Elektroforeza kwasów nukleinowych

Podobne dokumenty
Elektroforeza kwasów nukleinowych

Elektroforeza kwasów nukleinowych

Elektroforeza kwasów nukleinowych

Elektroforeza kwasów nukleinowych

dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

SPECYFIKACJA TECHNICZNA AGAROZ

Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16

Metody badania ekspresji genów

Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA. Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi

- oznaczenia naukowo-badawcze. - jedna z podstawowych technik. - oznaczenia laboratoryjnodiagnostyczne. Elektroforeza. badawczych.

SubDNA. Zestaw do elektroforezy horyzontalnej w żelu agarozowym z chłodzeniem* Instrukcja Obsługi

TaqNova-RED. Polimeraza DNA RP20R, RP100R

ĆWICZENIE 3 DGGE- ELEKTROFOREZA W ŻELU Z GRADIENTEM CZYNNIKA DENATURUJĄCEGO

O trawieniu restrykcyjnym

ĆWICZENIE III. ELEKTROFOREZA W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM (ANG. POLYACRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS - PAGE)

Metody chromatograficzne w chemii i biotechnologii, wykład 6. Łukasz Berlicki

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów:

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU ELEKTROFOREZA

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna

Ćwiczenie 1 Plazmidy bakteryjne izolacja plazmidowego DNA

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Wyścigi w polu elektrycznym

Metody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA

bi ~ Zestaw dydal<tyczny umożliwiający przeprowadzenie izolacji genomowego DNA z bakterii EasyLation Genomie DNA INSTRUI<CJA DLA STUDENTÓW

GeneMATRIX Agarose-Out DNA Purification Kit

Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, Warszawa. Zakład Biologii Molekularnej

PCR. Aleksandra Sałagacka

ĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków)

Polimeraza Taq (1U/ l) 1-2 U 1 polimeraza Taq jako ostatni składniki mieszaniny końcowa objętość

część I Zestaw do elektroforezy białek dla Instytutu Genetyki i Mikrobiologii Uniwersytetu Wrocławskiego kod CPV SZT.

Farmakogenetyka Biotechnologia Medyczna I o

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

WYSOKOSPRAWNA ELEKTROFOREZA KAPILARNA (HPCE) + +

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Ćwiczenie 5 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych

AmpliTest Babesia spp. (PCR)

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne

NA ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM

Biologia Molekularna Podstawy

Mapowanie fizyczne genomów -konstrukcja map wyskalowanych w jednostkach fizycznych -najdokładniejszą mapą fizyczną genomu, o największej

BADANIE WŁASCIWOSCI FIZYKOCHEMICZNYCH KWASÓW NUKLEINOWYCH

ELEKTROFOREZA BIAŁEK W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM W WARUNKACH DENATURUJĄCYCH

2. Przedmiot zamówienia: Odczynniki chemiczne do izolacji DNA i reakcji PCR, wymienione w Tabeli 1. Nazwa odczynnika Specyfikacja Ilość*

Jaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo?

Zastosowanie teorii węzłów do opisu migracji elektroforetycznej DNA. Łukasz Janus, 10 B2

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Zestaw do izolacji DNA z żeli agarozowych. Nr kat. EM08 Wersja zestawu:

Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów:

PROJEKT WSPÓŁFINANSOWANY PRZEZ UNIĘ EUROPEJSKĄ Z EUROPEJSKIEGO FUNDUSZU ROZWOJU REGIONALNEGO 1 z 7

Porównanie ilości i jakości DNA wyizolowanego z komórki roślinnej i zwierzęcej

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP

Program ćwiczeń z inżynierii genetycznej KP-III rok Biologii

ĆWICZENIE I. ELEKTROFOREZA ŻELOWA BARWNIKÓW SPOŻYWCZYCH. µ = ν / E ELEKTROFOREZA

Zestaw do izolacji DNA z żeli agarozowych. Nr kat. EM08 Wersja zestawu:

Zestaw do wykrywania Anaplasma phagocytophilum w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych

dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

SYLABUS. Wydział Biologiczno-Rolniczy. Katedra Biochemii i Biologii Komórki

DHPLC. Denaturing high performance liquid chromatography. Wiktoria Stańczyk Zofia Kołeczko

Przynieść kalkulator, jeden na osobę (nie w telefonie!)

Zastosowanie chromatografii do analizy białek i kwasów nukleinowych

Izolowanie i amplifikacja kwasów nukleinowych

Ćwiczenia 2-4 KLONOWANIE DNA

dla której jest spełniony warunek równowagi: [H + ] [X ] / [HX] = K

Spis treści. Definicja

IZOLACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH WARUNKI ZALICZENIA PRZEDMIOTU- 7 ECTS PRZEDMIOT PROGOWY!!!

RT31-020, RT , MgCl 2. , random heksamerów X 6

dostawa odczynników chemicznych oraz akcesoriów laboratoryjnych

Anna Litwiniec 1, Beata Choińska 1, Aleksander Łukanowski 2, Żaneta Świtalska 1, Maria Gośka 1

Zestaw dydaktyczny umożliwiający przeprowadzenie izolacji plazmidowego DNA

ELEKTROFOREZA. Wykonanie ćwiczenia 8. ELEKTROFOREZA BARWNIKÓW W ŻELU AGAROZOWYM

ELEKTROFOREZA ŻELOWA KOLAGENU

Ćwiczenie 1 Plazmidy bakteryjne izolacja plazmidowego DNA

Zestaw do wykrywania Chlamydia trachomatis w moczu lub w kulturach komórkowych

Zestaw do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych. Nr kat. EM03 Wersja zestawu:

ĆWICZENIA Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ

Ćwiczenia nr 3 Genotypowanie mikrosatelitów przy użyciu automatycznego kapilarnego analizatora DNA

WETERYNARIA Ćwiczenia laboratoryjne X DNA i RNA

Gel-Out. 50 izolacji, 250 izolacji. Nr kat , Zestaw do izolacji DNA z żelu agarozowego. wersja 0617

Dominika Stelmach Gr. 10B2

ELEKTROFOREZA ŻELOWA BARWNIKÓW SPOŻYWCZYCH

Inżynieria Genetyczna ćw. 3

Zestaw do wykrywania Babesia spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych

Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne wektory DNA inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, nukleazy

Autor: dr Mirosława Staniaszek

Spis treści. Wstęp. Obiekt. Pracownia Biologii Molekularnej. Część II. Ekspresja i oczyszczanie białek

SYLABUS. Wydział Biologiczno-Rolniczy. Katedra Biochemii i Biologii Komórki

GeneMATRIX Basic DNA Purification Kit

JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?

Pytania z Wysokosprawnej chromatografii cieczowej

PARAMETRY TECHNICZNE I ILOŚCIOWE PRZEDMIOTU NINIEJSZEGO POSTĘPOWANIA

SKUTECZNOŚĆ IZOLACJI JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?

Definicja immobilizacji

Biologia molekularna

ZAMRAŻANIE PODSTAWY CZ.1

EKSTRAHOWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?

ENZYMY RESTRYKCYJNE ENZYMY RESTRYKCYJNE CZYM RÓŻNIĄ SIĘ POSZCZEGÓLNE ENZYMY? nazewnictwo: EcoRV

Transkrypt:

Elektroforeza kwasów nukleinowych

Elektroforeza jest podstawową techniką wizualizacji kwasów nukleinowych pozwala bezpośrednio identyfikować cząsteczki DNA i jest stosunkowo czuła (po odpowiednim wybarwieniu żelu jesteśmy w stanie zobaczyć ng DNA) jest techniką rozdzielania fragmentów DNA według ich wielkości pozwala na określenie wielkości cząsteczek przez porównanie drogi migracji z fragmentami o znanej wielkości (tzw. markerów) jest techniką oczyszczania DNA techniki elektroforetyczne w swoich podstawowych wersjach są proste, szybkie i stosunkowo tanie

Podział technik elektroforezy DNA Agarozowa (horyzontalna) -w stałym polu elektrycznym -w zmiennym polu (PFGE) Akrylamidowa (wertykalna) -denaturująca -niedenaturująca elektroforezę w żelu agarozowym stosuje się do rozdzielania większych cząsteczek DNA. elektroforezę w żelu poliakrylamidowym stosuje się do rozdzielania małych fragmentów DNA. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym w stałym polu elektrycznym jest rutynową techniką wizualizacji DNA i RNA

Funkcjonuje na zasadzie sita molekularnego, gdzie negatywnie naładowane cząsteczki poruszają się w polu elektrycznym w kierunku anody; krótsze wędrują szybciej, dłuższe wolniej Fragmenty DNA Cząsteczki żelu Pory

Elektroforeza agarozowa Agaroza jest naturalnym polimerem izolowanym z krasnorostów Zalety elektroforezy agarozowej duży zakres rozdzielanych fragmentów DNA od kilkuset pz do 40 kpz (w elektroforezie w stałym polu) i Mpz (w zmiennym polu elektrycznym) łatwość przygotowania żelu i elektroforezy jest nietoksyczna Wady mała zdolność rozdzielcza żeli agarozowych agaroza jest stosunkowo droga

Przebieg elektroforezy Przygotowanie próbek Roztwór DNA miesza się z buforem próbkowym, który zagęszcza DNA (nie wypływa ze studzienek) pozwala obserwować migrację DNA

Barwienie żeli agarozowych Bromek etydyny (EB) jest używany najczęściej, lecz jest silnie mutagenny. Należy unikać barwienia żeli przed elektroforezą (tzn. barwnik dodany do agarozy lub do buforu). Daje dość silne tło i żele powinno się odbarwiać przed archiwizacją. SYBR Green, SYBR Gold bardzo czuły, nieszkodliwy, degraduje w lekko alkalicznych warunkach, WADA!!! - drogi. Porównanie czułości barwników Gel Red i EB

Czynniki wpływające na stopień migracji DNA w żelu agarozowym Wielkość cząsteczki - dsdna liniowe migruje w żelu z szybkością odwrotnie proporcjonalną do ilości par zasad (odwrotnie proporcjonalna do log 10 z masy cząsteczkowej)

Konformacja DNA - superzwinięta kolista forma (CCC), otwarto kolista (OC) i liniowa (LIN) forma migrują w żelu z różną szybkością. Względna ruchliwość tych form zależy od stęż. agarozy, natężenia prądu, siły jonowej buforu i gęstości superskrętów formy CCC. Najlepiej dla odróżnienia form stosować odpowiednie markery (zwykle plazmidy i fragmenty DNA). Forma OC Forma CCC Forma LIN

Stężenie agarozy jest liniowa zależność między logarytmem mobilności elektroforetycznej DNA ( ) i stężeniem żelu ( ) wg. równania: log = log o K r gdzie o jest swobodną ruchliwością DNA i K r jest współczynnikiem opóźnienia, czyli stałą związaną z własnościami żelu oraz wielkością i kształtem cząsteczek. Agarose gel, % Range of separation, bp Polyacrylamid e gel, % Elektroforeza DNA w żelach o różnym stęż. agarozy Range of separation, bp 0.5 1,000-30,000 3.5 100-1,000 0.7 800-12,000 5.0 80-500 1.0 500-10,000 8.0 60-400 1.2 400-7,000 12.0 40-200 1.4 200-4,000 20.0 5-100 2.0 50-2,000

Obecność bromku etydyny w żelu i buforze. Interkalacja bromku etydyny powoduje spadek ładunku negatywnego w dsdna i wzrost sztywności i długości DNA. Stopień migracji jest opóźniony o około 15%. Napięcie prądu w niskim napięciu, stopień migracji liniowych fragmentów DNA jest proporcjonalny do zaaplikowanego napięcia. W wyższym napięciu mobilność wysoko-cząsteczkowych fragmentów nie jest proporcjonalna do napięcia. Skład buforu do elektroforezy w roztworach o niskiej sile jonowej DNA migruje wolno, w buforach o zbyt wysokiej sile jonowej przepływ ładunku powoduje wydzielanie się ciepła co może prowadzić do rozpuszczenia żelu i denaturacji DNA

Markery wielkości Konwencjonalne oparte na DNA plazmidów i fagów

Tzw. drabinki (ladders)

Izolacja DNA z żeli agarozowych DNA rozdzielone w żelu agarozowym, można odzyskać elektroforeza jest techniką oczyszczania DNA Komercyjne zestawy do izolacji DNA z żelu oferowane przez firmy wykorzystują np. bardzo drobne perełki szklane. DNA jest adsorbowane na perełkach z rozpuszczonej agarozy w wysokim stęż. soli, a eluowane w niskim stęż. soli.

Elektroforeza pulsacyjna - PFGE (Pulsed- Field Gel Electrophoresis) Fragmenty dsdna powyżej krytycznej wielkości ~40 kb migrują w żelu agarozowym ze stałą szybkością, niezależną od wielkości. Z tego powodu nie można ich rozdzielić w stałym prądzie na horyzontalnych żelach. PFGE jest elektroforezą, w której pole elektryczne jest okresowo zmieniane, co pozwala na rozdział cząsteczek DNA do wlk. rzędu Mpz. Rozdział następuje ponieważ czas wymagany do zmiany kierunku migracji dla cząsteczki DNA zależy od jej wielkości w zmiennym polu elektrycznym. Krótsze cząsteczki mogą szybciej reorientować się (tzn. zmieniać konformację i powracać do stanu pierwotnego) niż dłuższe i dlatego wędrują w żelu z większą szybkością. Dłuższe cząsteczki większość czasu potrzebują na reorientację w zmieniającym się napięciu pola, niż na migrację. Różnica w czasie reorientacji jest tym czynnikiem, który decyduje o rozdzielaniu się fragmentów DNA o wlk. powyżej 40 kb.

CHEF Cantour-Clamped Homogenous Electric Field Electrophoresis Elektroforeza w zmiennym, homogennym polu elektrycznym o kształcie sześciokąta foremnego Elektrody ułożone są w kształcie sześciokąta foremnego daje to jednorodne pole elektryczne o kącie reorientacji 120 o. DNA migruje w prostych torach rozdziału.

CHEF Elektroforeza w zmiennym, homogennym polu elektrycznym o kształcie sześciokąta foremnego

Przygotowanie próbek PFGE wymaga nieuszkodzonego DNA ponieważ każde uszkodzenie spowoduje zmianę wyglądu prążków. Najpierw umieszcza się bakterie lub inne komórki w agarozie, a następnie trawi się je enzymami litycznymi, co nie narusza DNA. DNA następnie można trawić enzymami restrykcyjnymi. Tak przygotowany preparat jest przycinany do odpowiedniej wielkości, wkładany do wejścia w żelu agarozowym i zaklejany agarozą. Enzymy restrykcyjne w PFGE Wybiera się enzymy, które: - tną DNA rzadko np. rozpoznają 8-nukleotydowe sekwencje, -w rozpoznawanej sekwencji mają dużo par GC ( jest rzadko spotykany u Eukaryota -w rozpoznawanej sekwencji mają dużo par AT (mogą być rzadsze u Prokaryota

Zastosowanie PFGE - rozdzielanie cząsteczek DNA w zakresie 50 kpz 10 Mpz Izolowane fragmenty mogą być użyte do klonowania; - konstruowanie map restrykcyjnych całych genomów bakterii oraz dużych regionów genomów eukariotycznych; - identyfikacja genomów w tzw. epidemiologii molekularnej

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym Polimer akrylamidu może służyć do rozdziału dsdna i ssdna według wielkości i konformacji. Żele poliakrylamidowe mają trzy główne cechy korzystniejsze niż żele agarozowe: - ich zdolność rozdzielcza jest tak duża, że mogą rozdzielać cząsteczki różniące się długością równą 0.1% (tzn. 1 bp w 1000 bp); - można rozdzielać większe ilości DNA można rozdzielać do 10 µg DNA w jednej ścieżce (1 cm x 1 mm) bez utraty zdolności rozdzielczej; - DNA odzyskane z żelu akrylamidowego jest bardzo czyste (metodami podobnymi do odzyskiwania z agarozy ) i można go używać np. do iniekcji zarodków mysich).

Zdolność rozdzielcza zależy od wielkości porów jakie tworzy polimer, a to zależy od stężenia akrylamidu i N,N -metylenbisakrylamidu oraz od szeregu innych czynników jak natężenie prądu czy grubość żelu. Zakres stężenia akrylamidu to 3.5% - 20%, w którym dzieli się fragmenty 6-2000 pz. Stosunek bisakrylamidu do akrylamidu wynosi zwykle 1:30 Żele akrylamidowe nie mogą być barwione przed elektroforezą, ponieważ bromek etydyny hamuje polimeryzację akrylamidu, ale barwią się po elektroforezie, lecz z mniejszą efektywnością niż agaroza. Do barwienia DNA w tych żelach można używać także innych barwników jak SYBR.

Rodzaje żeli akrylamidowych w elektroforezie DNA: Żele denaturujące służą do rozdzielania i oczyszczania ssdna lub RNA. Te żele są polimeryzowane w obecności mocznika, formamidu lub formaldehydem co hamuje tworzenie par w DNA. Zdenaturowany DNA migruje w tych żelach z szybkością niezależną od składu zasad i ich sekwencji. Stosuje się m.in. do rozdziału RNA, izolacji radioaktywnych sond i do rozdziału produktów reakcji sekwencyjnych. Żele niedenaturujące są używane do rozdziału i oczyszczania dsdna. Zasadniczo dsdna migruje w żelach z szybkością odwrotnie proporcjonalną do log 10 z ich wielkości. Jednakże szybkość migracji zależy też od składu zasad i fragmenty tej samej wielkości mogą migrować z szybkością różniącą się nawet o 10%. Zwykle służą do preparowania bardzo czystego DNA i do wykrywania interakcji DNA-białko (EMSA - Gel Shift Assay).