Probówka wskaÿnikowa do okreœlania tempa wzrostu pr¹tków, œrodek wzbogacaj¹cy OADC oraz mieszanina antybiotykowa PANTA

BBL MGIT PRZEZNACZENIE Probówka wskaÿnikowa do okreœlania tempa wzrostu pr¹tków, œrodek wzbogacaj¹cy OADC oraz mieszanina antybiotykowa PANTA 8809501JAA(02) 2015-05 Probówka wskaÿnikowa do oznaczania tempa wzrostu pr¹tków BBL MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube, dodatkowo wzbogacona o OADC BBL MGIT oraz mieszaninê antybiotykow¹ BBL MGIT PANTA, s³u y do wykrywania oraz wyodrêbniania pr¹tków. Próbki, nadaj¹ce siê do stosowania w systemie, to próbki kliniczne, odka one i opracowane (z wyj¹tkiem moczu) oraz ja³owe p³yny ustrojowe (z wyj¹tkiem krwi). STRESZCZENIE I OBJAŒNIENIE Od 1985 do 1992 roku iloœæ odnotowanych przypadków gruÿlicy wzros³a o 18%. Szacuje siê, e gruÿlica nadal zabija rocznie 3 miliony osób na ca³ym œwiecie, przez co jest g³ówn¹ chorob¹ zakaÿn¹, stanowi¹c¹ przyczynê zgonów 1. Przeprowadzone pomiêdzy rokiem 1981 i 1987 badania zachorowañ na AIDS wskaza³y, e u 5,5% pacjentów chorych na AIDS wystêpowa³y rozprzestrzeniaj¹ce siê niegruÿlicze zaka enia pr¹tkowe, np. wywo³ane przez MAC. Do roku 1990 skumulowana czêstoœæ wystêpowania niegruÿliczych zaka eñ pr¹tkowych osi¹gnê³a 7,6% 2. Oprócz wielu nowych zachorowañ na gruÿlicê pojawi³ siê nowy problem, pod postaci¹ wieloopornych pr¹tków (MDR-TB, Multidrug-resistant MTB). OpóŸnienia laboratoriów w hodowli, identyfikacji oraz informowaniu o przypadkach MDR-TB przyczyni³y siê czêœciowo do rozprzestrzenienia choroby 3. Oœrodki Zapobiegania i Zwalczania Chorób w USA (CDC, Centers for Disease Control and Prevention) wyda³y zalecenia, i nale y do³o yæ wszelkich starañ, aby w laboratoriach stosowane by³y najszybsze mo liwe metody do wykrywania i badania pr¹tków. Zalecenia te obejmuj¹ stosowanie zarówno p³ynnych, jak i sta³ych pod³o y do hodowli pr¹tków 3. Probówka wskaÿnikowa do okreœlania wzrostu pr¹tków MGIT zawiera 4 ml zmodyfikowanego bulionu Middlebrook 7H9 4,5. Pe³ne pod³o e, zawieraj¹ce 0,5 ml œrodka wzbogacaj¹cego OADC i 0,1 ml mieszaniny antybiotykowej PANTA jest jednym z najczêœciej stosowanych p³ynnych pod³o y, wykorzystywanych do hodowli pr¹tków. Wszystkie rodzaje próbek klinicznych, zarówno p³ucnych, jak i pozap³ucnych (oprócz krwi i moczu), mog¹ byæ przetwarzane w celu wstêpnej izolacji w probówce MGIT, przy u yciu metod konwencjonalnych 6. Testowana próbka jest inokulowana do probówki MGIT, poddawana inkubacji oraz pocz¹wszy od drugiego dnia inkubacji poddawana codziennej ocenie przy u yciu d³ugofalowego promieniowania UV. W chwili otrzymania wyniku dodatniego w próbce znajduje siê œrednio 10 4 10 7 CFU/mL pr¹tków. ZASADY PROCEDURY Na dnie pó³okr¹g³o zakoñczonych probówek 16 x 100 mm znajduje siê osadzony w silikonie, fluorescencyjny komponent. Jest on wra liwy na dzia³anie rozpuszczonego w po ywce bulionowej tlenu. Pocz¹tkowo pojawia siê tylko niewielka fluorescencja, poniewa wstêpna du a iloœæ rozpuszczonego tlenu absorbuje emisje pochodz¹ce z komponentu. Nastêpnie aktywnie oddychaj¹ce drobnoustroje zu ywaj¹ tlen, w zwi¹zku z czym mo na ju dok³adnie zaobserwowaæ fluorescencjê za pomoc¹ transiluminatora wykorzystuj¹cego promieniowanie o d³ugoœci fali 365 nm lub d³ugofalowego promieniowania UV (lampa Wooda). Wzrost bakterii mo na równie wykryæ dziêki stwierdzeniu obecnoœci niejednorodnego zmêtnienia, ma³ych ziarenek lub p³atków w pod³o u. Sk³adnikami pod³o a s¹ substancje niezbêdne do szybkiego wzrostu pr¹tków. Kwas oleinowy jest wykorzystywany przez pr¹tki gruÿlicy i odgrywa wa n¹ rolê w procesach metabolicznych organizmów pr¹tków. Albumina pe³ni rolê ochronn¹, wi¹ ¹c wolne kwasy t³uszczowe, które mog¹ byæ toksyczne dla gatunków Mycobacterium, i tym samym przyspiesza ich wzrost. Dekstroza jest Ÿród³em energii. Katalaza niszczy toksyczne nadtlenki, które mog¹ byæ obecne w po ywce. Zanieczyszczenie mo na zmniejszyæ przez dodanie do bazy BBL MGIT i œrodka wzbogacaj¹cego OADC BBL MGIT mieszanki antybiotykowej BBL MGIT PANTA przed wykonaniem inokulacji próbki klinicznej. ODCZYNNIKI Probówka wskaÿnikowa do okreœlania tempa wzrostu pr¹tków BBL MGIT zawiera: 110 µl wskaÿnika fluorescencyjnego oraz 4 ml bulionu. WskaŸnik zawiera trój 4,7-difenylo-1,10-fenantrolinorutenopiêciowodzian chlorkowy w bazie z kauczuku silikonowego. Probówki s¹ przep³ukiwane 10% CO 2 i zamykane zatyczkami z polipropylenu. Przybli ona formu³a* na litr wody oczyszczonej: Zmodyfikowana baza bulionowa Middlebrook 7H9... 5,9 g Pepton kazeinowy... 1,25 g Polski 1

BBL MGIT OADC zawiera 15 ml œrodka wzbogacaj¹cego Middlebrook OADC. Przybli ona formu³a* na litr wody oczyszczonej: Albumina bydlêca... 50,0 g Dekstroza... 20,0 g Fiolka BBL MGIT PANTA zawiera liofilizowan¹ mieszaninê antybiotyków. Przybli ona formu³a* na fiolkê liofilizowanej mieszaniny PANTA: Katalaza... 0,03 g Kwas oleinowy... 0,6 g Polimyksyna B... 6 000 jednostek Trimetoprim... 600 µg Amfoterycyna B... 600 µg Azlocylina... 600 µg Kwas nalidyksowy... 2 400 µg *Skorygowany i (lub) uzupe³niony zgodnie z wymaganiami maj¹cymi na celu spe³nienie kryteriów dzia³ania. Instrukcje u ytkowania: Rozpuœciæ liofilizat zawartej w fiolce mieszaniny antybiotykowej BBL MGIT PANTA w 3 ml sterylnej, destylowanej lub dejonizowanej wody. Ostrzeżenia i środki ostrożności: Do diagnostyki in vitro. W próbkach mog¹ byæ obecne patogenne drobnoustroje, takie jak wirus zapalenia w¹troby typu B i wirus HIV. Przy pracy z wszelkimi materia³ami zanieczyszczonym krwi¹ lub innymi p³ynami ustrojowymi nale y przestrzegaæ Uniwersalnych œrodków ostro noœci 1,2. Praca z namna aj¹cymi siê hodowlami Mycobacterium tuberculosis wymaga stosowania metod dzia³ania oraz u ywania zabezpieczaj¹cego sprzêtu laboratoryjnego,zgodnych z wytycznymi praktyk bezpieczeñstwa biologicznego 6 (BSL, Biosafety Level), poziomu 3. Przed u yciem nale y sprawdziæ, czy probówka MGIT nie jest zanieczyszczona lub uszkodzona. Wyrzuciæ wszelkie probówki, które wydaj¹ siê nieodpowiednie, lub je eli przed u yciem widoczna jest fluorescencja. Nale y dok³adnie sprawdziæ probówki, które zosta³y upuszczone. Jeœli widoczne s¹ jakiekolwiek uszkodzenia, probówkê nale y wyrzuciæ. Podczas obserwowania fluorescencji nale y stosowaæ okulary ochronne z filtrami przeciw promieniowaniu UV oraz u ywaæ wy³¹cznie promieniowania d³ugofalowego (365 nm). DO BADANIA PRÓBEK NIE WOLNO U YWAÆ ŒWIAT A EMITUJ CEGO KRÓTKIE FALE UV. Przed wyrzuceniem nale y wysterylizowaæ w autoklawie wszystkie probówki MGIT, które poddano inokulacji. Przechowywanie odczynników: Probówki wskaÿnikowe BBL MGIT nale y przechowywaæ w temperaturze 2 25 C. NIE ZAMRA AÆ. Chroniæ przed œwiat³em. Bulion powinien byæ przejrzysty i bezbarwny. Nie stosowaæ, je eli po ywka jest mêtna. Probówki MGIT, które przed u yciem s¹ przechowywane zgodnie z zaleceniami na etykiecie, mog¹ byæ poddane inokulacji do wygaœniêcia daty wa noœci oraz inkubowane przez okres do oœmiu tygodni. BBL MGIT OADC Po otrzymaniu przechowywaæ w ciemnym pomieszczeniu, w temperaturze 2 8 C. Unikaæ zamra ania lub przegrzania. Nie otwieraæ do chwili u ycia. Chroniæ przed œwiat³em. Mieszanina antybiotyków BBL MGIT PANTA Po otrzymaniu przechowywaæ fiolki z liofilizatem w temperaturze 2 8 C. Po rozpuszczeniu mieszaninê PANTA mo na wykorzystaæ w ci¹gu 72 h, je eli przechowywana jest w temperaturze 2 8 C lub w ci¹gu 6 miesiêcy, je eli przechowywana jest w temperaturze -20 C lub ni szej. Po rozmro eniu mieszanina PANTA musi byæ zu yta natychmiast. Wyrzuciæ niezu yt¹ porcjê. POBIERANIE PRÓBEK I OBCHODZENIE SIÊ Z NIMI Wszystkie próbki nale y pobieraæ i transportowaæ zgodnie z zaleceniami CDC, podrêcznikiem Clinical Microbiology Procedures Handbook lub podrêcznikiem procedur laboratoryjnych, obowi¹zuj¹cym w laboratorium U ytkownika 6,8. TRAWIENIE, OCZYSZCZANIE I ZAG SZCZANIE MATERIA U Próbki pobrane z ró nych czêœci cia³a powinny byæ przygotowane do inokulacji w probówkach MGIT w nastêpuj¹cy sposób: PLWOCINA: Próbki nale y przetwarzaæ z zastosowaniem metody NALC-NaOH, zgodnie z wytycznymi CDC zawartymi w Public Health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory 6. Ewentualnie mo na stosowaæ zestaw BBL MycoPrep, przeznaczony do przetwarzania próbek zawieraj¹cych pr¹tki (zobacz czêœæ Dostêpnoœæ ). TREŒÆ O DKOWA: Próbki powinny byæ oczyszczane tak jak plwocina. Jeœli objêtoœæ próbki przekracza 10 ml, nale y j¹ zagêœciæ poprzez odwirowanie. Rozcieñczyæ osad w oko³o 5 ml sterylnej wody, a nastêpnie oczyœciæ. Je eli próbka jest gêsta lub œluzowata, dodaæ niewielk¹ iloœæ proszku NALC (50 100 mg). Po oczyszczeniu, a przed dokonaniem inokulacji w probówce MGIT, ponownie zagêœciæ zawiesinê. P YNY USTROJOWE (p³yn mózgowo-rdzeniowy, p³yn stawowy, p³yn z jamy op³ucnej itd.): Próbki pobrane w sposób ja³owy, w których nie s¹ spodziewane adne inne zanieczyszczenia bakteryjne, mo na inokulowaæ bez oczyszczania. Jeœli objêtoœæ próbki przekracza 10 ml, nale y j¹ zagêœciæ poprzez odwirowanie przez 15 minut przy 3 000 x g. Wylaæ nads¹cz. Dokonaæ inokulacji 2

probówki MGIT za pomoc¹ osadu. Próbki, w których istnieje ryzyko obecnoœci innych bakterii, musz¹ zostaæ poddane oczyszczeniu. TKANKA: Próbki z tkanki nale y przygotowaæ zgodnie z wytycznymi CDC zawartymi w Public Health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory 6. STOLEC: Wykonaæ zawiesinê, dodaj¹c 1 g ka³u do 5 ml bulionu Middlebroth. Mieszaæ zawiesinê przez 5 sekund. Przejœæ do procedury NALC-NaOH zgodnie z wytycznymi CDC zawartymi w Public Health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory 6. PROCEDURA Dostarczane materia³y: 4 ml probówki wskaÿnikowe BBL MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tubes opakowanie zawieraj¹ce 25 i 100 sztuk lub 6 fiolek po 15 ml OADC BBL MGIT, lub 6 liofilizowanych fiolek z mieszanin¹ antybiotykow¹ BBL MGIT PANTA (zobacz czêœæ Dostêpnoœæ ). Materiały wymagane, ale niedostarczane: Probówki do wirówki o pojemnoœci 50 ml marki Falcon, 4% wodorotlenek sodu, 2,9% roztwór cytrynianu sodu, proszek N-acetylo-L-cysteiny, fosforanowy roztwór buforowy o ph 6,8, urz¹dzenie do mieszania (vortex), inkubator (37 C), sterylne pipety 1 ml, sterylne pipety transferowe, transiluminator UV (365 mm) lub lampa Wooda z arówk¹ emituj¹c¹ promieniowanie d³ugofalowe lub niewidzialne, 0,4% roztwór siarczynu sodu (poni sza procedura), Pod³o e BBL Middlebrook and Cohn 7H10 Agar, BBL MycoPrep, po ywka bulionowa BBL Middlebrook 7H9 (zobacz czêœæ Dostêpnoœæ ) lub inny agar pr¹tkowy lub pod³o e na bazie jaja kurzego, homogenizator tkankowy lub sterylne waciki, roztwór soli fizjologicznej BBL (zobacz czêœæ Dostêpnoœæ ), mikroskop i materia³y do barwienia, pipety o objêtoœci 100 i 500 µl, odpowiadaj¹ce im koñcówki, p³ytka z 5% agarem z dodatkiem krwi owczej, okulary ochronne Eye Guard Spectacles (UVP #UVC-303, San Gabriel, CA) oraz przeciwpr¹tkowy œrodek odka aj¹cy. INOKULACJA PROBÓWEK MGIT: 1. Oznaczyæ probówkê MGIT numerem próbki. 2. Odkrêciæ nakrêtkê i w sposób aseptyczny dodaæ 0,5 ml OADC MGIT. 3. W sposób aseptyczny dodaæ 0,1 ml rozpuszczonej mieszaniny antybiotykowej MGIT PANTA. Dla uzyskania lepszych rezultatów œrodek wzbogacaj¹cy OADC oraz mieszaninê PANTA nale y dodaæ bezpoœrednio przed wykonaniem inokulacji próbki. 4. Dodaæ 0,5 ml zagêszczonej zawiesiny próbki przygotowanej wed³ug powy ej opisanej procedury. Kroplê (0,1 ml) próbki nanieœæ równie na p³ytkê agarow¹ 7H10 lub inne pr¹tkowe pod³o e sta³e albo na pod³o e na bazie jaja kurzego. UWAGA: Próbki o objêtoœci wiêkszej ni 0,5 ml mog¹ zwiêkszaæ zanieczyszczenie lub w inny sposób niekorzystnie wp³ywaæ na dzia³anie probówek. 5. Dok³adnie zamkn¹æ probówkê i dobrze wymieszaæ. 6. Probówki nale y inkubowaæ w temperaturze 37 C. Dla próbek, w których mog¹ znajdowaæ siê pr¹tki o ró nych wymaganiach inkubacyjnych, mo na zastosowaæ drug¹ probówkê MGIT i poddaæ j¹ inkubacji w odpowiedniej temperaturze, np. 30 C lub 42 C. Dokonaæ inokulacji i inkubowaæ w wymaganej temperaturze Je eli w próbkach podejrzewa siê obecnoœæ Mycobacterium haemophilum, do probówki nale y w chwili inokulacji dodaæ Ÿród³o heminy oraz inkubowaæ probówkê w temperaturze 30 C. Przed inokulacją próbki w sposób jałowy umieścić jeden krążek BBL Taxo Differentiation Discs X w każdej probówce MGIT wymagającej dodatku heminy (zobacz część Dostępność ). 7. Pocz¹wszy od drugiego dnia inkubacji codziennie dokonywaæ odczytów z probówek, stosuj¹c opisan¹ poni ej procedurê. Przygotowanie probówek z kontrol¹ dodatni¹ i ujemn¹ potrzebnych do interpretacji wyników: Probówki z kontrol¹ dodatni¹ i ujemn¹ stosowaæ nale y wy³¹cznie do interpretacji fluorescencji, a nie jako kontrolê dzia³ania pod³o a. Probówka z kontrol¹ dodatni¹: 1. Usun¹æ po ywkê bulionow¹ z probówki MGIT, która nie zosta³a poddana inokulacji. 2. Oznakowaæ j¹ jako probówkê z prób¹ z kontrol¹ dodatni¹ i zapisaæ datê. 3. Przygotowaæ 0,4% roztwór siarczynu sodu (0,4 g w 100 ml sterylnej destylowanej lub dejonizowanej wody). Wyrzuciæ niezu yt¹ porcjê. 4. Dodaæ 5 ml siarczynu sodu do probówki, zamkn¹æ probówkê, dokrêciæ i odstawiæ przed u yciem na co najmniej 1 godz. w temperaturze pokojowej. 5. Probówki z kontrol¹ dodatni¹ mo na stosowaæ wielokrotnie. Ka da probówka z kontrol¹ dodatni¹ mo e byæ stosowana przez okres do czterech tygodni, je eli przechowywana jest w temperaturze pokojowej. Probówka z kontrol¹ ujemn¹: Do kontroli s³u y probówka MGIT, która nie zosta³a otwarta i inokulowana. 3

Odczyty probówek: 1. Probówki z kontrol¹ dodatni¹ i ujemn¹ s¹ wa ne ze wzglêdu na prawid³ow¹ interpretacjê wyników. 2. Wyj¹æ probówki z inkubatora. Wystawiæ probówki na dzia³anie promieniowania UV, razem z probówk¹ z kontrol¹ dodatni¹ oraz probówk¹, która nie zosta³a inokulowana (kontrola ujemna). Zaleca siê, eby ustawiaæ w œwietle promieniowania UV jeden statyw z probówkami (4x po 10 probówek). UWAGA: Podczas obserwowania fluorescencji nale y stosowaæ okulary ochronne z filtrami przeciw promieniowaniu UV. Preferowane jest normalne oœwietlenie pokojowe. Nale y unikaæ dokonywania odczytów w pomieszczeniach nas³onecznionych lub zaciemnionych. 3. Wybraæ wzrokowo probówki MGIT, które wykazuj¹ jasn¹ fluorescencjê. Fluorescencja odznacza siê jasnym, pomarañczowym zabarwieniem na dnie probówki oraz pomarañczowym odblaskiem w obrêbie menisku. Nastêpnie wyj¹æ probówkê MGIT ze statywu i porównaæ z probówkami z kontrol¹ dodatni¹ i ujemn¹. Kontrola dodatnia powinna wykazywaæ siln¹ fluorescencjê (bardzo jasny kolor pomarañczowy). Kontrola ujemna powinna mieæ bardzo s³ab¹ fluorescencjê lub nie mieæ adnej. Jeœli fluorescencja w probówce MGIT jest bardziej zbli ona do kontroli dodatniej, to jest to probówka z wynikiem dodatnim. Jeœli zaœ wygl¹dem bardziej przypomina kontrolê ujemn¹, jest to probówka z wynikiem ujemnym. Wzrost bakterii mo na równie wykryæ poprzez stwierdzenie obecnoœci niejednorodnego zmêtnienia, ma³ych ziarenek lub p³atków w zawiesinie. 4. Probówki z wynikiem dodatnim nale y zabarwiæ w celu wykrycia pr¹tków kwasoopornych. Probówki z wynikiem ujemnym nale y sprawdziæ pod wzglêdem zanieczyszczenia bakteryjnego. Hodowle pochodne s³u ¹ce do identyfikacji oraz oceny wra liwoœci na leki mo na wykonaæ przy u yciu p³ynu z probówki BBL MGIT. 5. Probówki z wynikiem ujemnym powinny byæ odczytywane codziennie przez osiem tygodni lub d³u ej, w zale noœci od rodzaju próbki i wczeœniejszych doœwiadczeñ danego laboratorium. Mo na ustaliæ równie inne, alternatywne schematy wykonywania odczytów. Kilkudniowe przerwy w wykonywaniu odczytów (np. podczas weekendów lub wakacji) mog¹ opóÿniæ identyfikacjê probówek z wynikiem dodatnim, ale nie bêd¹ mia³y negatywnego wp³ywu na dzia³anie uk³adu. Przed wyrzuceniem probówki nale y wzrokowo oceniæ pod wzglêdem zmêtnienia i wystêpowania ma³ych ziarenek czy te granulek. Probówki MGIT z wynikiem ujemnym nie mog¹ byæ ponownie u ywane. Jeœli podejrzewa siê wzrost pr¹tków, nale y postêpowaæ zgodnie z zaleceniami zawartymi poni ej, w instrukcji postêpowania z probówkami MGIT z wynikiem dodatnim. Postêpowanie z zanieczyszczonymi probówkami MGIT: Zanieczyszczone probówki MGIT mog¹ zostaæ poddane ponownemu oczyszczaniu i zagêszczaniu przy zastosowaniu tej samej procedury, co w przypadku pocz¹tkowego przygotowywania próbek. 1. Zawartoœæ zanieczyszczonej probówki MGIT wprowadziæ do 50 ml plastikowej probówki wirówkowej. 2. Dodaæ 5 ml roztworu NALC-NaOH. Szczelnie zamkn¹æ probówkê i wirowaæ przez 5 20 s. 3. Odstawiæ probówkê na 15 20 min. Nie pozostawiaæ przez wiêcej ni 20 min. 4. Dodaæ 35 ml sterylnego buforu fosforanowego o ph równym 6,8. Ponownie zamkn¹æ probówkê i wymieszaæ jej zawartoœæ. 5. Zagêœciæ próbkê poprzez wirowanie przez 15 min przy szybkoœci 3 000 x g. 6. Zlaæ ostro nie nads¹cz z powierzchni osadu. Ponownie zawiesiæ osad w fosforanowym buforze o ph równym 6,8, dodaj¹c go za pomoc¹ sterylnej pipety Pasteura. 7. Wykonaæ inokulacjê, przenosz¹c 0,5 ml powsta³ej zawiesiny do nowej probówki MGIT. Kontrola jakoœci przez u ytkownika: Należy postępować zgodnie z obowiązującymi wymogami kontroli jakości, wynikającymi z przepisów miejscowych, krajowych i/lub federalnych, wymogami akredytacji i rutynowymi procedurami kontroli jakości w danym laboratorium. Zaleca się skorzystanie z odpowiednich wytycznych CLSI lub przepisów CLIA w celu ustalenia właściwych zasad kontroli jakości. Certyfikaty kontroli jakości są dostępne na stronie internetowej BD. W certyfikatach kontroli jakości podane są nazwy drobnoustrojów używanych do badań, w tym hodowle ATCC określone w zatwierdzonej przez CLSI normie M22-A3, Quality Control for Commercially Prepared Microbiological Culture Media (Kontrola jakości przygotowanych do handlu mikrobiologicznych pożywek hodowlanych) 9. UWAGA: Bulion Middlebrook 7H9 Broth (dodatkowy) jest wyłączony z kontroli jakości zgodnie z normą CLSI M22-A3 9. WYNIKI Próbki o wyniku dodatnim identyfikowane s¹ na podstawie wystêpowania fluorescencji lub niejednorodnego zmêtnienia, ma³ych ziarenek lub p³atków w inokulowanej probówce MGIT. Probówki, w których uzyskano wynik dodatni nale y przesiaæ i przygotowaæ do barwienia na kwasoopornoœæ. Dodatni wynik barwienia wskazuje na przypuszczaln¹ obecnoœæ ywych drobnoustrojów w probówce. 4

Postêpowanie z probówk¹ MGIT, w której uzyskano wynik dodatni: UWAGA: Wszystkie czynnoœci powinny byæ wykonywane w komorze laminarnej. a) Wyj¹æ probówkê MGIT ze statywu testowego. b) Za pomoc¹ sterylnej pipety transferowej pobraæ próbkê z dna probówki (oko³o 0,1 ml) w celu poddania jej barwieniu (barwienie na kwasoopornoœæ i barwienie metod¹ Grama). c) Zbadaæ rozmaz i barwienie. Po dokonaniu oceny zabarwienia na kwasoopornoœæ zg³osiæ wstêpne wyniki. Je eli barwienie na kwasoopornoœæ jest dodatnie, przesiaæ na pod³o e sta³e i podaæ wynik jako: Wzrost dodatni, barwienie na kwasoopornoœæ dodatnie, identyfikacja w trakcie. Je eli wystêpuj¹ drobnoustroje inne ni AFB, podaæ wynik jako: Wzrost dodatni, barwienie na kwasoopornoœæ ujemne, zanieczyszczenie. Jeœli nie stwierdza siê obecnoœci adnych drobnoustrojów, nie podawaæ wyniku. Przesiaæ bulion na p³ytkê z pod³o em agarowym i pod³o e do hodowli pr¹tków; powtórzyæ barwienie stosuj¹c dodatek bia³ka, aby zapewniæ odpowiednie ustalenie inokulum w preparacie. OGRANICZENIA PROCEDURY Izolacja pr¹tków z probówki MGIT jest uzale niona od iloœci obecnych w próbce drobnoustrojów, metod pobierania próbki, czynników dotycz¹cych pacjenta, takich jak wystêpowanie objawów, wczeœniejsze leczenie i sposób przygotowania. Zaleca siê oczyszczanie przy zastosowaniu metod opartych na u yciu N-acetylo-L-cysteinowego wodorotlenku sodu (NALC-NaOH) lub kwasu szczawiowego. Inne metody oczyszczania nie zosta³y przetestowane w powi¹zaniu z pod³o em BBL MGIT. Roztwory trawi¹co-oczyszczaj¹ce mog¹ mieæ szkodliwy wp³yw na pr¹tki. Morfologia oraz pigmentacja kolonii mo e byæ okreœlona wy³¹cznie na pod³o ach sta³ych. Pr¹tki mog¹ ró niæ siê pod wzglêdem kwasoopornoœci w zale noœci od szczepu, wieku hodowli i innych zmiennych. Zgodnoœæ morfologii mikroskopowej na pod³o u BBL MGIT nie zosta³a jak dot¹d ustalona. W celu identyfikacji oraz przeprowadzenia testów wra liwoœci szczepu nale y dokonaæ przesiania zawartoœci probówki MGIT, w której uzyskano dodatni wynik przy barwieniu AFB, zarówno na pod³o e selektywne, jak i nieselektywne dla pr¹tków. Probówki MGIT, które wydaj¹ siê dodatnie, mog¹ zawieraæ gatunki inne ni pr¹tki. Inne gatunki mog¹ przerastaæ wystêpuj¹ce pr¹tki. Takie probówki MGIT powinny zostaæ ponownie oczyszczone i ponownie posiane. Probówki MGIT, które wydaj¹ siê dodatnie, mog¹ zawieraæ jeden lub wiêcej gatunków pr¹tków. Gatunki pr¹tków szybciej rosn¹ce mog¹ ujawniaæ fluorescencjê wczeœniej ni wolniej rosn¹ce pr¹tki, dlatego te w celu prawid³owej identyfikacji wszystkich obecnych w próbce gatunków pr¹tków jest wa ne, aby dokonaæ przesiania probówek MGIT, w których uzyskano wynik dodatni. Próbki o objêtoœci wiêkszej ni 0,5 ml mog¹ zwiêkszaæ zanieczyszczenie lub w inny sposób niekorzystnie wp³ywaæ na dzia³anie probówek MGIT. Ze wzglêdu na bogactwo po ywki bulionowej MGIT oraz nieselektywny charakter wskaÿnika MGIT jest wa ne, aby postêpowaæ zgodnie z procedur¹ rozcieñczania/oczyszczania w celu zmniejszenia prawdopodobieñstwa zanieczyszczenia. Stosowanie siê do procedury zawartej w instrukcji ma krytyczne znaczenie dla optymalnej izolacji pr¹tków. Stosowanie mieszaniny antybiotykowej PANTA, mimo i jest konieczne dla próbek niesterylnych, mo e mieæ hamuj¹cy wp³yw na rozwój niektórych pr¹tków. W trakcie testów klinicznych nie by³y rutynowo wykonywane koñcowe posiewy. Dlatego te do tej pory nie mo na dok³adnie oszacowaæ iloœci wyników fa³szywie ujemnych (tzn. probówek MGIT, w których wynik ujemny utrzymywa³ siê przez osiem tygodni inkubacji, a nastêpnie zosta³y przesiane i wykazywa³y wzrost pr¹tków). Przeprowadzono badania 23 gatunków pr¹tków (szczepów dzikich oraz szczepów ATCC), u ywaj¹c inokulum w zakresie od 10 3 do 10 5 CFU/mL. W probówkach MGIT wykryto nastêpuj¹ce gatunki: M. africanum M. gordonae* M. nonchromogenicum M. terrae M. avium Complex* M. haemophilum M. phlei M. triviale M. chelonae* M. intracellulare M. scrofulaceum M. tuberculosis* M. flavescens* M. kansasii* M. simiae* M. vaccae M. fortuitum* M. malmoense M. smegmatis M. xenopi* M. gastri M. marinum M. szulgai *Gatunki wyizolowane podczas klinicznej oceny probówki MGIT. W badaniach klinicznych wyizolowano pr¹tki z próbek pobranych z uk³adu oddechowego, treœci o³¹dkowej, tkanek, stolca i sterylnych p³ynów ustrojowych z wyj¹tkiem krwi; nie dokonano izolacji pr¹tków z innych p³ynów ustrojowych za pomoc¹ tego produktu. 5

OCZEKIWANE WARTOŒCI 1 Poni szy wykres prezentuje rozk³ad czêstoœæ czasu izolacji próbnych klinicznych próbek ocenionych jako dodatnie w systemie BBL MGIT. CHARAKTERYSTYKA BADANIA Probówka wskaÿnikowa do okreœlania tempa wzrostu mykobakterii BBL MGIT poddana zosta³a ocenie w szeœciu niezale nych, oddalonych od siebie pod wzglêdem po³o enia geograficznego oœrodkach klinicznych, w³¹cznie z laboratoriami oœrodków publicznej s³u by zdrowia oraz du ymi szpitalami z oddzia³ami ostrego dy uru. Przebadana populacja pacjentów obejmowa³a chorych z HIV, chorych z upoœledzonym uk³adem odpornoœciowym oraz biorców przeszczepów. Probówki BBL MGIT by³y porównywane z systemem radiometrycznym BACTEC 460TB, systemem do badania hodowli pr¹tków BBL SEPTI-CHECK AFB oraz z konwencjonalnymi pod³o ami sta³ymi, s³u ¹cymi do wykrywania i izolacji pr¹tków z próbek klinicznych (z wyj¹tkiem krwi i moczu). Badaniom poddano w sumie 2801 próbek. Rozk³ad próbek w zale noœci od miejsca pobrania by³ nastêpuj¹cy: próbki pochodz¹ce z uk³adu oddechowego (78%), z treœci o³¹dkowej (0,4%), z p³ynów ustrojowych (9,8%), próbki z tkanek (7,0%) i inne (2,4%). W 318 próbkach uzyskano wynik dodatni, co odpowiada 330 szczepom otrzymanym podczas badania. Z tych 330 szczepów, 253 (77%) otrzymano w probówkach BBL MGIT, 260 (79%) w systemie BACTEC 460TB i BBL SEPTI-CHECK AFB oraz 219 (66%) na konwencjonalnych pod³o ach sta³ych. W probówkach BBL MGIT odsetek wyników fa³szywie ujemnych wyniós³ 0,5% (fluorescencja MGIT, brak bakterii kwasoopornych). Za pomoc¹ probówek BBL MGIT nie uda³o siê zidentyfikowaæ 3,7% szczepów, które zosta³y prawid³owo wyizolowane w jednym lub wiêcej alternatywnych systemach (BACTEC 460TB, BBL SEPTI-CHECK AFB lub na konwencjonalnych pod³o ach sta³ych). Pomimo i wymieniony wy ej odsetek przedstawia potencjalne ryzyko braku identyfikacji, nie oznacza to w rzeczywistoœci uzyskania wyników fa³szywie ujemnych (zobacz czêœæ Ograniczenia procedury ). Zastosowanie drugiego pod³o a zgodnie z zaleceniami zwiêkszy prawdopodobieñstwo prawid³owego wyizolowania pr¹tków. Œredni odsetek zanieczyszczeñ wyniós³ dla probówek BBL MGIT 9,7%. OZNACZANIE METOD BACTEC Tabela 2 Wykrywanie szczepów pr¹tków w badaniach klinicznych Izolat izolatów w MGIT Tylko w MGIT w BACTEC Tylko w BACTEC na pod³o achkonwencjonalnych Tylko na pod³o ach konwencjonalnych MTB 113 91 2 98 7 92 6 MAC 99 76 9 86 13 57 3 M. kansasii 5 2 0 5 1 4 0 M. fortuitum 9 5 3 3 1 5 3 M. chelonae 2 0 0 2 1 1 0 M. xenopi 2 0 0 2 2 0 0 M. simiae 1 1 0 1 0 0 0 M. gordonae 11 4 1 4 1 9 5 M. flavescens 2 1 0 2 1 0 0 Wszystkie pr¹tki 244* 180* 15* 203 27 168 17 *UWAGA: Powy sze dane nie zawieraj¹ nazw czternastu szczepów wykrytych wy³¹cznie za pomoc¹ MGIT. Dokonano identyfikacji wstêpnej bez ostatecznego potwierdzenia. 6

OZNACZANIE METOD SEPTI-CHECK Tabela 3 Wykrywanie szczepów pr¹tków w badaniach klinicznych Izolat izolatów w MGIT Tylko w MGIT za pomoc¹ SEPTI-CHEK Tylko za pomoc¹ SEPTI-CHECK na pod³o ach konwencjonalnych Tylko na pod³o ach konwencjonalnych MTB 30 25 1 29 2 26 0 MAC 34 26 5 28 2 25 0 M. kansasii 1 1 1 0 0 0 0 M. gordonae 2 2 2 0 0 0 0 Wszystkie pr¹tki 67* 54* 9* 57 4 51 0 *UWAGA: Powy sze dane nie zawieraj¹ nazw piêciu szczepów wykrytych wy³¹cznie za pomoc¹ MGIT. Dokonano identyfikacji wstêpnej bez ostatecznego potwierdzenia. DOST PNOŒÆ Nr kat. Opis 245111 Probówki wskaÿnikowe BD BBL MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tubes, 4 ml, opakowanie 25 sztuk. 245113 Probówki wskaÿnikowe BD BBL MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tubes, 4 ml, opakowanie 100 sztuk. 245116 BD BBL MGIT OADC, 15 ml, opakowanie 6 fiolek. Ka da fiolka wystarcza dla 25 probówek MGIT. 220908 BD BBL Lowenstein-Jensen Medium Slants, opakowanie 10 sztuk (20 x 148 mm probówki z nakrêtk¹). 220909 BD BBL Lowenstein-Jensen Medium Slants, opakowanie 100 sztuk (20 x 148 mm probówki z nakrêtk¹). 240862 Zestaw trawi¹co/oczyszczaj¹cy próbki BD BBL MycoPrep, dziesiêæ butelek po 75 ml zawieraj¹cych roztwór NALC-NaOH i 5 opakowañ buforu fosforanowego. 240863 Zestaw trawi¹co/oczyszczaj¹cy próbki BD BBL MycoPrep, dziesiêæ butelek po 150 ml zawieraj¹cych roztwór NALC-NaOH i 10 opakowañ buforu fosforanowego. 245114 Mieszanina antybiotykowa BD BBL MGIT PANTA, liofilizowana, opakowanie 6 fiolek. Ka da fiolka wystarcza dla 25 probówek MGIT. 220959 BD BBL Middlebrook and Cohn 7H10 Agar Slants, opakowanie 100 sztuk. 295939 BD BBL Middlebrook 7H9 bulion, 8 ml, opakowanie 10 probówek. 221818 BD BBL sól fizjologiczna, 5 ml, opakowanie 10 sztuk. 221819 BD BBL sól fizjologiczna, 5 ml, opakowanie 100 sztuk. 231729 BD BBL Taxo Differentiation Discs X, 50 krążków w kasecie. PIŒMIENNICTWO 1. Bloom, B.R., and C.J.L. Murray. 1992. Tuberculosis: commentary on a reemergent killer. Science 257:1055-1064. 2. Horsburg Jr., C.R. 1991. Mycobacterium avium complex infection in the acquired immunodeficiency syndrome. N. Engl. J. Med. 324:1332-1338. 3. Tenover, F.C., et al. 1993. The resurgence of tuberculosis: Is your laboratory ready? J. Clin. Microbiol. 31:767-770. 4. Cohn, M.L., R.F. Waggoner, and J.K. McClatchy. 1968. The 7H11 medium for the cultivation of mycobacteria. Am. Rev. Resp. Dis. 98:295-296. 5. Youmans, G.P. 1979. Cultivation of mycobacteria, the morphology and metabolism of mycobacteria, p. 25-35. Tuberculosis. W.B. Saunders Company, Philadelphia. 6. Kent, P.T., and G.P. Kubica. 1985. Public health mycobacteriology: A guide for the level III laboratory. USDHHS, Centers for Disease Control, Atlanta. 7. Bloodborne pathogens. Code of Federal Regulations, Title 29, Part 1910.1030, Federal Register 1991, 56:64175-64182. 8. Isenberg, Henry D. 1992. Clinical microbiology procedures handbook, vol. 1. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 9. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2004. Approved Standard M22-A3. Quality control for commercially prepared microbiological culture media, 3rd ed., CLSI, Wayne, Pa. Dział Obsługi Technicznej firmy BD Diagnostics: należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielem BD lub odwiedzić stronę www.bd.com/ds. 7

Manufacturer / Производител / Výrobce / Fabrikant / Hersteller / Κατασκευαστής / Fabricante / Tootja / Fabricant / Proizvođać / Gyártó / Fabbricante / Атқарушы / Gamintojas / Ražotājs / Tilvirker / Producent / Producător / Производитель / Výrobca / Proizvođač / Tillverkare / Üretici / Виробник Use by / Използвайте до / Spotřebujte do / Brug før / Verwendbar bis / Χρήση έως / Usar antes de / Kasutada enne / Date de péremption / Upotrijebiti do / Felhasználhatóság dátuma / Usare entro / Дейін пайдалануға / Naudokite iki / Izlietot līdz / Houdbaar tot / Brukes for / Stosować do / Prazo de validade / A se utiliza până la / Использовать до / Použite do / Upotrebiti do / Använd före / Son kullanma tarihi / Використати до\line YYYY-MM-DD / YYYY-MM (MM = end of month) ГГГГ-ММ-ДД / ГГГГ-ММ (ММ = края на месеца) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = konec měsíce) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutning af måned) JJJJ-MM-TT / JJJJ-MM (MM = Monatsende) ΕΕΕΕ-MM-HH / ΕΕΕΕ-MM (MM = τέλος του μήνα) AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fin del mes) AAAA-KK-PP / AAAA-KK (KK = kuu lõpp) AAAA-MM-JJ / AAAA-MM (MM = fin du mois) GGGG-MM-DD / GGGG-MM (MM = kraj mjeseca) ÉÉÉÉ-HH-NN / ÉÉÉÉ-HH (HH = hónap utolsó napja) AAAA-MM-GG / AAAA-MM (MM = fine mese) ЖЖЖЖ-АА-КК / ЖЖЖЖ-АА / (АА = айдың соңы) MMMM-MM-DD / MMMM-MM (MM = mėnesio pabaiga) GGGG-MM-DD/GGGG-MM (MM = mēneša beigas) JJJJ-MM-DD / JJJJ-MM (MM = einde maand) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutten av måneden) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec miesiąca) AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fim do mês) AAAA-LL-ZZ / AAAA-LL (LL = sfârşitul lunii) ГГГГ-ММ-ДД / ГГГГ-ММ (ММ = конец месяца) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec mesiaca) GGGG-MM-DD / GGGG-MM (MM = kraj meseca) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutet av månaden) YYYY-AA-GG / YYYY-AA (AA = ayın sonu) РРРР-MM-ДД / РРРР-MM (MM = кінець місяця) Catalog number / Каталожен номер / Katalogové číslo / Katalognummer / Αριθμός καταλόγου / Número de catálogo / Katalooginumber / Numéro catalogue / Kataloški broj / Katalógusszám / Numero di catalogo / Каталог нөмірі / Katalogo numeris / Kataloga numurs / Catalogus nummer / Numer katalogowy / Număr de catalog / Номер по каталогу / Katalógové číslo / Kataloški broj / Katalog numarası / Номер за каталогом Authorized Representative in the European Community / Оторизиран представител в Европейската общност / Autorizovaný zástupce pro Evropském společenství / Autoriseret repræsentant i De Europæiske Fællesskaber / Autorisierter Vertreter in der Europäischen Gemeinschaft / Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα / Representante autorizado en la Comunidad Europea / Volitatud esindaja Euroopa Nõukogus / Représentant autorisé pour la Communauté européenne / Autorizuirani predstavnik u Europskoj uniji / Meghatalmazott képviselő az Európai Közösségben / Rappresentante autorizzato nella Comunità Europea / Европа қауымдастығындағы уәкілетті өкіл / Įgaliotasis atstovas Europos Bendrijoje / Pilnvarotais pārstāvis Eiropas Kopienā / Bevoegde vertegenwoordiger in de Europese Gemeenschap / Autorisert representant i EU / Autoryzowane przedstawicielstwo we Wspólnocie Europejskiej / Representante autorizado na Comunidade Europeia / Reprezentantul autorizat pentru Comunitatea Europeană / Уполномоченный представитель в Европейском сообществе / Autorizovaný zástupca v Európskom spoločenstve / Autorizovano predstavništvo u Evropskoj uniji / Auktoriserad representant i Europeiska gemenskapen / Avrupa Topluluğu Yetkili Temsilcisi / Уповноважений представник у країнах ЄС In vitro Diagnostic Medical Device / Медицински уред за диагностика ин витро / Lékařské zařízení určené pro diagnostiku in vitro / In vitro diagnostisk medicinsk anordning / Medizinisches In-vitro-Diagnostikum / In vitro διαγνωστική ιατρική συσκευή / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / In vitro diagnostika meditsiiniaparatuur / Dispositif médical de diagnostic in vitro / Medicinska pomagala za In vitro Dijagnostiku / In vitro diagnosztikai orvosi eszköz / Dispositivo medicale per diagnostica in vitro / Жасанды жағдайда жүргізетін медициналық диагностика аспабы / In vitro diagnostikos prietaisas / Medicīnas ierīces, ko lieto in vitro diagnostikā / Medisch hulpmiddel voor in-vitro diagnostiek / In vitro diagnostisk medisinsk utstyr / Urządzenie medyczne do diagnostyki in vitro / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / Dispozitiv medical pentru diagnostic in vitro / Медицинский прибор для диагностики in vitro / Medicínska pomôcka na diagnostiku in vitro / Medicinski uređaj za in vitro dijagnostiku / Medicinteknisk produkt för in vitro-diagnostik / İn Vitro Diyagnostik Tıbbi Cihaz / Медичний пристрій для діагностики in vitro Temperature limitation / Температурни ограничения / Teplotní omezení / Temperaturbegrænsning / Temperaturbegrenzung / Περιορισμοί θερμοκρασίας / Limitación de temperatura / Temperatuuri piirang / Limites de température / Dozvoljena temperatura / Hőmérsékleti határ / Limiti di temperatura / Температураны шектеу / Laikymo temperatūra / Temperatūras ierobežojumi / Temperatuurlimiet / Temperaturbegrensning / Ograniczenie temperatury / Limites de temperatura / Limite de temperatură / Ограничение температуры / Ohraničenie teploty / Ograničenje temperature / Temperaturgräns / Sıcaklık sınırlaması / Обмеження температури Batch Code (Lot) / Код на партидата / Kód (číslo) šarže / Batch-kode (lot) / Batch-Code (Charge) / Κωδικός παρτίδας (παρτίδα) / Código de lote (lote) / Partii kood / Numéro de lot / Lot (kod) / Tétel száma (Lot) / Codice batch (lotto) / Топтама коды / Partijos numeris (LOT) / Partijas kods (laidiens) / Lot nummer / Batch-kode (parti) / Kod partii (seria) / Código do lote / Cod de serie (Lot) / Код партии (лот) / Kód série (šarža) / Kod serije / Partinummer (Lot) / Parti Kodu (Lot) / Код партії Consult Instructions for Use / Направете справка в инструкциите за употреба / Prostudujte pokyny k použití / Se brugsanvisningen / Gebrauchsanweisung beachten / Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / Consultar las instrucciones de uso / Lugeda kasutusjuhendit / Consulter la notice d emploi / Koristi upute za upotrebu / Olvassa el a használati utasítást / Consultare le istruzioni per l uso / Пайдалану нұсқаулығымен танысып алыңыз / Skaitykite naudojimo instrukcijas / Skatīt lietošanas pamācību / Raadpleeg de gebruiksaanwijzing / Se i bruksanvisningen / Zobacz instrukcja użytkowania / Consultar as instruções de utilização / Consultaţi instrucţiunile de utilizare / См. руководство по эксплуатации / Pozri Pokyny na používanie / Pogledajte uputstvo za upotrebu / Se bruksanvisningen / Kullanım Talimatları na başvurun / Див. інструкції з використання Do not reuse / Не използвайте отново / Nepoužívejte opakovaně / Ikke til genbrug / Nicht wiederverwenden / Μην επαναχρησιμοποιείτε / No reutilizar / Mitte kasutada korduvalt / Ne pas réutiliser / Ne koristiti ponovo / Egyszer használatos / Non riutilizzare / Пайдаланбаңыз / Tik vienkartiniam naudojimui / Nelietot atkārtoti / Niet opnieuw gebruiken / Kun til engangsbruk / Nie stosować powtórnie / Não reutilize / Nu refolosiţi / Не использовать повторно / Nepoužívajte opakovane / Ne upotrebljavajte ponovo / Får ej återanvändas / Tekrar kullanmayın / Не використовувати повторно Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, MD 21152 USA Benex Limited Pottery Road, Dun Loaghaire Co. Dublin, Ireland ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company. 2015 BD 8