ĆWIZENIE 6 ANALIZA JAKŚIWA UKRÓW IDENTYFIKAJA NIEZNANEG UKRU el ćwiczenia: zęść pierwsza: Zapoznanie się z charakterystycznymi barwnymi reakcjami węglowodanów. zęść druga: Identyfikacja cukru ukry analizowane podczas ćwiczenia: glukoza, fruktoza, arabinoza, laktoza, maltoza, sacharoza, skrobia. ZĘŚĆ PIERWSZA REAKJE ARAKTERYSTYZNE WĘGLWDANÓW Działanie kwasów na cukry grzewanie monosacharydów ze stężonymi kwasami (siarkowym, solnym) powoduje ich odwodnienie. Pentozy przekształcają się w furfural, a heksozy w 5hydroksymetylenofurfural. Najłatwiej odwodnieniu ulegają pentozy, a wśród heksoz ketozy. Dwucukry reagują wolniej niż monosacharydy, a szybciej niż wielocukry. Powstające heterocykliczne aldehydy reagując z różnymi fenolami (naftolem, tymolem, rezorcyną) tworzą barwne produkty. Reakcje ze stężonymi kwasami należą do ogólnych reakcji na węglowodany, ponieważ umożliwiają wykrycie cukru, natomiast nie pozwalają na jego identyfikację. 3 Pentoza Furfural 3 Ćw. 1 Próba Molischa eksoza 5hydroksymetylenofurfural ukry pod wpływem stężonego kwasu siarkowego(vi) ulegają odwodnieniu, a następnie reagują z fenolami tworząc barwne produkty. W przypadku reakcji Molischa wynikiem kondensacji z αnaftolem jest produkt o barwie fioletowej, która zmienia się w ciemnopurpurową. Jest to mało specyficzna reakcja, ponieważ dodatni wynik reakcji otrzymujemy także w obecności aldehydów, acetonu i kwasów mrówkowego, szczawiowego lub cytrynowego. Wykonanie: Do 1 ml badanego roztworu dodać 3 krople świeżo sporządzonego 0% roztworu etanolowego naftolu. Po dokładnym zmieszaniu, bardzo ostrożnie po ściankach skośnie ustawionej probówki wprowadzić około 1 ml stężonego S 4, tak aby nie zmieszać obydwu roztworów. Powstający na granicy warstw czerwonofioletowy pierścień świadczy o obecności cukru. Uwaga! Wystąpienie zielonego zabarwienia może pochodzić od zanieczyszczeń odczynników i nie jest swoiste dla tej reakcji. 1
Przykłady produktów kondensacji fenoli z furfuralem lub 5hydroksymetylenofurfuralem Fenole i ich pochodne Pochodna cukru lub ( ) Produkty kondensacji Próba Molischa naftol czerwonofioletowy ( ) 3 3 3 3 3 tymol 3 3 ( ) 3 3 różowy antron zielononiebieski Próba Tollensa floroglucyna ( ) fiołkowowiśniowy Próba Biala orcyna 3 3 3 zielononiebieski Próba Seliwanowa rezorcyna czerwonowiśniowy ( ) Ćw. Próba Seliwanowa (wykrywanie ketoz) Reakcja Seliwanowa pozwala na odróżnienie ketoz od aldoz i opiera się na różnej szybkości odwadniania tych cukrów. Podczas 1 minutowego ogrzewania we wrzącej łaźni wodnej roztworów cukrów z 1% l ketozy ulegają odwodnieniu i powstaje hydroksymetylenofurfural. W tych warunkach czasowośrodowiskowych aldozy nie ulegają odwodnieniu. Próba ta daje również wynik pozytywny dla wielocukrów zawierających ketozy. Wykonanie: Do 1 ml badanego roztworu dodać 1 ml rozcieńczonego l i 3 krople etanolowego roztworu rezorcyny. Po zmieszaniu wstawić do wrzącej łaźni wodnej i gotować przez około 3060 sekund. W obecności ketoz powstaje czerwonołososiowe zabarwienie. W przypadku aldoz barwa pojawia się po dłuższym czasie.
Ćw. 3 Wykrywanie pentoz a) Próba Tollensa z floroglucyną W reakcji kwasu solnego z pentozami powstaje furfural, który tworzy z floroglucyną związek o barwie wiśniowofiołkowej. Natomiast z 5hydroksymetylenofurfuralem powstaje żółty lub brunatny produkt kondensacji. Analogiczny wynik otrzymuje się również z kwasami uronowymi, ulegającymi w tych warunkach dekarboksylacji. Wykonanie: Do 0,5 ml badanego roztworu dodać 1 ml stężonego l i 5 kropel etanolowego roztworu floroglucyny. grzewać na łaźni wodnej. W obecności pentoz powstaje związek o wiśniowofioletowej barwie, a heksoz żółtej lub brązowej. b) Próba Biala Pentozy ogrzewane ze stężonym kwasem solnym odwadniają się do furfuralu, który z orcyną i jonami Fe 3 barwi się na zielono. Próbę tę wykorzystuje się do ilościowego oznaczania rybozy w kwasach nukleinowych. Wykonanie: Do 0,5 ml badanego roztworu dodać ok. 1 ml 0,% roztworu orcyny w 0% l oraz kroplę 1% roztworu Fel 3 i wymieszać. Wstawić probówkę do wrzącej łaźni wodnej. W obecności pentoz powstaje zielononiebieskie zabarwienie produktu kondensacji furfuralu z orcyną. Wpływ zasad na cukry W środowisku obojętnym i kwaśnym cząsteczki cukrów (powyżej 4 atomów ) występują w postaci pierścieniowej. W środowisku zasadowym forma pierścieniowa przechodzi w formę łańcuchową ponieważ rozpada się wiązanie hemiacetalowe. Rozcieńczone wodne roztwory zasad w temperaturze pokojowej powodują przegrupowanie tautomeryczne wokół karbonylowego atomu węgla oraz przyległego do niego atomu węgla do innej aldozy oraz ketozy. Po pewnym czasie ustala się równowaga między trzema cukrami. W reakcjach tych uczestniczą formy enolowe zwane endiolami. Glukoza przekształca się wówczas w mannozę i fruktozę (posiadają wspólną formę endiolową) i te trzy cukry znajdują się w stanie równowagi. Monosacharydy spokrewnione ze sobą przez wspólną formę endiolową tworzą ten sam osazon. W obecności stężonych zasad wiązanie enolowe może się przemieszczać w inne pozycje łańcucha węglowego. Podczas ogrzewania cukru ze stężonymi zasadami dochodzi do rozerwania wiązania enolowego. Tworzą się dwu i trójwęglowe fragmenty o właściwościach silnie redukujących oraz produkty ich polimeryzacji (ciała żywicowate). ligo i polisacharydy, w których grupy aldehydowe są zablokowane wiązaniami glikozydowymi charakteryzują się dużą opornością na działanie zasad. Wolne grupy aldehydowe i ketonowe cukrów wykazują w środowisku alkalicznym właściwości redukujące. Aktywna w tych warunkach forma aldehydowa (lub ketonowa po enolizacji do formy aldehydowej) redukuje jony metali ciężkich jony miedzi z na 1 (próba Benedicta i Fehlinga), jony bizmutu z 3 na 0 (próba Nylandera), a jony srebra z 1 na 0 stopień utlenienia (próba Tollensa). Podczas redukcji jonów metali aldozy utleniają się do odpowiednich kwasów aldonowych. 3
us 4 Na u() Na S 4 K K u() u Na Na K Na u K Na u glukoza kwas glukonowy Utlenianie ketoz, jest procesem bardziej złożonym, bowiem jego produktem jest mieszanina kwasów. fruktoza 4[] 3 kwas kwas mrówkowy szczawiowy kwas winowy kwas trihydroksyglutarowy Dla przeprowadzenia prób redukcyjnych przygotowuje się odpowiednią mieszaninę reakcyjną. W tym celu w próbie Fehlinga do siarczanu (VI) miedzi (II) dodaje się roztworu Na, a w próbie Benedicta węglanu sodu. Powstający w środowisku zasadowym wodorotlenek miedzi (I) może wytrącić się w postaci koloidalnej zawiesiny, aby temu zapobiec dodaje się związków kompleksujących jony u (w próbie Fehlinga winian sodowo potasowy, a w próbie Benedicta cytrynian trójsodowy). ukry w środowisku zasadowym mogą redukować nie tylko jony metali ciężkich, ale również inne związki, np. kwas pikrynowy, błękit metylenowy. Dodatni wynik próby na właściwości redukujące nie zawsze świadczy o obecności cukru w roztworze, ponieważ posiadają je także inne związki, np. chloroform i kreatynina. Ćw. 4 Epimeryzacja heksoz Wykonanie: Do dwóch próbówek (nr 1 i ) odmierzyć po 0,5 ml roztworu glukozy, do trzeciej próbówki (nr 3) odmierzyć 0,5 ml roztworu fruktozy. Do próbówek nr 1 i 3 wprowadzić po 0,5 ml roztworu 0,01M Na!!!!!!, natomiast do próbówki nr 0,5 ml wody destylowanej. Próbówki ogrzewać przez 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. Po ochłodzeniu do każdej próbówki dodać 1 ml rozcieńczonego l i 3 krople etanolowego roztworu rezorcyny. Po zmieszaniu wstawić do wrzącej łaźni wodnej i gotować przez około 3060 sekund. Zapisać obserwacje i uzasadnić otrzymane wyniki. Spróbować zapisać zachodzące w roztworze reakcje na wzorach. Ćw. 5 Próba Benedicta W tej reakcji, analogicznie jak w próbie Fehlinga,zmienia się stopień utlenienia jonów miedzi z na 1.. dczyn Benedicta jest jednak od niej bardziej swoisty i czuły, dlatego stosuje się go do wykrywania cukrów w moczu. 4
W zależności od stężenia cukrów rozwór może przybierać różne odcienie zieleni lub kolor pomarańczowy. Zielone zabarwienie jest wynikiem nakładania się pomarańczowej barwy zawiesiny u z niebieskim zabarwieniem odczynnika. Barwa sad Stężenie cukru [%] niebieska brak 0 zielona brak 0,1 0,3 zielona osad 0,5 żółtozielona osad 1,0 pomarańczowa osad 1,5 czerwona osad >,0 Wykonanie: Do 0,5 ml odczynnika Benedicta dodać 38 kropli badanego roztworu i wstawić na 3 minuty do wrzącej łaźni wodnej. dczynnik Benedicta: 173 g cytrynianu sodu i 90 g bezwodnego węglanu sodu rozpuścić w 60 ml gorącej wody. Po przesączeniu roztworu, do przesączu dodać 100 ml 17,3% roztworu us 4 x 5. Mieszaninę uzupełnić w kolbie miarowej do 1000 ml. Ćw. 6 Reakcja z kwasem pikrynowym ukry w środowisku zasadowym redukują kwas pikrynowy (pikrynian sodu), który w tych warunkach tworzy czerwony pikraminian sodu. N Na N N pikrynian sodu glukoza N Na N N pikraminian sodu kwas glukonowy Wykonanie: Do 1 ml badanego roztworu dodać 0,5 ml nasyconego roztworu kwasu pikrynowego i 0,5 ml 10% roztworu Na i wstawić na wrzącą łaźnię wodną. Powstające czerwone zabarwienie pochodzące od pikraminianu sodu potwierdza obecność w próbie cukru redukującego. Ćw. 7 Reakcja z błękitem metylenowym Błękit metylenowy pod działaniem czynników redukujących, np. cukrów przyłącza atomy wodory i ulega redukcji do bezbarwnych pochodnych, które łatwo mogą oddawać przyłączone wodory innym akceptorom, np. tlenowi z powietrza, powracając do stanu błękitnego. Wykonanie. Do ml wody destylowanej dodać 4 krople 0,1% wodnego roztworu błękitu metylenowego i kroplę 10% Na. grzać probówkę we wrzącej łaźni wodnej przez około 1 min, następnie dodać około 1 ml roztworu cukru i ogrzewać. W obecności cukrów redukujących zanika niebieska barwa roztworu, co jest spowodowane redukcją błękitu metylenowego do bezbarwnego leukozwiązku. Ponowne pojawienie się niebieskiej barwy można spowodować, wstrząsając kilkakrotnie probówką z odbarwionym płynem. Zachodzi wówczas utlenianie zredukowanego związku tlenem z powietrza. 5
Ćw. 8 Próba Barfoeda Wzrost stężenia jonów wodorowych powoduje zmniejszenie zdolności redukcyjnych węglowodanów, co pozwala na odróżnienie cukrów prostych od disacharydów redukujących. Reakcję tę prowadzi się w środowisku kwaśnym (rozcieńczony kwas mlekowy lub octowy), stosując niskie stężenia cukrów i krótki czas ogrzewania, który zapewnia pozytywny wynik jedynie dla monosacharydów. Przy dłuższym ogrzewaniu disacharydy również ulegają hydrolizie dając także wynik dodatni próby. Wykonanie: Do 0,5 ml badanego roztworu dodać 1 ml odczynnika Barfoeda i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 3 minuty. Jeżeli po tym czasie nie wytrącił się osad probówkę ponownie umieścić na łaźni wodnej i ogrzewać kolejnych 10 minut. Pojawienie się czerwonego osadu u w próbie po 3 min. ogrzewania potwierdza obecność monosacharydu, a gdy powstaje on po kilkunastu minutach dowodzi obecności disacharydu redukującego. Ćw. 9 Próba Wöhlkego Reakcje charakterystyczne dla poszczególnych cukrów grzewając roztwór laktozy lub maltozy z amoniakiem w obecności K powstaje czerwone zabarwienie. Natomiast glukoza lub fruktoza tworzą żółtobrązowy produkt. Wykonanie: Do 1 ml badanego roztworu dodać 1 ml stężonego roztworu amoniaku i 3 krople 3% K. Wstawić do wrzącej łaźni wodnej na kilka minut. Ćw. 10 Reakcja skrobi z jodem Reakcja skrobi lub glikogenu z jodem polega na adsorpcji jodu, który wnika do kanału utworzonego przez spiralnie skręcone łańcuchy polisacharydowe i jest przytrzymywane przez tlen przy pierwszym i czwartym atomie węgla każdej cząsteczki glukozy. Wytwarza się więc łańcuch drobin jodu, wzdłuż którego mogą przemieszczać się elektrony, co powoduje pochłanianie światła przez układ. Skrobia po adsorpcji cząsteczek jodu barwi się na kolor ciemnoniebieski. bserwowana barwa zależy od budowy i stopnia rozgałęzienia łańcucha polisacharydu, a więc reakcja jodu z amylozą powoduje powstanie niebieskiego produktu, a z amylopektyną fioletowego. Glikogen barwi się z jodem na czerwono. grzewanie skrobi z rozcieńczonymi kwasami prowadzi do hydrolizy wiązań glikozydowych i powstania wraz z czasem trwania tego procesu odpowiednio: amylodekstryny barwiącej się z jodem na fioletowo, erytrodekstryny czerwono i achrodekstryny nie barwiącej się z jodem. Końcowymi produktami hydrolizy kwaśnej tych wielocukrów są maltoza i glukoza. pierścień glukozy cząsteczki jodu Wykonanie: Do 1 ml badanego roztworu dodać 3 krople J w KJ. W obecności skrobi powstaje ciemnoniebieskie zabarwienie. Zagadnienia do ćwiczeń 1. Węglowodany definicja, wzór ogólny, podział i właściwości.. Pentozy i heksozy występowanie, wzory łańcuchowe i pierścieniowe rybozy, deoksyrybozy, glukozy, mannoza, galaktoza, fruktozy, arabinozy, ksylozy 3. Powstawanie furfuralu i hydroksymetylenofurfuralu 4. Dichasarydy i polisacharydy przykłady, właściwości. 5. Reakcje barwne pozwalające wykrywać różne cukry. 6. ukry posiadające właściwości redukujące przykłady. 7. Definicje: racemat, anomeria, węgiel chiralny, mutarotacja, enancjomery, diastereoizomery, epimery, glikozydy, wiązanie glikozydowe, szereg konfiguracyjny D i L. 6
ZEŚĆ DRUGA IDENTYFIKAJA NIEZNANEG UKRU W RZTWRZE trzymany roztwór/roztwory cukru zidentyfikować przeprowadzając kolejne reakcje, w oparciu o schemat analizy cukrów. Wyniki przeprowadzonych reakcji podczas identyfikacji cukru wraz z wnioskami opisać w załączonej tabeli. PRÓBA MLISA PRÓBA Z JDEM Skrobia PRÓBA BENEDITA PRÓBA SELIWANWA PRÓBA BARFEDA Sacharoza PRÓBA TLLENSA Z FLRGLUYNĄ PRÓBA WLKEG Arabinoza Glukoza Galaktoza Fruktoza Laktoza Maltoza PRÓBA SELIWANWA Fruktoza Glukoza Galaktoza 7
WĘGLWDANY ANALIZA JAKŚIWA......... Imię i Nazwisko Grupa... Data... Reakcja/Próba Roztwór do analizy nr... WYNIK PRÓBY BSERWAJE WNISKI Próba Molischa Próba z jodem Analizowanym cukrem jest:. 8
Reakcja/Próba Roztwór do analizy nr... WYNIK PRÓBY BSERWAJE WNISKI Próba Molischa Próba z jodem Analizowanym cukrem jest:. 9