkcie 1a). b) Barwienie metodą Grama - Preparat barwić fioletem krystalicznym przez 2 minuty. - Zlać fiolet, wypłukać szkiełko płynem Lugola i zalać je płynem Lugola na 2 minuty. - Spłukać preparat wodą, osuszyć bibułą i zalać na 30 sekund 95 % etanolem. - Spłukać wodą, osuszyć bibułą i dobarwiać safraniną przez 5 minut. - Spłukać wodą, osuszyć i oglądać. 11
- Narysować obraz widziany w mikroskopie, uwzględniając kolor, na jaki wybarwiły się komórki poszczególnych bakterii. 3. Barwienie otoczek metodą Burriego-Ginsa Szczepy bakteryjne: Barwniki: Bacillus megaterium wodny roztwory safraniny (0,2 %) Micrococcus luteus tusz chiński a) Na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanieść kroplę płynnej hodowli Micrococcus luteus (lub B. megaterium) lub zrobić zawiesinę bakterii z hodowli stałej i nanieść kroplę na szkiełko. b) Dodać kroplę tuszu i zmieszać z hodowlą. c) Drugim szkiełkiem podstawowym rozprowadzić zawiesinę po powierzchni szkiełka tak, aby powstała jednorodna, ciemna (lecz nie czarna) warstwa. d) Rozmaz wysuszyć na powietrzu, ostrożnie utrwalić w płomieniu palnika. e) Barwić 0,2 % safraniną przez około 15 sek. f) Spłukać barwnik, preparat osuszyć. g) Obejrzeć pod mikroskopem. Tło powinno być ciemne, bakterie zabarwione na różowo, zaś otoczki są niewybarwione. 4. Wykazanie zdolności bakterii do ruchu a) Z płynnej hodowli Proteus vulgaris przygotować preparat w postaci tzw. kropli wiszącej: - na szkiełko nakrywkowe nanieść maleńką kroplę płynnej hodowli szczepu; - za pomocą wazeliny nałożonej na rogach szkiełka przykleić je nad łezką szkiełka podstawowego. b) Nastawić pod mikroskopem obraz brzegu kropli na małym powiększeniu, a następnie zmienić obiektyw na immersyjny. Obserwować ruch własny bakterii. III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA 1. Podstawowe kształty komórek bakteryjnych i tworzone przez nie układy. 2. Technika sporządzania preparatów mikroskopowych wykonanie rozmazu, cel i sposoby utrwalania preparatów. 3. Podział metod barwienia: barwienia proste i złożone; pozytywne i negatywne. 4. Zasada barwienia metodą Grama. 5. Bakterie gramujemne i gramdodatnie. 6. Technika mikroskopowania (w tym zastosowanie immersji). 7. Budowa i funkcja bakteryjnych struktur komórkowych: ściana komórkowa (w tym błona zewnętrzna bakterii gramujemnych), otoczki, rzęski. 8. Metody określania zdolności bakterii do ruchu. 12
ADDENDUM Opis kolonii bakteryjnych 13