Oświadczenie kierującego pracą. Oświadczenie autora pracy

Oświadczenie kierującego pracą Oświadczam, że praca dyplomowa magisterska studentki Moniki Suszek pt. Oznaczanie wybranych węglowodorów aromatycznych (WWA) przy zastosowaniu chromatografii gazowej z detekcją mas (GC/MS) i wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych z detekcją fluorescencyjną (RP-HPLC-FLD) została przygotowana pod moim kierunkiem, stwierdzam, że spełnia ona warunki przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie tytułu zawodowego magistra. 28.06.2007 r. Prof. Bronisław Krzysztof Głód podpis kierującego pracą Oświadczenie autora pracy Świadoma odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza praca dyplomowa magisterska pt. Oznaczanie wybranych węglowodorów aromatycznych (WWA) przy zastosowaniu chromatografii gazowej z detekcją mas (GC/MS) i wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych z detekcją fluorescencyjną (RP- HPLC-FLD) została napisana przeze mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny z obowiązującymi przepisami (Ustawa z dnia 04.02.94 r. o prawie autorskim i prawach pokrewnych: Dz. U. z 2006 r. nr 90, poz. 631 z późniejszymi zmianami). Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur związanych z uzyskaniem tytułu zawodowego w szkole wyższej. Oświadczam ponadto, że niniejsza wersja jest identyczna z załączoną wersją elektroniczną. 28.06.2007 r. Monika Suszek podpis autora pracy 1

AKADEMIA PODLASKA WYDZIAŁ NAUK ŚCISŁYCH Kierunek chemia Monika Suszek Oznaczanie wybranych węglowodorów aromatycznych (WWA) przy zastosowaniu chromatografii gazowej z detekcją mas (GC/MS) i wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych z detekcją fluorescencyjną (RP-HPLC-FLD) Praca magisterska napisana w Katedrze Chemii Organicznej i Stosowanej pod kierunkiem Prof. dr hab. Bronisława Krzysztofa Głoda Siedlce, 2007 2

Improved Analytical Assay for Selected PAHs Using GC/MS and RP-HPLC-FLD Wykaz słów kluczowych: wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), benzo[a]piren, wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), chromatografia gazowa ze spektrometrem mas (GC/MS), chromatografia wykluczania sterycznego (SEC). 3

Panu prof. dr hab. Bronisławowi K. Głodowi składam serdeczne podziękowania za okazaną pomoc i cenne wskazówki w czasie wykonywania pracy magisterskiej 4

Panu mgr Pawłowi Piszczowi składam podziękowania za wszelką udzieloną pomoc przy wykonywaniu tej pracy 5

Kochanym Rodzicom oraz wszystkim, którzy się przyczynili do powstania tej pracy dziękuję za wiarę, optymizm i wsparcie 6

SPIS TREŚCI 1. WSTĘP...3 2. CZĘŚĆ LITERATUROWA...4 2.1. Ogólna Charakterystyka Wielopierścieniowych Węglowodorów Aromatycznych... (WWA)...4 2.1.1. Właściwości fizyczne WWA...7 2.1.2. Właściwości chemiczne WWA...7 2.2. Odkrycie i występowanie WWA...9 2.3. Toksyczność WWA, absorpcja i metabolizm w organizmach żywych...10 2.3.1. Aktywność biologiczna i absorpcja WWA...10 2.3.2. Działanie kancerogenne i mutagenne WWA...11 2.3.3. Metabolizm WWA w organizmie...13 2.4. Charakterystyka skażenia żywności WWA...15 2.5. Metody oznaczania WWA...17 2.6. Wpływ rodników hydroksylowych na benzo[a]piren...18 3. CEL PRACY...19 4. CZEŚĆ EKSPERYMENTALNA...20 4.1. Aparatura...20 4.1.1. Preparatywny chromatograf wykluczania sterycznego (SEC)...20 4.1.2. Chromatograf gazowy ze spektrometrem mas (GC/MS) I...20 4.1.3. Chromatograf gazowy ze spektrometrem mas (GC/MS) II...20 4.3.2. Analityczny wysokosprawny chromatograf cieczowy (HPLC)...21 4.2. Odczynniki...22 4.3. Procedura analityczna...24 4.3.1. Przygotowanie roztworów wzorcowych...24 4.3.2. Przygotowanie próbek olei i wyodrębnienie frakcji WWA z matrycy tłuszczowej 24 4.3.3. Warunki analizy za pomocą chromatografii cieczowej...25 4.3.4. Przeprowadzanie reakcji B[a]P z rodnikami hydroksylowymi...26 4.3.5. Statystyczna analiza danych...26 5. WYNIKI I DYSKUSJA...27 5.1. Przygotowanie próbki chromatografia preparatywna...27 5.2. Analizy chromatograficzne GC/MS...28 5.3. Analizy chromatograficzne HPLC...31 5.4. Oznaczanie WWA w próbkach olejów jadalnych...32 1

5.5. Wpływ temperatury na rozdział WWA metodą HPLC...34 5.6. Walidacja metody...40 5.7. Utlenianie B[a]P przez rodniki hydroksylowe...42 6. WNIOSKI...44 7. BIBLIOGRAFIA...45 2

1. WSTĘP Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) to bardzo zróżnicowana i wszechobecna grupa zanieczyszczeń występujących zarówno w środowisku jak i w artykułach spożywczych. Zazwyczaj występują one w postaci wieloskładnikowych mieszanin różnych WWA. Liczne badania sugerują ich kancero- i mutagenne własności. Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne należą do grupy związków chemicznych zanieczyszczających środowisko i artykuły spożywcze, które ze względu na powszechność ich występowania i ich zdolność do wchłaniania są skażeniami trudnymi do uniknięcia. Problematyka skażenia zarówno środowiska naturalnego jak i żywności w ostatnich latach wzbudza duże zainteresowanie badaczy, a także zwykłych konsumentów. Świadomość występowania niekorzystnych zmian w organizmach, jakie powodują wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne powoduje poszukiwanie i udoskonalanie metod analitycznych ich oznaczania. Zostało to w szczególności wymuszone przez przystąpienie Polski do Unii Europejskiej. W Rozporządzeniu Komisji (UE) nr 208/2005 z dnia 4 lutego 2005r. zamieniającym rozporządzenie (UE) nr 466/2001 w odniesieniu do wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych ustalono dopuszczalne stężenia benzo[a]pirenu w żywności. Z kolei w Rozporządzeniu nr 2065/2003 z dnia 10 listopada 2003r. określono dopuszczalne stężenie benzo[a]antracenu w dymach wędzarniczych. Komisja Nauki UE zasugerowała, aby w przyszłości oznaczać 15 WWA w żywności, zgodnie z podaną listą. 3

2. CZĘŚĆ LITERATUROWA 2.1. Ogólna Charakterystyka Wielopierścieniowych Węglowodorów Aromatycznych (WWA) Wielopierścieniowe Węglowodory Aromatyczne WWA (ang. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons - PAHs) stanowią grupę związków chemicznych zawierającą dwa lub więcej skondensowane pierścienie aromatyczne. Cząsteczka WWA ma budowę płaską. Poznanych zostało około 100 homocyklicznych węglowodorów występujących w środowisku, a ponadto kilkaset ich pochodnych alkilowych, aminowych, nitrowych itp. Znane są również heterocykliczne WWA z wbudowanymi atomami tlenu, siarki, lub azotu. W środowisku występują WWA głównie w postaci mieszanin tych związków. Najbardziej poznanym i najczęściej oznaczanym WWA jest benzo[a]piren. Tabela 1. Najczęściej oznaczane WWA - lista EPA-US (1-16) i KN UE (SCF-UE) (9-23) [1, 2] EPA-US Environmental Protecting Agency United States, KN UE- Komisja Nauki Unii Europejskiej, (SCF-UE Union European Commission Scientific Committee on Food ) L.p Nazwa związku Akronim Masa cząsteczkowa Wzór sumaryczny Wzór strukturalny 1 Acenaften ACF 154 C12H12 2 Acenaftylen ACN 152 C12H10 3 Antracen AT 178 C14H10 4 Fluoranten F 202 C16H10 4

5 Fluoren FL 166 C13H10 6 Naftalen NA 128 C 10 H 8 7 Fenantren FA 178 C14H10 8 Piren P 202 C16H10 9 Benzo[a]antracen B[a]A 228 C18H12 10 Benzo[a]piren B[a]P 252 C20H12 11 Benzo[b]fluoranten B[b]F 252 C20H12 12 Benzo[ghi]perylen B[g]P 276 C22H12 13 Benzo[k]fluoranten B[k]F 252 C20H12 5

14 Chryzen Ch 228 C18H12 15 Dibenzo[a,h]antracen D[h]A 278 C22H14 16 Indeno[1,2,3-cd]piren I[c]P 276 C22H12 17 Benzo[j]fluoranten B[j]F 252 C20H12 18 Cyklopenta[c,d]piren CPP 226 C 18 H 10 19 Dibenzo[a,e]piren D[e]P 302 C 24 H 14 20 Dibenzo[a,h]piren D[h]P 302 C 24 H 14 6

21 Dibenzo[a,i]piren D[i]P 302 C 24 H 14 22 Dibenzo[a,l]piren D[l]P 302 C 24 H 14 23 5-Metylochryzen 5MC 242 C 19 H 14 H 3 C 2.1.1. Właściwości fizyczne WWA WWA są to ciała stałe o krystalicznej budowie, które w stanie czystym występują jako bezbarwne, jasno żółte lub zielone kryształy. Mają niską lotność (głównie cięższe WWA) i słabą rozpuszczalnością w wodzie (brak grup polarnych). Im większa jest ich masa cząsteczkowa tym mniejsza rozpuszczalność węglowodorów. Przykładowo, rozpuszczalność naftalenu (M=128) w wodzie wynosi 37,2 [µg/l], benzo[a]antracenu (M=228) - 14 [µg/l], benzo[a]pirenu (M=252) - 3,8 [µg/l] natomiast perylenu (M=252) tylko 0,4 [µg/l]. Z tego powodu bardzo łatwo adsorbują się one na cząstkach niepolarnych, takich jak np. pyły. Absorbują one światło w zakresie UV- VIS, co wykorzystuje się to do oznaczeń zarówno ilościowych i jakościowych [3, 4]. 2.1.2. Właściwości chemiczne WWA Węglowodory aromatyczne pod wpływem światła oraz tlenu łatwo ulegają reakcjom fotochemicznym tworząc epoksydy, chinony, diole, fenole i aldehydy (Schemat 1). W układach biologicznych reakcje te są kontrolowane enzymatycznie (Schemat 2). Im większa liczba 7

skondensowanych pierścieni w cząsteczce WWA tym łatwiej się ona utlenia. Będąc związkami aromatycznymi ulegają także reakcjom substytucji elektrofilowej. O HO OH epoksyd [O] [O] dihydrodiol O O [O] [O] OH chinon fenol Schemat 1. Utlenianie pierścienia aromatycznego WWA. O 2 enzym benzo[a]piren O 7,8-epoksybenzo[a]piren enzym O O 2 HO enzym HO OH 9,10-epoksy-trans-7,8-dihydroksybenzo[a]piren OH trans-7,8-dihydroksybenzo[a]piren Schemat 2. Utlenianie benzo[a]pirenu w układach biologicznych. 8

2.2. Odkrycie i występowanie WWA Już w 1775 roku anglik sir Percival Pott wskazał na powiązania pomiędzy wzmożoną zachorowalnością na raka moszny u londyńskich kominiarzy, a ekspozycją na WWA. Wysunął hipotezę, że zachorowalność na nowotwory jest powiązana z ekspozycją na smołę i sadzę, z którą mieli do czynienia podczas wykonywania swojej pracy. Pott nie potrafił jeszcze nazwać i wyodrębnić związków chemicznych, które zawarte w sadzach powodowały nowotwory. Dopiero po ponad 150 latach, w roku 1929 zidentyfikowano dibenzo[a,h]antracen występujący w sadzach, który jest odpowiedzialny za powstawanie chorób nowotworowych [5]. WWA powstają podczas niepełnego spalania substancji organicznej (z syntezy niskocząsteczkowych związków lub rozpadu wysokocząsteczkowych, głównie lignin). Jako naturalne źródła emisji wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych do środowiska należy wymienić: pożary, wybuchy wulkanów, wypalanie traw i nieużytków. W niewielkich ilościach zawierają je także naturalne kopaliny, a mianowicie węgiel kamienny czy ropa naftowa. Spośród źródeł generowanych przez człowieka najważniejszymi są emisja gazów i dymów z zakładów przemysłowych (szczególnie z przemysłu ciężkiego) oraz procesy wytwarzania energii w elektrowniach i elektrociepłowniach. Istotnymi źródłami uwalnianie WWA do środowiska są także: motoryzacja (spaliny samochodowe, ścieranie się opon) oraz dymy z kotłowni i pieców domowych [6]. Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne występują także w surowcach przemysłowych takich jak pak węglowy, oleje mineralne oraz w produktach ich obróbki: smoła pogazowa, sadze czy też olej kreozotowy. Skład i ilość mieszanin WWA emitowanych do środowiska zależy od rodzaju substancji spalanej, metody spalania oraz stosowania filtrów i innych urządzeń chroniących przed ich emisją [7]. Większość wielopierścieniowych węglowodorów w powietrzu występuje pod postacią par i aerozoli zaadsorbowanych na pyłach o średnicy około 0,5 nm. Tak zaadsorbowane cząsteczki WWA mogą być przenoszone za pomocą wiatru daleko od miejsc, w których powstały, zanieczyszczając glebę, wodę i rośliny. Szczególnie dotyczy to węglowodorów ciężkich. W literaturze można znaleźć dużo prac odnośnie zależności charakterystyki emisji WWA od źródeł ich powstawania. Jednym z ważniejszych czynników wpływających na immisję węglowodorów do środowiska są ruchy powietrza [8]. Węglowodory skażające atmosferę to głównie węglowodory alifatyczne zarówno nasycone jak i nienasycone, a także węglowodory aromatyczne o małej masie cząsteczkowej [9]. Tylko cząstki o średnicy mniejszej niż 1 µm wnikają drogą oddechową. W szczególności zagrożenie ekspozycją na WWA występuje w 9

takich gałęziach przemysłu jak hutnictwo, przemysł gumowy, produkcja sadzy czy koksownictwo [7]. Odrębnym źródłem powstawania i emisji WWA jest palenie papierosów. 2.3. Toksyczność WWA, absorpcja i metabolizm w organizmach żywych 2.3.1. Aktywność biologiczna i absorpcja WWA Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne mają różne struktury, w których pierścienie benzenu przyjmują różne wzajemne położenia. W niektórych cząstkach WWA występują charakterystyczne obszary, zwane regionem K (zewnętrzna krawędź pierścienia fenantrenu) oraz region M (przeciwstawne atomy struktury antracenu). Ważne jest także położenie regionu, zwanego regionem zatoki. To właśnie na te obszary i pozycje wskazują badacze i przypisują im aktywność biologiczną [10]. Schemat budowy WWA na przykładzie benzo[a]piranu wraz z zaznaczonymi regionami o biologicznej aktywności przedstawia Rysunek 1. region zatoki 12 1 11 2 9 10 3 8 7 6 5 4 region M region K Rysunek 1. Wzór strukturalny B[a]P wraz z zaznaczonymi regionami o biologicznej aktywności. Drogi przenikania węglowodorów do organizmów żywych [11]: - wziewna, przez układ oddechowy, - pokarmowa, wraz ze spożywanym pokarmem, - poprzez skórę. 10

W procesie pobrania drogą pokarmową WWA stwierdzono, że największy udział mają produkty pochodzenia zwierzęcego, następnie oleje i tłuszcze roślinne, produkty zbożowe, ryby i produkty rybne. Udział warzyw i owoców w przeciętnym pobraniu WWA jest minimalny [12]. 2.3.2. Działanie kancerogenne i mutagenne WWA Wyniki wieloletnich badań wykazały, że dłuższa ekspozycja organizmów żywych na WWA może powodować szereg niekorzystnych oddziaływań i zmian. Wiele WWA ma właściwości kancero- i mutagenne, a także geno- i embriotoksyczne [13]. Nie zaobserwowano natomiast ich ostrego działania toksycznego. Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne wykazują toksyczność układową, co potwierdziły badania przeprowadzone na zwierzętach. Celowe narażanie zwierząt, powodowało u nich uszkodzenie układu chłonnego, oddechowego i krwiotwórczego[14]. Tabela 2. Względne aktywności kancero- i mutagenna wybranych WWA [15,16] Nazwa związku dibenzo[a,h]antracen benzo[a]piren indeno[1,2,3-cd]piren benzo[a]antracen benzo[a]fluoranten benzo[k]fluoranten benzo[j]fluoranten piren benzo[ghi]perylen benzo[e]piren chryzen Aktywność kancerogenna 1,110 1,000 0,232 0,145 0,141 0,066 0,061 0,081 0,022 0,004 0,004 Aktywność mutagenna 0,47 1,00 0,14 0,62 0,20 - - 0,20 0,08 0,42 0,37 Następstwem długotrwałej ekspozycji na ciężkie WWA jest ich działanie muta- i teratogenne. W 1981 roku Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska (EPA) ustaliła listę 126 związków chemicznych jako szczególnie toksycznych zanieczyszczeń. W tej grupie związków 11

znalazło się 16 wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych. Eksperci z tejże agencji podzielili wyselekcjonowane WWA na dwie podgrupy według ilości pierścieni i właściwości toksycznych. W celu określenia ryzyka kancerogennego w odniesieniu do poszczególnych WWA, przyjęto benzo[a]piren za związek wzorcowy ze względu na to, że jest on najbardziej rozpowszechnionym i poznanym WWA, dla którego względny współczynnik kancerogenności (WWK) wynosi 1. Siła działania rakotwórczego pozostałych WWA obliczana jest względem niego. Wartości WWK dla niektórych WWA przedstawia Tabela 2. Tabela 3. Klasyfikacja WWA ze względu na siłę działania kancerogennego według IARC (Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem) [17] Prawdopodobnie kancerogenny benzo[a]antracen benzo[a]piren dibenzo[a,h]antracen Możliwie kancerogenny benzo[b]fluoranten benzo[j]fluoranten benzo[k]fluoranten dibenzo[a,e]piren dibenzo[a,h]piren dibenzo[a,i]piren dibenzo[a,l]piren indeno[1,2,3-cd]piren 5-metylochryzen dibeno[a,h]antracen dibenzo[a,j]antracen Badania Międzynarodowej Agencji Badań nad Rakiem (IARC) potwierdzają właściwości kancerogenne, teratogenne oraz mutagenne wielu przebadanych WWA. Jednakże eksperci z IARC sugerują pewne zastrzeżenia i konieczność rozpatrzenia następujących kwestii [17]: badania były przeprowadzane na zwierzętach doświadczalnych, więc należy z pewną ostrożnością interpretować wyniki względem ekspozycji oddziaływania WWA na organizm ludzki, w dużej mierze badania dotyczyły poszczególnych wybranych WWA, nie uwzględniając, że występują one przeważnie w mieszaninach, badania nie brały po uwagę WWA dostających się do organizmu drogą pokarmową oraz poprzez układ oddechowy. 12

Okazało się, że dwu-, trzy- oraz czteropierścieniowe węglowodory nie są kancerogenne. Również 9,10-dwumetyloantracen, 1,2,3,4-terametylofenantren i benzo[a]antracen posiadają niski potencjał kancerogenny. Natomiast dibenzo[a,h]antracen oraz benzo[a]piren są silnie kancerogenne [17]. Korzystając z wyników badań przeprowadzonych na zwierzętach doświadczalnych wyznaczono dawkę minimalnego poziomu ryzyka (z ang. minimal risk lewel MRL). Dla ludzi wynosi ona 0,01 mg B[a]P na kg mc na dzień oraz 3,65 mg na kg mc na rok. Należy zaznaczyć, że sugerowana dawka nie oznacza konieczności wystąpienia choroby nowotworowej, a jedynie prowizoryczną dawkę względnego ryzyka. 2.3.3. Metabolizm WWA w organizmie Po wniknięciu do organizmu WWA ulegają szeregowi przemian metabolicznych, koniecznych do ich detoksytacji i wydalenia z organizmu. Podobna struktura różnych węglowodorów aromatycznych powoduje ich zbieżne przemiany metaboliczne. Najdokładniej poznanym i opisywanym w literaturze jest metabolizm benzo[a]piranu. Mechanizm przemian został przedstawiony na Schemacie 3 [18]. Wśród zachodzących przemian przeważają reakcje epksydacji i hydroksylacji, stanowiące reakcje I fazy. Metabolity powstałe w I fazie zawierają czynne grupy funkcyjne reagujące z glukuronianami i siarczanami w II fazie. Powstałe produkty są łatwo wydalane z organizmu wraz z moczem [19, 20, 21]. W reakcjach I fazy tworzą się tlenki arenowe, chinony, fenolodiole, fenole, będące metabolitami przejściowymi, z których najważniejszym jest 7,8-diol-9,10-epoksybenzo[a]piren, o silnych właściwościach muta- i kancerogennych. Zidentyfikowano go w organach zwierząt poddawanych eksperymentowi narażania na B[a]P [19, 20, 21]. Metabolity benzo[a]pirenu wykazują bardzo silne powinowactwo do struktur wewnątrzkomórkowych i mogą uszkadzać DNA. W wyniku nieprawidłowej replikacji i błędnych procesów odnowy uszkodzonego DNA dochodzi do mutacji, a to sprzyja propagacji procesu rakotwórczego. Stwierdzono także, że wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne wnikają do wszystkich narządów, a ich zwartość we wszystkich organach jest niezależna od drogi wchłaniania. Narządy bogate w tkankę tłuszczową mogą kumulować WWA. Uwalniają się one z nich stopniowo, przez dłuższy okres czasu. Wydalane są one z organizmów przez mleko zarówno jako metabolity jak i WWA pierwotne [22]. 13

O W ydalanie z moczem EH OH OH MFO HO HO EH HO HO MFO OH O epoksy-dihydroksydiole tetra-ole OH Kwas glukuronowy wydalanie z moczem OH DNA HO OH OH addukt DNA Odnowa DNA Mutacja DNA Transformacja NOWOTWORY Eliminacja Naprawa tkanki OH OH OH HO OH HO EH EH EH OH dihydroksydiole HO OH OHHO OH HO HO HO HO OH fenolo diole region zatoki O O MFO 2 3 1 12 11 10 9 4 5 6 7 8 B[a]P region M region K O epoksydy HO fenole w pozycjach 1-,3-,6-,7- lub 9- W ydalanie z moczem 2 3 1 12 11 10 9 4 5 6 7 8 Chinony Estry glukuronowe i siarkowe wydalanie z moczem W ydalanie z moczem MFO kompleks enzymów o różnych funkcjach oksydacyjnych EH hydrolazy epoksydowe Schemat 3. Etapy przemian WWA, na przykładzie B[a]P, w organizmach żywych [19]. 14

2.4. Charakterystyka skażenia żywności WWA Główną przyczyną skażenie żywności WWA są zanieczyszczenia środowiskowe. Skażona woda, powietrze oraz gleba wpływają na zawartość WWA szczególnie w produktach pochodzenia roślinnego. Jak wcześniej zostało już wspomniane WWA adsorbują się na cząstkach pyłów, które osadzają się na liściach roślin i warzyw. Wnikają i kumulują się w określonych warstwach roślin, unikając tkanek z wysoką zawartością wody. Liczne badania wykazały także, że warzyw i owoce uprawiane w rejonach zurbanizowanych i uprzemysłowionych zawierają od 5 do 10 razy więcej WWA niż te uprawiane w rejonach czystych ekologicznie [23]. Występowanie wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w żywności jest spowodowane głównie jej obróbką. Do procesów obróbki i przetwarzania żywności, podczas których tworzą się WWA, zaliczamy [24]: - smażenie, - wędzenie, - grillowanie, - suszenie, - pieczenie, itp. Szczególnie intensywnie były badane procesy wędzenia i grillowania. Wykazano, że na zawartość WWA w produktach wędzonych i grillowanych ma wpływ wiele parametrów, takich jak [25]: - rodzaj użytego drewna, - temperatura wędzenia, - rodzaj wędzenie (wędzenie na zimno, wędzenie na gorąco, wędzenie za pomocą dymu wędzarniczego), - stosowanie mycia po wędzeniu, - używane przyprawy, - zawartość tłuszczu w wędzonym mięsie, - czas trwania procesu. Ważnym źródłem wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w diecie są oleje i tłuszcze roślinne. Używa się ich nie tylko do bezpośredniej konsumpcji, są one także składnikami różnych produktów i półproduktów spożywczych. Ich występowanie w olejach jest głównie uwarunkowane procedurą suszenia ziarna (szczególnie gazami grzewczymi). 15

Tabela 4. Zawartości oznaczanych WWA w różnych olejach roślinnych [26]. Próbka oleju B[a]A Ch B[b]F B[k]F B[a]P [µg/kg] [µg/kg] [µg/kg] [µg/kg] [µg/kg] Surowy palmowy 62,6 105,3 55,1 12,1 40,6 Rafinowany palmowy Rzepakowy tłoczony na zimno Oczyszczony rzepakowy ppw Ppw ppw ppw ppw 4,7 5,6 5,6 2,2 4,4 ppw 0,6 0,5 ppw ppw Oliwa 0,5 2,0 1,0 0,4 0,7 Słonecznikowy ppw 0,4 ppw ppw 0,3 Sojowy 0,6 2,1 0,9 0,6 1,0 Winogronowy 0,4 1,7 0,4 0,3 0,5 Lniany 0,6 0,9 0,6 ppw 0,5 Z dyni ppw 0,8 0,6 ppw 0,5 Arachidowy 5,1 5,2 4,0 1,6 3,1 Sezamowy 5,5 6,1 3,8 1,5 3,1 Tran ppw Ppw ppw ppw 0,1 ppw poniżej progu wykrywalności Analizując wyniki zawartości poszczególnych WWA w tabeli zauważamy, że oleje tłoczone na zimno zawierają znacznie więcej WWA od olejów poddanych procesowi rafinacji. Takie zabiegi technologiczne jak bielenie (dodatek węgla aktywnego) oraz rafinacja wyraźnie zmniejszają zawartość zanieczyszczeń, w tym WWA [27]. Obecnie przepisy prawne nie limitują dopuszczalnych zawartości poszczególnych WWA w żywności poza B[a]P, którego zawartość w olejach jadalnych nie może być wyższa niż 2 µg/kg, w wyrobach wędzonych 5 µg/kg, ostrygach 10 µg/kg natomiast w produktach dla dzieci 1 µg/kg. Regulacje europejskie limitują również zawartości B[a]P i B[a]A w dymach wędzarniczych, które nie mogą przekraczać odpowiednio 10 µg/kg dla B[a]P i 20 µg/kg dla B[a]A [28]. 16

2.5. Metody oznaczania WWA Większość metod oznaczania WWA dotyczy próbek środowiskowych (próbki wody, ścieków, gleby). Metody oznaczania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w matrycach żywnościowych, charakteryzują się wysokim stopniem trudności. Matryce żywnościowe są problematyczne z powodu tego, że lipofilne węglowodory przenikają do wnętrza komórek. By wyodrębnić frakcję WWA z matryc stosuje się hydrolizę w środowisku zasadowym, wielokrotne ekstrakcje ciecz-ciecz lub ciecz-ciało stałe. Metody te są pracochłonne, skomplikowane i kosztowne. Inną metodą wyodrębniania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych z matryc żywnościowych jest ekstrakcja płynem w stanie nadkrytycznym, lub ekstrakcja w podwyższonej temperaturze. Głównie stosuje się je do wyodrębnienia WWA z próbek o konsystencji stałej. Alternatywną metodą przygotowania próbek do analizy jest preparatywna chromatografia wykluczania sterycznego (SEC). Jest to metoda względnie szybka i prosta [26]. Rozdziały wyodrębnionych węglowodorów wykonuje się za pomocą chromatografii gazowej połączonej ze spektrometrem mas (GC/MS) lub przy zastosowaniu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Istotną zaletą GC/MS jest wysoka rozdzielczość, co jest bardzo korzystne przy rozdziale mieszanin oraz możliwość identyfikacji rozdzielonych związków,. Wadą natomiast trudności w analizie ciężkich (sześcio-, siedmiopierścieniowych) WWA (kolumna może ulegać rozkładowi). HPLC z detektorem fluorescencyjnym charakteryzuje się wprawdzie gorszą sprawnością rozdziału, ale niższym progiem wykrywalności (rzędu ułamków ppb) WWA. Analizę wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych za pomocą HPLC prowadzi się w układzie faz odwróconych (faza stacjonarna jest niepolarna). Ta technika chromatografii jest najlepsza do rozdziału mieszanin związków różniących się hydrofobowością. Fazę ruchomą stanowią zwykle acetonitryl i woda lub metanol i woda podawane w odpowiednim gradiencie lub izokratycznie. 17

2.6. Wpływ rodników hydroksylowych na benzo[a]piren Ważnym problemem związanym z ochroną środowiska jest usuwanie z niego związków toksycznych. W literaturze opisane są metody ich rozkładu oparte na ich utlenianiu ozonem, działaniem promieniowania UV czy ultradźwięków [31]. Ostatnio opisano również metody utleniania fenoli za pomocą rodników hydroksylowych. Rodniki te generowane są w reakcji Fentona [32, 33]: Fe 3+ - + H O = Fe + OH + OH. 2 + 2 2 Rodniki te utleniają badane próbki. Dotychczas metoda nie była wykorzystywana w celu dezaktywacji WWA. 18

3. CEL PRACY Celem pracy było opracowanie metody analizy benzo[a]pirenu i benzo[a]antracenu, (które powinny być oznaczane w żywności zgodnie z wytycznymi KN UE) oraz WWA z listy 15 WWA rekomendowanych do badań przez KN UE, których maksymalne stężenia w żywności podane zostaną w przyszłości, po opracowaniu odpowiednich metod analitycznych. Porównane zostaną dwie techniki analityczne: GC/MS i HPLC z detekcją fluorescencyjną. Integralną częścią pracy będzie opracowanie metody przygotowania próbki. Opracowane techniki analityczne zostaną praktycznie przetestowane w analizie wybranych WWA w olejach jadalnych. Zbadana zostanie następnie możliwość dezaktywacji benzo[a]pirenu przez rodniki hydroksylowe. 19

4. CZEŚĆ EKSPERYMENTALNA 4.1. Aparatura 4.1.1. Preparatywny chromatograf wykluczania sterycznego (SEC) Chromatograf preparatywny (Dionex, Germering, Niemcy) składał się z: - interfejsu UCI-100, - autosamplera ASI-100, - gradientowej pompy, zawierającej degazer, P-580, - kolumny, wraz z prekolumną, do wykluczania sterycznego PLgel (5µm, 50 Å, 600 x 7,8 mm I.D; złoże-ps/dvb) (Polymer Laboratories, Amherst, Stany Zjednoczone), - detektora spektrofotometrycznego z matrycą diodową UVD-340S, - kolektora frakcji Foxy Jr.fraction collector (Isco, Lincoln, Stany Zjednoczone), - programu do naboru i obróbki danych Chromleon v. 6,20 (Dionex-Softron, Germering, Niemcy) zainstalowanym komputerze IBM-PC kompatybilnym 4.1.2. Chromatograf gazowy ze spektrometrem mas (GC/MS) I Część pomiarów GC/MS została wykonana na aparacie GC-17A z kwadrupolowym spektrometrem mas MS - QP500 (Schimadzu, Tokio, Japonia). Kolumna chromatograficzna: BPX-5, 30m x 0,25 mm I.D x 0,25 μm FT (Phenomenex, Torrance, CA, USA) o składzie złoża: 5% polisarylenu, 95% polidimetylosiloksanu. Gaz nośny hel o czystości 99,99999%, przepływ 0,7 ml/min, temperatura dozownika 180 o C, temperatura interfejsu 260 o C, programowalna temperatura kolumny: 80 o C - 3 min, izoterma końcowa: 300 o C - 7 min, zakres m/z -110 310. 4.1.3. Chromatograf gazowy ze spektrometrem mas (GC/MS) II Część pomiarów wykonanych zostało na, znajdującym się na terenie Instytutu Przemysłu Mięsnego i Tłuszczowego, aparacie GC/MS TSQ500 połączonym z spektrometrem mas 20

17A/QP5050 (Finnigan Thermo Quest, Waltham, MA, USA) z pułapką jonową, wyposażonym w kolumnę BPX-35, 30m x 0,025mm I.D x 0,25 μm FT (Phenomenex, Torrance, CA, USA). Jako gaz nośny został użyty hel o czystości 99,99999% i przepływie 0,8 ml/min. Temperatura dozownika wynosiła 200 o C, programowalna temperatura kolumny: izoterma 80 o C 2 min, przyrost 5 o C/min, izoterma końcowa 320 o C - 15 min, temperatura linii transferowej 310 o C, zakres m/z -110 310. 4.3.2. Analityczny wysokosprawny chromatograf cieczowy (HPLC) Pomiary i analizy chromatograficzne HPLC wykonywane były na aparaturze firmy Knauer (Berlin, Niemcy) składającej się z: pompy dwutłokowej Smartline 1000 (zakres przepływu 0,001-50ml/min). Pompa przystosowana jest do pracy w układzie czterokanałowego gradientu niskociśnieniowego, uniwersalnego interfejsu Smartline Manager 500, zawierającego degazer z opatentowaną technologią Teflon, mieszadła magnetycznego, kolumny analitycznej Hypresil (5 μm, 250x3 mm I.D), termostatu Smartline 400 (zakres temperatur 5 85 ºC), dozownika o objętość pętli - 20µl, detektora spektrofotometrycznego z matrycą diodową (DAD) Smartline 2600, zakres pracy lampy 190 510 nm, detektora fluorescyjnego (Schimadzu, Tokio, Japonia), programu do naboru i obróbki danych Eurochrom 2000, zainstalowanego na komputerze kompatybilnym z IBM PC. 21

Rysunek 2. Schemat zestawu HPLC: 1 - butle ze składnikami fazy ruchomej, 2 - interfejs, 3 - pompa, 4 - mieszadło, 5 - dozownik, 6 - termostat z kolumną, 7 - detektor spektrofotometryczny, 8 - detektor fluorescencyjny, 9 - butla na ścieki i 10 - komputer. 4.2. Odczynniki W pracy stosowałam następujące odczynniki: - acetonitryl, czysty do HPLC, 99,9 % (Sigma Aldrich, Niemcy), - metanol, czysty do HPLC, 99,9% (Sigma Aldricht, Niemcy), - dichlorometan, czysty do HPLC (Labscan, Irlandia), - certyfikowany roztwór cyklopenta[c,d]pirenu (50 ng/µl w acetonitrylu); dibenzo[a,i]pirenu (30 ng/µl w acetonitrylu); dibenzo[a,h]pirenu (30 ng/µl w acetonitrylu); dibenzo[a,l]pirenu (30 ng/µl w acetonitrylu); dibenzo[a,e]pirenu (30 ng/µl w acetonitrylu); 5-metylochryzenu (50 ng/µl w acetonitrylu); benzo[j]fluorantenu (10 ng/µl w acetonitrylu); benzo[a]pirenu (10 ng/µl w acetonitrylu), dibenzo[a,h]antracenu (30 ng/µl w acetonitrylu), indeno [1,2,3-cd]pirenu (10 ng/µl w acetonitrylu), benzo[ghi]perylenu (10 ng/µl w acetonitrylu), benzo[k]fluorantenu (30 ng/µl w acetonitrylu), benzo[b]fluorantenu (10 ng/µl w acetonitrylu), benzo[a]antracenu (10 ng/µl w acetonitrylu), chryzenu (10 ng/µl w acetonitrylu), (Ehrenstorfer, Augsburg, Niemcy), - certyfikowany roztwór węglowodorów aromatycznych SRM 1491 (NIST, Gaithersburg, USA), 22

Tabela 5. Stężenia poszczególnych WWA w SRM 1491. L.p. WWA Stężenie [µg] 1 Naftalen 10,30±0,10 2 Acenaften 10,89±0,15 3 Acenaftylen 10,40±0,07 4 Fluoren 10,87±0,08 5 Feantren 10,48±0,07 6 Antracen 11,69±0,06 7 Fluorantenu 8,84±0,06 8 Piren 8,81±0,08 9 Benzo[a]antracen 5,37±0,04 10 Chryzen 10,50±0,06 11 Benzo[b]fluoranten 7,85±0,05 12 Benzo[k]fluoranten 8,33±0,12 13 Benzo[a]piren 10,14±0,09 14 Indeno[1,2,3-cd]piren 9,40±0,07 15 Dibenzo[a,h]antracen 7,74±0,18 16 Benzo[ghi]perylen 7,90±0,13 17 1-Metylonaftalen 12,4±0,5 18 Bifenyl 10,46±0,04 19 2,6-Dimetylonaftalen 10,8±0,4 20 2,3,5-Trimetylonftalen 9,9±0,4 21 1-Meteylofenantren 10,4±0,3 22 Perylen 10,65±0,06 23 2-Metylonaftalen 11,3±0,01 24 Benzo[e]piren 8,40±0,04 - certyfikowany roztwór benzo[b]chryzenu (10 ng/µl w acetonitrylu) (Ehrenstorfer, Augsburg, Niemcy), - materiał referencyjny: SRM 2978 (liofilizowane małże), CRM 458 (tłuszcz kokosowy) (NIST, Gaithersburg, USA), 23

- wtórne materiały odniesienia FAPAS oliwy: 0618, 0621,0615 (Central Science Laboratory, York, UK), - próbki olejów jadalnych (rzepakowy rafinowany, słonecznikowy, oliwa z oliwek) zakupione zostały w najbliższym sklepie, - butlę ze sprężonym azotem o czystości 5,0 (99,999%), - bufor fosforowy w tabletkach PBS (0,02M) (Phosphate Buffered Saline), - kwas tereftalowy (TFA) (10mM) (Sigma-Aldrich, Niemcy), - 3% wodę utlenioną (Infarm, Polska), - siarczan (VI) żelaza (II) (10 mm) (Sigma-Aldrich, Niemcy). 4.3. Procedura analityczna 4.3.1. Przygotowanie roztworów wzorcowych Standardowa mieszanina 23 WWA z listy US-EPA i UE-SCF została przygotowana przez zrobienie naważek poszczególnych WWA, a następnie ich rozpuszczenie w acetonitrylu. Jako standard wewnętrzny stosowany był B[b]Ch. Roztwory przechowywane były w temp. 7-8 C w ciemnym pomieszczeniu. Zachowywały swoją ważność przez okres ok. 3 tygodni. 4.3.2. Przygotowanie próbek olei i wyodrębnienie frakcji WWA z matrycy tłuszczowej Próbki olei jadalnych zostały zakupione w sklepach spożywczych i przygotowane do analizy GC/MS i HPLC za pomocą chromatografii wykluczania sterycznego (SEC) w Instytucie Przemysłu Mięsnego i Tłuszczowego w Warszawie. Do próbek olei o masie 1g dodawany był B[b]Ch (100µl, 50µg/L roztworu), następnie całość została rozpuszczona w dichlorometanie do objętości końcowej 5 ml. Oddzielenie części tłuszczowej próbki od frakcji węglowodorów wykonywano na preparatywnym chromatografie cieczowym połączonym z detektorem UV-VIS z matrycą diodową DAD. Rozdział następował na kolumnie do chromatografii preparatywnej Plgel column (5 µm, 50 Å, 600 x 7,8 mm), która była uprzednio stabilizowana jedną godzinę. Frakcję WWA została odparowana na łaźni wodnej o temp. 40 o C w atmosferze azotu i 24

rozpuszczona w acetonitrylu (200 µl), a następnie poddana analizie na GC/MS i HPLC. Warunki pracy preparatywnego chromatografu cieczowego: - faza ruchoma - dichlorometan (temp. pokojowa), - szybkość przepływu fazy ruchomej - 1 ml/min, - objętość wstrzykiwanej próbki - 400 µl, - długość fali detektora - 254 nm, - czas zbierania frakcji WWA - 18-24 min. 4.3.3. Warunki analizy za pomocą chromatografii cieczowej Rozdział WWA na HPLC był wykonywany w układzie faz odwróconych (na niepolarnej kolumnie). Warunki rozdziału zostały zoptymalizowane eksperymentalnie w oparciu o dostępne dane literaturowe. Warunki pracy analitycznego chromatografu cieczowego: - Faza ruchoma: - woda acetonitryl lub woda metanol o gradiencie: Czas [min] 0 20 35 40 Woda [%] 50 0 0 50 Acetonitryl lub metanol [%] 50 100 100 50 - szybkość przepływu fazy ruchomej - 0,8 ml/min, - objętość próbki - 20 µl, - pomiary były wykonywane w różnych temperaturach kolumny: 5, 10, 13, 15, 18 i 25 C, - długości fal wzbudzenia (EX) i emisji (EM) detektora fluorescencyjnego: Czas [min] Węglowodory Aromatyczne λ ex [nm] λ em [nm ] 0 Nieanalizowane niskocząsteczkowe WWA 248 375 13,9 B[a]A, Ch 270 385 19,0 B[b]F 256 446 20,8 B[k]F, B[a]P, D[h]A 295 410 25,7 I[c]P 274 507 27,0 B[a]Ch 295 410 25

(1) gdzie: Stężenie, c i, węglowodoru w próbce obliczano ze wzoru (1): c i = Ssc S c b b S Ab cstv A m s S b pole powierzchni węglowodoru w materiale certyfikowanym (SRM 1491), S S pole powierzchni benzo[b]chryzenu dodanego do materiału certyfikowanego (SRM 1491), c b stężenie węglowodoru w materiale certyfikowanym (SRM 1491) [µg/kg], c s stężenie benzo[b]chryzenu dodanego do materiału certyfikowanego (SRM 1491) [µg/kg], A b pole powierzchni badanego węglowodoru w próbce, A s - pole powierzchni benzo[b]chryzenu dodanego do próbki, c st stężenie benzo[b]chryzenu dodanego do próbki, V st objętość roztworu benzo[b]chryzenu dodanego do próbki, m masa próbki [kg]. st 4.3.4. Przeprowadzanie reakcji B[a]P z rodnikami hydroksylowymi W pracy zbadano możliwość usuwania benzo[a]piranu ze środowiska za pomocą rodników hydroksylowych. Rodniki te generowane były w reakcji Fentona. Do 500 µl buforu fosforanowego ph = 7,4 o stężeniu c = 0,02M, dodano 100 µl, Fe (II) o stężeniu 10 mm, 100 µl, 3% H 2 O 2, 50 µl 10ng/µl B[a]P i uzupełniono wodą destylowaną do objętości 1000 µl. Tak przygotowane próbki analizowano chromatograficznie. Próbki wstrzykiwano na kolumnę i czynność tę powtarzano po upływie 2, 20 i 50 minut oraz 24 godzin. Przygotowanie buforu fosforowego (ph=7,4). Rozpuszczono: 27,598 g NaH 2 PO 4, 34,838 g K 2 HPO 4, dopełniono wodą destylowaną do objętości 1 litra. 4.3.5. Statystyczna analiza danych Pomiary były wykonywane trzykrotnie. Wynikiem była średnia odniesiona do kontrolnej próbki ślepej, niezawierającej oznaczanego węglowodoru. Wyniki były porównywane stosując t- test Studenta dla zmiennych niezależnych przy p < 0,05. 26

5. WYNIKI I DYSKUSJA 5.1. Przygotowanie próbki chromatografia preparatywna Próbki były przygotowywane (usuwanie matrycy tłuszczowej i zatężanie) przy użyciu preparatywnej chromatografii wykluczania sterycznego. Metoda ta wcześniej została opracowana w Instytucie Przemysłu Mięsnego i Tłuszczowego [26]. Okazało się, że może być ona zastosowana do bardzo różnorodnych próbek. W literaturze opisane zostały metody przygotowania próbki oparte na kilkukrotnie powtarzanych ekstrakcjach ciecz-ciecz i/lub ekstrakcjach na ciele stałym. Te trudności spowodowane są dużymi podobieństwami fizykochemicznymi tłuszczy i WWA. Należy zaznaczyć, że w tym przypadku bardzo istotne jest całkowite usunięcie lipidów gdyż uniemożliwiają one rozdział na fazach odwróconych (lipidy nie są rozpuszczalne w rozpuszczalnikach polarnych) oraz wpływają na przesunięcie fluorescencyjnych pasm wzbudzenia/emisji. Olbrzymią zaletą zastosowanej metody jest możliwość przeprowadzenia oczyszczenia próbki w jednym kroku. Przykładowy chromatogram SEC oliwy z oliwek pokazano na Rysunku 3. Okazało się, że w przypadku oliwy zebrany eluat zawierał wprawdzie małe ilości tłuszczy, ale były one rozpuszczalne w acetonitrylu, stosowanym jako faza ruchoma. Przesunięcie czasu zbierania eluatu powodowało niecałkowite zbieranie WWA. Rysunek 3. Chromatogram SEC oliwy z oliwek. Warunki chromatograficzne: Plgel column - 5 μm, 50 Å, 600x7,8 mm I.D.; faza ruchoma dichlorometan, detektor spektrofotometryczny, długość fali - 254 nm; temperatura pokojowa, szybkość przepływu 1 ml/min, objętość próbki 400 μl. 27

5.2. Analizy chromatograficzne GC/MS Rysunek 4. Chromatogram GC/MS (m/z=128, 140, 152,154, 166, 178, 192, 202, 226, 228, 242, 252, 276, 278) 24 WWA SRM 1491 (1 - naftalen, 2-2-metylonaftalen, 3-1-metylonaftalen, 4 - bifenyl, 5-2,6-dimetylonaftalen, 6 - acenaftylen, 7 - acenaften, 8-2,3,5-trimetylonaftalen, 9 - fluoren, 10 - fenantren, 11 - antracen, 12-1-metylofenantren, 13 - fluoranten, 14 - piren, 15 - benzo[a]antracen, 16 - chryzen, 17 - benzo[b]fluoranten, 18 - benzo[k]fluoranten, 19 - benzo[e]piren, 20 - benzo[a]piren, 21 - perylen, 22 - indeno[1,2,3-cd]piren, 23 - dibenzo[a,h]antracen, 24 - benzo[ghi]perylen). Warunki chromatograficzne zostały przedstawione w opisie aparatury (4.1.2.) 28

Rysunek 5. Chromatogram GC/MS (m/z=128, 152, 166, 178, 202, 226, 228, 242, 252, 276, 278, 302) 23 WWA z list US-EPA i KN UE (1 - naftalen, 2 - acenaftalen, 3 - acenaftylen, 4 - fenantren, 5 - fluoren, 6 - antracen, 7 - fluoranten, 8 - piren, 9 - cyklopenta[cd]piren, 10 - benzo[a]antracen, 11 - chryzen, 12-5-metylochryzen, 13 - benzo[b]fluoranten, 14 - benzo[j]fluoranten, 15 - benzo[k]fluoranten, 16 - benzo[a]piren, 17 - indeno[1,2,3-cd]piren, 18 - benzo[ghi]perylen, 19 - dibenzo[a,h]antracen, 20 - dibenzo[a,l]piren, 21 - dibenzo[a,e]piren, 22 - dibenzo[a,i]piren, 23 - dibenzo[a,h]piren). Warunki chromatograficzne zostały przedstawione w opisie aparatury (4.1.3.). Rysunek 6. Chromatogram GC/MS (m/z=226, 242, 252, 302) 7 WWA z listy KN UE (9 - cyklopenta[cd]piren, 12-5-metylochryzen, 14 - benzo[j]fluoranten, 20 -dibenzo[a,l]piren, 21 - dibenzo[a,e]piren, 22 - dibenzo[a,i]piren, 23 - dibenzo[a,h]piren). Warunki chromatograficzne zostały przedstawione w opisie aparatury (4.1.3.) 29

W roku 1981 Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska (EPA) ustaliła listę 16 wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych, które zostały wtedy uznane za szczególnie toksyczne. Dopiero w roku 2005 Komitet Naukowy Unii Europejskiej (KN UE) przedstawił zestawienie 15 WWA, które powinny być oznaczane zarówno w żywności jak i w środowisku. Spowodowało to konieczność udoskonalania i opracowywania nowych metod ich oznaczania. Na Rysunku 4 przedstawiono chromatogram SRM 1491 WWA. Został on zarejestrowany dla stosunków mas do ładunków (m/z) podanych pod rysunkami. Rysunek 5 przedstawia rozdział 23 WWA rekomendowanych do badań z list EPA i KN UE. Rysunek 6 to chromatogram 7 WWA, które znajdują się na liście KN UE natomiast nie rekomenduje ich do badań EPA, a prawdopodobnie są one silnie kancerogenne. Identyfikację rozdzielonych WWA przeprowadziłam w oparciu o dostępne dane literaturowe oraz porównania czasów retencji indywidualnych standardów WWA wstrzykiwanych oddzielnie. W oparciu o analizę posiadanych standardów WWA stwierdzono, że widma masowe wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych charakteryzują się intensywnym i stabilnym jonem molekularnym (jon podstawowy) oraz wiązką jonów połówkowych o podwójnym ładunku (m/2z=1/2m/z), co potwierdza liczna literatura dotycząca identyfikacji WWA techniką GC/MS [29, 30]. Okazało się, że uzyskane progi wykrywalności (rzędu ppm) były za wysokie, aby można tą techniką (mimo kilkakrotnego zatężania próbki) oznaczać WWA w próbkach żywności. Szczególnie wysokie progi wykrywalności były obserwowane dla dibenzo pochodnych pirenu. Wymywane one były z kolumny na końcu chromatogramu, tzn. przy wysokiej temperaturze. W tych warunkach dochodziło do rozkładu fazy stacjonarnej kolumny. Retencją WWA jest proporcjonalna do ich masy cząsteczkowej, a tak naprawdę do ich temperatur wrzenia. Okazało się, że znaczne obniżenie progu wykrywalności osiągnięto przy rejestracji chromatogramu przy określonej wartości m/z w stosunku do chromatogramu rejestrującemu całkowity prąd jonowy (TIC). Pomiary wykonywane były na dwóch zestawach GC/MS, jak to zostało opisane w części eksperymentalnej. Oba przyrządy różniły się analizatorami. W jednym z nich zastosowana była pułapka jonowa, w drugim analizator kwadrupolowy. Niższy próg wykrywalności ok. rzędu wielkości otrzymano na spektrometrze z pułapką jonową. 30

5.3. Analizy chromatograficzne HPLC Rysunek 7. Chromatogram HPLC 16 WWA z listy EPA. SRM 1491 (1 nie analizowane niskocząsteczkowe WWA, 2 benzo[a]antracen, 3 chryzen, 4 benzo[b]fluorantenu, 5 benzo[k]fluorantenu, 6 benzo[a]piren, 7 indeno[1,2,3-cd]piren, 8 dibenzo[a,h]antracen, 9 benzo[ghi]perylen, i 10 benzo[b]chryzen).warunki chromatograficzne: kolumna Hypersil (5 μm, 250x3 mm I.D.), faza ruchoma : gradient acetonitrylu wody (zgodnie z tabelą podaną w warunkach analizy za pomocą chromatografii cieczowej), detektor fluorescencyjny (długości fal wzbudzenia i emisji podane w tabeli w warunkach analizy za pomocą chromatografii cieczowej), temperatura - 25 ºC, przepływ 0,8ml/min, objętość nastrzyku - 20 μl. Ponieważ technika GC/MS charakteryzowała się zbyt wysokim progiem wykrywalności, aby można ją zastosować do oznaczeń WWA w żywności, dlatego postanowiłam sprawdzić możliwość zastosowania do tego celu wysokosprawną chromatografię cieczową. Z danych literaturowych [26] wynika, że ich rozdział jest możliwy w układzie faz odwróconych. Chromatogram 16 WWA z listy EPA (SRM 1491) został przedstawiony na Rysunku 7. Warunki chromatograficzne (gradient elucji i parametry detektora fluorescyjnego) zostały oparte o dane literaturowe [26]. Z rysunku tego wynika, że uzyskano dobry rozdział 8 tzw. ciężkich węglowodorów, o prawdopodobnych właściwościach kancerogennych. Lżejsze węglowodory były nierozdzielne w tej technice. Jednakże są one mniej interesujące z analitycznego punktu widzenia, gdyż obecnie uważa się je za stosunkowo mało toksyczne. Ostatnim wymywanym związkiem był B[b]Ch stosowany jako wzorzec wewnętrzny, zgodnie z równaniem (1). Metoda wzorca wewnętrznego daje najbardziej wiarygodne wyniki, dlatego jest najbardziej popularną metodą analizy ilościowej w chromatografii cieczowej i gazowej. Jeśli tok 31

analizy obejmuje szereg etapów wstępnych, na które składają się wielokrotne ekstrakcje oraz oczyszczanie, wzorzec dodaje się na początku procesu analitycznego. Minimalizuje się w ten sposób straty analitów, które mogą wystąpić na każdym etapie analizy. Zazwyczaj stosuje się wzorzec jak najbardziej zbliżony budową strukturalną do związków znajdujących się w analizowanej próbce. Wzorzec wewnętrzny nie jest jednym z analizowanych związków. 5.4. Oznaczanie WWA w próbkach olejów jadalnych WWA można oznaczać za pomocą najczęściej stosowanego w HPLC detektora - fotometrycznego. Jednakże niższe progi wykrywalności uzyskiwane są na detektorze fluorescencyjnym. Dla B[a]A i B[a]P wynosiły one odpowiednio 0,1 i 0,2 μg/kg są, więc znacznie niższe niż maksymalne dopuszczalne stężenia w żywności [28]. Ich stężenia w olejach jadalnych zostały przedstawione w Tabeli 6. Tabela 6. Stężenie B[a]A i B[a]P [µg/kg] w próbkach olejów jadalnych Próbka oleju B[a]A [µg/kg] B[a]P [µg/kg] Rzepakowy ppw ppw Oliwa 0,5 0,7 Słonecznikowy ppw 0,3 ppw poniżej progu wykrywalności 32

Tabela 7. Porównanie wartości B[a]P i B[a]A oznaczonych w próbkach olejów z wartościami rekomendowanymi przez UE. Parametr Wartości wymagane Wartości wyznaczone Odniesienie prawne Granica wykrywalności < 0,3 µg/kg B[a]P 0,1 µg/kg B[a]A 0,2 µg/kg Zarządenie 2005/10/EC Granica oznaczalności < 0,9 µg/kg B[a]P 0,3 µg/kg B[a]A 0,5 µg/kg Zarządenie 2005/10/EC Odzysk 50 120% B[a]P 93 106% Zarządenie 2005/10/EC B[a]A 94 104% Dopuszczalna zawartość B[a]P w olejach i tłuszczach 2 µg/kg D L = 0,1 µg/kg Zarządzenie 208/2005/EC Dopuszczalna zawartość B[a]A w dymach wędzarniczych Testy statystyczne wartości odstających 10 µg/kg D L = 0,3 µg/kg Zarządzenie 2065/2003/EC Test: Cochrana, Grubasa i Mandela Zweryfikowano ISO 5725 Krzywe kalibracyjne charakteryzowały się dobrą liniowością dla wszystkich WWA w zakresie stężeń 0,1 100 µg/kg. Precyzję metody wyznaczono poprzez sześciokrotne, w ciągu jednego dnia oznaczanie mieszaniny związków i wyznaczenie względnego odchylenia standardowego (RSD, n = 6). RSD dla 6 kolejnych dni nie przekraczał 12%. Uzyskane wartości zawierały się w granicach 0,5 to 5%. Uzyskane wyniki umieszczono w tabelach danych programu ProWL, w którym serie pomiarowe tworzą poszczególne dni wykonywania oznaczeń. W programie ProWL uzupełniono dane z certyfikatów. Wartości odzysku od 80 do 109% dla próbek wzmocnionych dodatkiem wzorców i materiałów odniesienia potwierdzają liniowość stosowanej metody. Próg wykrywalności, oznaczalności i odzysk dla benzo[a]pirenu wynosiły odpowiednio 0,1 µg/kg, 0,3 µg/kg, 93 106%, a dla benzo[a]antracenu 0,2 µg/kg, 0,5 µg/kg, 94 104%. Próg wykrywalności (< 0,3 µg/kg), próg oznaczalności (< 0,9 µg/kg) i wartość odzysku (50 120 %) są zgodne z wytycznymi dyrektywy UE 2005/10 (02, 04, 2005). 33

5.5. Wpływ temperatury na rozdział WWA metodą HPLC Ponieważ okazało się, że metoda GC/MS charakteryzowała się zbyt wysokim progiem wykrywalności, dlatego dalsze pomiary przeprowadzałam z zastosowaniem HPLC w układzie faz odwróconych z detekcją fluorescencyją. W tym przypadku progi wykrywalności były wystarczające (poniżej ppb) do celów analitycznych. Okazało się jednakże, że nie mogłam uzyskać rozdziału B[j]F i 5MCh poprzez zmianę składu i szybkości przepływu fazy ruchomej. Rozdział chromatograficzny następuje wtedy, gdy α > 1. Współczynnik selektywności jest wielkością termodynamiczną, co wynika ze wzoru (2). (2) -RTlnα = Δ(ΔG). Wynika z niego, że zmniejszenie temperatury zwiększa selektywność rozdziału. Tabela 8. Czasy retencji 5-metylenochryzenu (5MCh) i benzo[j]fluorantenu (B[j]F) i wyliczone z nich współczynniki rozdziału (Rs) i selektywności (α). Warunki chromatograficzne: kolumna Hypersil, 5µm, 250x3mm I.D; eluent - gradient acetonitrylu i wody (zgodnie z tabelą podaną w warunkach analizy za pomocą chromatografii cieczowej); przepływ - 0,8 ml/min; objętość wstrzykiwanej próbki - 20µl; detektor spektrofotometryczny, długość fali 254 nm.. T [ C] t R [min] 5MCh t R [min] B[j]F R S α 5 26,70 27,62 2,10 1,038 8 27,17 27,82 2,25 1,026 13 26,15 26,54 1,49 1,016 18 25,37 26,61 1,12 1,010 23 24,47 24,56 0,42 1,004 25 23,90 23,90 0,00 1,000 34

Tabela 9. Czasy retencji 5-metylenochryzenu (5MCh) i benzo[j]fluorantenu (B[j]F) i wyliczone z nich współczynniki rozdziału (Rs) i selektywności (α). Warunki chromatograficzne: kolumna Hypersil, 5µm, 250x3mm I.D; eluent - metanol; przepływ - 0,8 ml/min; objętość wstrzykiwanej próbki - 20µl; detektor spektrofotometryczny, długość fali 254 nm. T [ C] t R [min] 5MCh t R [min] B[j]F R S α 8 11,36 12,06 1,51 1,080 10 10,40 10,89 1,20 1,061 15 9,79 10,10 0,96 1,040 18 9,40 9,54 0,45 1,020 23 9,00 9,00 0,00 1,000 Rysunek 8. Zależność czasu retencji (t R ) od temperatury (T) dla 5-metylenochryzenu (5MCh) i benzo[j]fluorantenu (B[j]F). Warunki chromatograficzne: kolumna Hypersil, 5µm, 250x3mm I.D; eluent - gradient acetonitrylu i wody (zgodnie z tabelą podaną w warunkach analizy za pomocą chromatografii cieczowej); przepływ - 0,8 ml/min; objętość wstrzykiwanej próbki - 20µl; detektor spektrofotometryczny, długość fali 254 nm. 35

Rysunek 9. Zależność czasu retencji (t R ) od temperatury (T) dla 5-metylenochryzenu (5MCh) i benzo[j]fluorantenu (B[j]F). Warunki chromatograficzne: kolumna Hypersil, 5µm, 250x3mm I.D; eluent - metanol; przepływ - 0,8 ml/min; objętość wstrzykiwanej próbki - 20µl; detektor spektrofotometryczny, długość fali 254 nm. Rysunek10. Zależność selektywności (α) i współczynnika rozdziału (R S ) 5-metylenochryzenu (5MCh) i benzo[j]fluorantenu (B[j]F) od temperatury. Warunki chromatograficzne jak na Rysunku 8. 36

1,15 1,60 1,20 1,10 RS α 0,80 1,05 0,40 1,00 8 10 12 14 16 18 20 22 0,00 T [ o C] Rysunek11. Zależność selektywności (α) i współczynnika rozdziału (R S ) 5-metylenochryzenu (5MCh) i benzo[j]fluorantenu (B[j]F) od temperatury. Warunki chromatograficzne jak na Rysunku 9. 37

Rysunek 12. Chromatogramy HPLC 2 WWA zarejestrowane w różnych temperaturach (1 5- metylochryzen, 2 benzo[j]fluoranten). Warunki chromatograficzne jak na Rysunku 8. Rysunek 13. Chromatogramy HPLC 2 WWA zarejestrowane w różnych temperaturach (1 5- metylochryzen, 2 benzo[j]fluoranten).warunki chromatograficzne jak na Rysunku 9. 38

Rysunek 14. Chromatogramy HPLC 2 WWA zarejestrowane w różnych temperaturach (1 5- metylochryzen, 2 benzo[j]fluoranten).warunki chromatograficzne: kolumna Hypersil, 5µm, 250x3mm I.D; eluent - gradient metanolu i wody (zgodnie z tabelą podaną w warunkach analizy za pomocą chromatografii cieczowej); przepływ - 0,8ml/min; objętość wstrzykiwanej próbki - 20µl; detektor spektrofotometryczny, długość fali - 254 nm. Z Rysunków 12, 13 i 14 otrzymanych odpowiednio dla układów woda/acetonitryl, metanol i woda/metanol wynika, że obniżenie temperatury zwiększało retencję. Ten wzrost był różny dla obu badanych związków. Spowodowało to wzrost selektywności rozdziału, a więc i współczynnika rozdziału (Rysunek 10 i 11). W konsekwencji umożliwiło to rozdział tych związków, jak to zostało przedstawione na Rysunku 12 i 13. Krótsze czasy retencji otrzymano dla fazy ruchomej acetonitryl/woda niż metanol/woda, co wiąże się z mniejszą polarnością (mniejszymi wartościami współczynnika Hildebranda) acetonitrylu. 39

Rysunek 15. Trójwymiarowy chromatogram 5MCh (1) i B[j]F (2) zarejestrowany za pomocą detektora z matrycą diodową. Detektor z matrycą diodową pozwala dodatkowo na uzyskiwanie widma badanych związków. Na Rysunku 15 został przedstawiony chromatogram zarejestrowany za pomocą detektora z matrycą diodową. Widać na nim, że przy 254 nm (zwykle stosowanych do oznaczania związków organicznych) pik chromatograficzny 5MCh zlewa się ze znacznie wyższym pikiem B[j]F. Natomiast przy 273 nm pik chromatograficzny 5MCh jest wyższy niż B[j]F i nadaje się do oznaczeń ilościowych. 5.6. Walidacja metody W procesie walidacji metody wykorzystano dwa materiały odniesienia o różnych zawartościach benzo[a]piranu i benzo[a]antracenu (liofilizowane małże SRM 2978, tłuszcz kokosowy CRM 458), oraz trzy wtórne materiały odniesienia FAPAS 0615, 0618 i 0621. W zastosowanych materiałach B[a]P występował w 5 różnych stężeniach (poziomach), a B[a]A w 3. Dla B[a]P próbki do analizy przygotowano w trzech seriach od 2 do 5 powtórzeń, natomiast dla B[a]A przygotowano 4 serie od 2 do 5 powtórzeń. Uzyskane wyniki umieszczono w tabelach danych programu ProWL, w którym serie pomiarowe tworzą poszczególne dni wykonywania oznaczeń. W programie ProWL uzupełniono dane z certyfikatów. 40