Nisza jako mikrośrodowisko komórek pozostające z nimi w stanie ciągłej wymiany informacji P1 1 1 2 Mediatory wymiany informacji między komórką a niszą : - czynniki humoralne (np. czynniki wzrostowe i cytokiny oddziaływania krynne S P2 2 - adhezja komórkowa (ścieżki sygnałowe zależne od integryn, kadheryn etc. Wnts Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: 167-174 P3 3 3 - wymiana bodźców mechanicznych (za pośrednictwem białek adhezji międzykomórkowej i receptorów ECM) -bezpośrednia wymiana metabolitów (złącza szczelinowe) 1
Nisza jako mikrośrodowisko komórek pozostające z nimi w stanie ciągłej wymiany informacji P1 1 1 2 Mediatory wymiany informacji między komórką a niszą : - czynniki humoralne (np. czynniki wzrostowe i cytokiny oddziaływania krynne S P2 2 - adhezja komórkowa (ścieżki sygnałowe zależne od integryn, kadheryn etc. Wnts P3 3 3 - wymiana bodźców mechanicznych (za pośrednictwem białek adhezji międzykomórkowej i receptorów ECM) -bezpośrednia wymiana metabolitów Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: 167-174 2
Mediatory bezposredniej międzykomórkowej wymiany metabolitów Plasmodesmy Złącza szczelinowe Nanotuby (Gallagher and Benfey, 2006) Rośliny (www.molecular.biosciences.wsu.edu) Zwierzęta Rustom et al., 2004 3
Plazmodezmy w tkankach roślinnych - tworzą międzykomórkowe mostki obudowane ciągłą błoną komórkową łączące domeny cytoplazmatyczne sąsiednich komórek - stanowią pozostałość podziału komórki roślinnej, lub tworzone są de novo - plazmodezmy penetrowane są przez cysterny retikulum endpolazmatycznego (tzw. desmotubule ) oraz cytoszkielet aktynowy i mikrotubule Maule, Curr. Op. Plant Biol.,2008, 11:680 Plazmodezmy pośredniczą w czynnym i biernym transferze cząsteczek między sąsiednimi komórkami 4
Struktury nanotubularne jako analogi roślinnych plazmodezm w tkankach zwierzęcych Not just another hole in the wall: understanding intercellular protein trafficking (Genes Dev. 2006) Kimberly L. Gallagher and Philip N. Benfey Department of Biology, Duke University, Durham, North Carolina, USA Cutting Edge: Membrane Nanotubes Connect Immune Cells (J. Immunol. 2004) Björn Önfelt, Shlomo Nedvetzki, Kumiko Yanagi and Daniel M. Davis Department of Biological Sciences, Imperial College, London, United Kingdom Nanotubular Highways for Intercellular Organelle Transport (Science 2004) Amin Rustom, 1 Rainer Saffrich, 2 Ivanka Markovic, 3 Paul Walther, 4 Hans-Hermann Gerdes, 5 1 Interdisciplinary Center of Neuroscience, Institute of Neurobiology, University of Heidelberg, Germany 2 Otto-Meyerhoff-Zentrum, University of Heidelberg, Germany 3 Institute of Biochemistry, Faculty of Medicine, University of Belgrade, Yugoslavia 4 Electron Microscopy Facility, University of Ulm, Germany 5 Institute for Biochemistry and Molecular Biology, University of Bergen, Norway 16 5
Analizy struktur nanotubularnych przy użyciu mikroskopii elektronowej i fluorescencyjnej Komórki szczurzej linii pheochromocytoma (PC12) wykazują obecność wydłużonych wypustek łączących sąsiednie komórki. 6
Nanotuby (ang. tubular nanotubes) w układzie immunologicznym Struktury nanotubularne formowane między ludzkimi limfocytami B transformowanymi wirusem Epstein-Barra (GFP). Struktury nanotubularne między monocytami/makrofagami obwodowej krwi ludzkiej 7
Formowanie nanotub (TNTs) mechanizm (I) Stadia formowania nanotub między komórkami PC12 [(B) strzałka, (D) nanotuba]. Nanotuby mogą być tworzone de novo dzięki aktywności filopodiów tworzących mostki międzykomórkowe 8
Formowanie nanotub (TNTs) mechanizm (II) Nanotuby jako pozostałość po synapsie immunologicznej między komórkami NK a komórką 721.221 Nanotuby jako pozostałość po bezpośrednim kontakcie między komórkami 721.221 Nanotuby mogą stanowić pozostałość ścisłych kontaktów międzykomórkowych 9
Sieć nanotubularna Komórki linii PC12 formują wielokomórkowe struktury nanotubularne Trzy komórki linii monocytarnej (J774) tworzące sieć nanotubularną Wniosek: Nanotuby nie ograniczają się do łączenia par komórek, lecz mogą tworzyć układy wielokomórkowe 10
Struktury nanotubularne uczestniczą w międzykomórkowej wymianie organelli Zgrubienia podróżujące wzdłuż nanotuby łączącej dwa makrofagi linii J774 Struktury wybarwione barwnikiem znakującym organelle o ph kwaśnym czyli np. lizosomy (Lyso-Tracker) poruszają się w nanotubie łączącej dwie komórki. międzykomórkowa wymiana lizosomów 11
W jaki sposób odbywa się transport wzdłuż nanotub? Obecność aktyny w nanotubach utworzonych między komórkami PC12: - α-tubulina- zielony, - F-aktyna - czerwony, - DNA - niebieski C synaptofizyna, marker wczesnych endosomów zielony; F-aktyna - czerwony D miozyna Va zielony; F-aktyna - czerwony E - synaptofizyna zielony; miozyna Va czerwony, F-aktyna - niebieski) Wniosek: Częściowa kolokalizacja synaptofizyny i miozyny Va w połączeniu z obecnością F-aktyny w nanotubach sugeruje mechanizm transportu nanotubularnego zależny od aktyny 12
Mechanizmy międzykomórkowego transportu organelli za pośrednictwem struktur nanotubularnych Komórki linii PC12 cells wybarwione DiI Jednokierunkowy transport organelli wyznakowanych DiI Transfer organelli zachodzi w temperaturze bliskiej 0 C, która blokuje exo-, endo- i fagocytozę Zaangażowanie aktomiozyny... 13
Nisza jako mikrośrodowisko komórek pozostające z nimi w stanie ciągłej wymiany informacji P1 1 1 2 Mediatory wymiany informacji między komórką a niszą : - czynniki humoralne (np. czynniki wzrostowe i cytokiny oddziaływania krynne S P2 2 - adhezja komórkowa (ścieżki sygnałowe zależne od integryn, kadheryn etc. Wnts P3 3 3 - wymiana bodźców mechanicznych (za pośrednictwem białek adhezji międzykomórkowej i receptorów ECM) -bezpośrednia wymiana metabolitów 14
Istnieją mocne poszlaki przemawiające za tym, że struktury nanotubularne mogą uczestniczyć w komunikacji międzykomórkowej w sposób komplementarny do innych systemów Niewiele jednak nie wiemy na temat funkcji nanotub w fizjologii organizmów wielokomórkowych 15
Wniosek: Przedstawione wyniki wskazują, że komunikacja międzykomórkowa oparta na ciągłości błon występuje nie tylko w organizmach roślinnych Komunikacja międzykomórkowa Plasmodesmy Złącza szczelinowe Nanotuby (Gallagher and Benfey, 2006) Rośliny (www.molecular.biosciences.wsu.edu) Zwierzęta Rustom et al., 2004 Złącza szczelinowe 9 16
Komunikacja międzykomórkowa za pośrednictwem złącz szczelinowych Plasmodesmy Złącza szczelinowe Nanotuby (Gallagher and Benfey, 2006) Rośliny (www.molecular.biosciences.wsu.edu) Zwierzęta Rustom et al., 2004 17
Złącza szczelinowe umożliwiają bierny międzykomórkowy transfer jonów i drobnocząsteczkowych metabolitów a to odróżnia je od plazmodezm i nanotub...które do międzykomórkowego transportu metabolitów wykorzystują retikulum endoplazmatyczne, i system aktomiozynowy Gerdes@Carcalho, 2008 18
Złącza szczelinowe to konserwatywne struktury, dzięki którym komórki komunikują się ze sobą metabolicznie i elektrycznie Miejsca ścisłego kontaktu pomiędzy dwoma komórkami, w obrębie którego przerwa ( gap ) między błonami wynosi około 2-3 nm (Benedetti, 1965) 19
Odrobina historii badań nad złączami szczelinowymi u kręgowców 1. Weidmann (1952): szybkość rozchodzenia się potencjałów czynnościowych w miokardium przekracza wartości oczekiwane (sugestia istnienia międzykomórkowej ścieżki o niskim oporze elektrycznym) 2. Odkrycie transmisji sygnałów elektrycznych w synapsach neuronów motorycznych kałamarnicy (Furshpan and Potter; 1959) 3. Synapsa elektryczna (Robertson 1963) 4. Revel & Karnowsky; 1967; termin gap junction. Zdominował on inne nazwy, w tym nexus i macula communicans 5. Identyfikacja miejsc ścisłego kontaktu pomiędzy dwoma komórkami, w obrębie którego przerwa ( gap ) między błonami wynosi około 2-3 nm (Benedetti, 1965) 6. Koneksyna (Cx32; wątroba; 1986) 7. Przepuszczalność kanałów złącz 8. Selektywność kanałów złącz 235. Badania z wykorzystaniem AFM potwierdziły ścisłe upakowanie kanałów w układzie heksagonalnym (Hoh et al., 1993) Saez et al., 2003 117..9. Ruchliwość komórek nowotworowych 20 a intensywność GJIC (Daniel et al., 2008)
Złącza szczelinowe i koneksony - budowa Jednostka strukturalna - koneksyna Koneksyny stanowią dużą konserwatywną rodzinę (wykazują homologię pod względem sekwencji aminokwasowej w 60%). Geny kodujące różne rodzaje koneksyn znajdują się na kilku chromosomach W jej skład wchodzi przynajmniej 20 konserwatywnych ewolucyjnie rodzajów białek, które zaklasyfikowano do różnych grup i nazwano według ich mas cząsteczkowych ( 26 60 kda) Białka te w środowisku lipidowym spontanicznie formują heksamery (koneksony) W jednej komórce możliwa jest ekspresja kilku różnych rodzajów koneksyn, również w obrębie jednego koneksonu mogą występować różne koneksyny Koneksyny obecne są u kręgowców. U bezkręgowców występują ineksyny 21
E1 1 2 Budowa i funkcje złącz NH 3 + szczelinowych - tworzenie kanałów łączących przedziały cytoplazmatyczne sąsiednich komórek E2 3 4 COO _ - międzykomórkowa bierna wymiana dobnocząsteczkowych metabolitów o masie poniżej 1.5 kda Konekson (Eckert &Huelser, zmienione) 22 22 Kanały łączące przedziały cytoplazmatyczne sąsiednich komórek
Ineksyny Ineksyny w komórkach stułbi (Hydra sp.) zwizualizowane przy pomocy GFP Bauer et al., 2004 - Budują złącza szczelinowe między komórkami bezkręgowców (INvertebrate conexins) - Brak homologii sekwencji aminokwasowej z koneksynami - Bardzo podobna budowa kanałów zb. z ineksyn i koneksyn oraz podobne ich właściwości Ineksyny stanowią rodzinę białek budujących międzykomórkowe kanały białkowe łączące przedziały cytoplazmatyczne sąsiednich komórek, która jest ewolucyjnie starsza 23 niż rodzina koneksyn
Paneksyny Erytrocyty Prostata Oocyty - tworzą heksamery analogiczne do koneksonów - występują m.in. w komórkach krwi Funkcja: - uczestniczą one m. in. w sekrecji ATP - tworzą kanały błonowe łączące cytoplazmę z otoczeniem komórki, a nie z jej sąsiadem Dahl et al., 2006 Locovei et al., 2006 24
Tkankowo-specyficzne funkcje złącz szczelinowych Sprzężenie elektryczne; np. w miokardium, układzie nerwowym i innych tkankach pobudliwych Serce Koneksyna Cx40 Cx43 Cx45 Funkcja - międzykomórkowy transfer jonów wapnia -synchronizacja aktywności skurczowej kardiomiocytów Układ nerwowy Cx32 Cx37 Cx43 - przewodnictwo nerwowe - wewnątrzcytoplazmatyczny transfer metabolitów w komórkach Schwanna Sprzężenie metaboliczne; np. wątroba i inne tkanki niepobudliwe Np. wątroba i trzustka Cx32 Cx36 - synchronizacja wydzielania insuliny przez komórki b trzustki - synchronizacja sekrecji glukozy przez hepatocyty 25
Czynniki determinujące funkcje złącz szczelinowych: - poziom I zależny od typu i lokalizacji koneksyny w danej komórce - poziom ekspresji danej koneksyny - transport do błony i wewnątrzkomórkowa lokalizacja koneksyn - typ koneksyny budującej złącze i kompatybilność koneksonów zbudowanych z różnych koneksyn - selektywność kanałów złącz szczelinowych - poziom II zależny od zewnętrznych regulatorów funkcji złącz szczelinowych - regulatory przepuszczalności kanałów złącz szczelinowych np. ph, stężenie wewnątrzkomórkowego wapnia - aktywność szlaków sygnałowych determinujących przepuszczalność kanałów poprzez zmiany poziomu fosforylacji koneksyn -stabilizacja złącz przez białka adhezji międzykomórkowej - stabilizacja mechaniczna 26
tensin talin a-actinin vinculin Szlak zależny od Wnt reguluje ekspresję koneksyn Nucleus Cadherins GJs p120ctn b-catenin a-actinin a-catenin g-catenin vinculin b-catenin LEF b-catenin DNA TCF Wnt responsive gene expression LEF b-catenin TCF b-catenin b-catenin GSK3b APC Axin Dsh paxillin Integrin frizzled ECM Wnt-1 27
Obrót koneksyn Saez et al., 2003 28
Kompleksy białkowe towarzyszące złączom szczelinowym Winkulina Mikrotubule kateniny N-kadheryna Szlak Wnt Wei et al., 2004 Białka związane z kompleksem powierzchniowym decydują zarówno o ekspresji, jak i o funkcji złącz szczelinowych 29
Schematyczny diagram opisujący system sarkomeryczny w komórkach mięśnia sercowego (kardiomiocytach) Złącza szczelinowe Kontakty międzykomórkowe zależne od kadheryn Trends in Cell Biology, 2005 Oddziaływania komórka-macierz zewnątrzkomórkowa za pośrednictwem integryn 30 30
Podsumowanie: wewnątrzkomórkowy transport koneksyn Laird 2006 Tylko koneksony zakotwiczone w błonie komórkowej mają szanse zbudować funkcjonalne złącza szczelinowe - Równowaga między transportem do- i od- membranowym koneksyn decyduje o liczbie czynnych złącz szczelinowych, a tym samym o intensywności komunikacji 31 międzykomórkowej za ich pośrednictwem
Kompleksy białkowe związane z kompleksem powierzchniowym decydują o intensywności komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych poprzez wpływ na ekspresję koneksyn, wewnątrzkomórkową lokalizację i obrót koneksonów Kompleksy białkowe towarzyszące złączom szczelinowym Winkulina Wzajemne proporcje między szybkością do-membranowego transportu koneksyn z miejsc ich syntezy i wydajnością internalizacji koneksonów i ich degradacji decydują o obfitości złącz szczelinowych w plazmalemmach sąsiadujących ze sobą komórek To z kolei musi mieć przełożenie na intensywność międzykomórkowej wymiany metabolitów Mikrotubule kateniny N-kadheryna Szlak Wnt Wei et al., 2004 Białka związane z kompleksem powierzchniowym decydują zarówno o ekspresji, jak i o funkcji złącz szczelinowych 11 Saez et al., 2003 szlaki sygnałowe zaangażowane w regulację ekspresji koneksyn 6 32
Budowa złącz szczelinowych NH 3 + E1 1 2 Cx26 Cx36 Cx43 Cx45 3 E2 4 COO _ Huelser&Eckert Konekson 33
Selektywność złącz szczelinowych zbudowanych z Cx32 Goldberg et al., 2002 Wniosek: złącza szczelinowe zbudowane z Cx32 wykazują selektywną przepuszczalność dla cząsteczek o ładunku dodatnim 34
Selektywność złącz szczelinowych Znakowanie komórek DiI/glukozą C 14 kohodowla sortowanie komórek (FACS) analiza ilości C 14 w komórkach donorowych (D) i akceptorowych (R; HPLC) 35
Selektywność złącz szczelinowych Goldberg et al., 2002 36
Drzewo filogenetyczne koneksyn 1 NH 3 + g-80-100 aminokwasów w pętli cytoplazmatycznej E1 2 3 a-50-55 aminokwasów w pętli cytoplazmatycznej E2 4 COO _ b-30-35 aminokwasów w pętli cytoplazmatycznej Saez et al., 2003 37
Budowa złącz szczelinowych NH 3 + E1 1 2 Cx26 Cx36 Cx43 Cx45 3 E2 4 COO _ Huelser&Eckert Konekson 38
Kompatybilność koneksonów bcx32 bcx26 Barrio, 92 Swenson, 89 acx37 Elgang, 1995 Cx50 Elfgang,95 Hennemann, 92 bcx31 Elgang, 1995 acx45 White, 1994 acx40 Bruzzone, 93 Elgang, 1995 acx43 38 Obecność kompatybilnych izoform koneksyn decyduje o intensywności komunikacji za pośrednictwem złącz szczelinowych między sąsiednimi komórkami 39
Ekspresja różnych izoform koneksyn w komórkach sugeruje rolę interakcji między nimi w determinowaniu funkcji koneksonów i złącz szczelinowych homomeryczne heteromeryczne - ze względu na budowę koneksonów -ze względu na budowę kanałów homotypowe heterotypowe heterotypowe-heteromeryczne 40
Konkluzja Złącza szczelinowe stanowią (wbrew pozorom) selektywny system międzykomórkowej wymiany informacji 41
Skład koneksonów decyduje o funkcji złącz jako specyficznych mediatorów międzykomórkowej wymiany informacji Laird, 2007 Złącza szczelinowe wykazują selektywność dla cząsteczek, która zależy od składu koneksonów 42
Czynniki determinujące funkcje złącz szczelinowych: - poziom I zależny od typu i lokalizacji koneksyny w danej komórce - typ koneksyny budującej złącze i kompatybilność koneksonów zbudowanych z różnych koneksyn - selektywność kanałów złącz szczelinowych - poziom ekspresji danej koneksyny - transport do błony i wewnątrzkomórkowa lokalizacja koneksyn - poziom II zależny od zewnętrznych regulatorów funkcji złącz szczelinowych - regulatory przepuszczalności kanałów złącz szczelinowych np. ph, stężenie wewnątrzkomórkowego wapnia - aktywność szlaków sygnałowych determinujących przepuszczalność kanałów poprzez zmiany poziomu fosforylacji koneksyn -stabilizacja złącz przez białka adhezji międzykomórkowej - stabilizacja mechaniczna 43
Zmiany stężenia jonów wpływają na przepuszczalność kanałów złącz szczelinowych Niskie Ca ++ Wysokie Ca ++ Sens ochrona komórek przed szokiem wapniowym wynikającym z napływu jonów wapnia do uszkodzonej sąsiedniej komórki Właściwość ta służy utrzymaniu homeostazy wapniowej w tkankach 44
Szlaki sygnałowe warunkujące bramkowanie kanałów złącz szczelinowych closed Kniga p. 47 Różnorodne szlaki sygnałowe wpływają na intensywność komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych w sposób 45 zależny od przewodnictwa kanałów
NH 3 + E1 E2 Regulacja funkcji złącz szczelinowych - fosforylacja koneksyn COO _ Domeny: - wewnątrz-membranowe a-helisy konserwatywne - domeny zewnątrzkomórkowe - konserwatywne - N-końcowy łańcuch wewnątrzkomórkowy konserwatywny - domena wewnątrzkomórkowa zmienna - C-końcowy łańcuch wewnątrzkomórkowy wysoce zmienny Giepmans et al., 2004 46
Kategorie składników kompleksu powierzchniowego regulujących funkcje złącz szczelinowych 1. Białka sygnałowe 2. Białka strukturalne Laird, 2005 47
Funkcja Niszy czyli mikrośrodowiska komórek w transformacji nowotworowej Mediatory wymiany informacji między komórką a niszą wspomagające transformację nowotworową: Neo - zaburzenia funkcji endo- i egzogennych czynników humoralnych oddziaływania krynne - modyfikacje składu macierzy międzykomórkowej oraz ekspresji receptorów adhezji komórkowej, np. integryn i kadheryn - zmiany równowagi mechanochemicznej w obrębie niszy, prowadzące do zaburzeń wymiany bodźców mechanicznych między komórka a jej mikrośrodowiskiem Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: 167-174 -deregulacja bezpośredniej wymiany metabolitów za pośrednictwem złącz szczelinowych 48